荧光素酶

摘要： 在肿瘤研究中,以小鼠和斑马鱼为主的动物模型实验作为介于体外细胞实验和临床试验之间重要的中间环节,往往很受青睐。近年来,挑选一些在肿瘤细胞进程中有特殊活性的启动子,构建这类启动子调控的荧光素酶报告基因,或者将荧光素酶基因的cDNA插入到肿瘤特异性表达的基因调控序列中,建立转基因小鼠和斑马鱼动物模型,随后通过生物发光成像技术(BLI),可以在活体动物模型中实现肿瘤细胞进程的可视化研究,包括对肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和免疫反应的实时监控。现综述利用BLI技术和活体动物成像模型在实现肿瘤细胞进程的可视化和确定肿瘤早期发展阶段方面的研究进展,及其用于不同组织器官间活动和肿瘤治疗方面的发展和应用。

摘要： 目的:利用分子克隆的方法构建转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定其效应。方法:以乳腺癌MCF7细胞基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增STAT5A基因的启动子序列,并将其克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL3-Enhancer中,经过菌液扩增、酶切、测序等方法获得目的质粒,并通过双荧光报告基因实验进一步验证其功能。结果:构建的STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-STAT5A-pro-luc-E序列正确,且具有转录活性。在双荧光报告基因实验中发现重组载体pGL3-STAT5A-pro-luc-E荧光素酶的相对活性约为阴性对照pGL3-Enhancer的8倍(P<0.01),而pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E荧光素酶的相对活性约是阴性对照pGL3-Enhancer的6倍(P<0.01)。结论:本项目成功构建了转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒,为进一步研究STAT信号转导及转录激活蛋白信号通路提供了重要的研究工具。

摘要： 乳腺癌具有高转移率。使用小动物活体成像技术对乳腺癌的生长及转移情况实时监测定量分析可以帮助了解疾病机制及进行药物研究。二维成像对光学信号的定位与定量是相对的。随着计算机技术的进步,可以实现对采集的图像进行三维重建,精准量化光学信号,获得空间分布的三维信息。IVIS Spectrum小动物活体光学三维成像系统同时具有高灵敏的生物发光、荧光、切伦科夫辐射二维成像及三维扫描重建功能,是小动物活体光学成像的顶级系统。本文对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)进行慢病毒感染,在体外稳定表达荧光素酶后,选取重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠进行原位乳腺癌模型的建立,通过IVIS Spectrum小动物活体光学三维成像系统对小鼠进行生物发光二维成像,无创观测肿瘤的生长及转移情况。本文的创新点是利用生物发光成像断层扫描技术对小鼠模型进行定量三维成像,使用系统自带的算法直接进行三维重建,同时结合鲸鱼优化算法(WOA)优化后的三维卷积的深度编码器-解码器的网络模型进行重建。通过CT图像验证两者的重建效果,得到肿瘤的深度信息,实现对乳腺癌的精准定量分析。

摘要： 目的探讨慢病毒Luciference标记小鼠胰岛并研究其在体外和裸鼠体内移植后的荧光表达。方法以感染复数10 MOI的慢病毒-LUC胰岛培养液转染培养后的ICR小鼠胰岛,洗涤后再培养24 h后,使用小动物活体光学成像系统观察不同胰岛当量LUC标记后的胰岛在体外的荧光表达量,及在体外培养14 d内的荧光表达。在裸鼠肾被膜下移植后,观察30 d内的体内荧光表达情况。结果经本方法转染LUC基因后的胰岛细胞团活性为(86.7±6.7)%;在小动物活体成像仪中,体外培养的LUC标记胰岛可见有荧光表达,且表达量与胰岛当量有关;体外培养14 d内的荧光表达强度呈现与时间同步增强的趋势;LUC标记胰岛经裸鼠肾被膜下移植后可见荧光长期表达(>30 d),但表达的强度随时间变化有较大差异。结论本研究LUC标记的胰岛可实现在活体状态下长期观察移植至体内胰岛的存活情况,可为后续研究胰岛在移植部位的存活和功效提供一定参考。

摘要： 目的 探讨17β-雌二醇对人成骨肉瘤细胞CLCF1基因表达的影响.方法 将骨肉瘤细胞MG-63分为对照组、β-雌二醇低、中、高剂量组,对照组加入10-3mol/L DMSO,将17β-雌二醇用DMSO稀释后,分别加入β-雌二醇低、中、高剂量组,终浓度分别为10-10、10-9、10-8 mol/L,干预MG-63细胞24、48、72 h后,实时荧光定量PCR检测各组MG-63细胞中CLCF1 mRNA的表达情况;构建CLCF1基因启动子荧光素酶报告基因载体,采用10-8 mol/L 17β-雌二醇及雌激素受体抑制剂氟维司群(ICI)干预MG63细胞24 h后,双荧光素酶报告基因系统检测双荧光素酶活性.结果 ①干预24 h,β-雌二醇低、中、高剂量组CLCF1 mRNA的表达均高于对照组,差异有统计学意义(0.05);②与对照组相比,17β-雌二醇高剂量组荧光素酶活性提高,差异有统计学意义(<0.05);加入雌激素受体抑制剂ICI后,荧光素酶活性较对照组降低,差异有统计学意义(<0.05).结论 17β-雌二醇可通过提高CLCF1启动子活性促进MG63细胞株CLCF1基因的表达,这可能是绝经后骨质疏松症肾阴虚证的分子机制之一.

摘要： 目的 构建Rb荧光素酶报告基因检测系统并检测Rb基因的活化和抑制水平,为多种肿瘤的靶向治疗药物筛选提供实验基础.方法 通过双酶切将人工合成的Rb反应原件基因序列连接到报告基因载体pGL6-TA的多克隆位点区,并转化E.coli DH5α感受态细胞构建载体pGL6-Rb-Luc.将基因测序序列正确的pGL6-Rb-Luc质粒和对照pGL6-TA质粒分别转染人肾上皮细胞系HEK293,通过抗性基因筛选,可获得稳定表达Rb荧光素酶报告基因的HEK293-Rb-Luc单克隆细胞株和对照细胞株,再分别通过血清刺激和CDK4/6抑制剂Palbociclib来检测报告基因检测系统HEK293-Rb-Luc的激活作用以及抑制作用.结果 分析载体的测序结果并进行比对,确定构建的载体pGL6-Rb-Luc中Rb反应元件基因序列已正确插入载体多克隆位点区.HEK293-Rb-Luc细胞株经无血清培养同步后,恢复血清培养6、12、24 h细胞中荧光素酶的活性均显著升高(P<0.001),对照细胞未发生显著变化.相比于0 nmol/L Palbociclib组,25、50、75、100 nmol/L的CDK4/6抑制剂Palbociclib使Rb活性的抑制率分别达6.90％、40.23％、50.57％、52.07％(P<0.05).结论 已成功构建并筛选出Rb荧光素酶报告基因检测系统HEK293-Rb-Luc且能够有效地检测Rb的活化水平.

摘要： 荧光素酶反应体系是利用ATP生物荧光法检测喷气燃料微生物污染的关键.为了获得最佳的酶反应体系,本研究以ATP标准物质为研究对象,考察了荧光素酶、荧光素和Mg2+的最佳使用量.结果表明:荧光素酶、荧光素和Mg2+的最佳使用量依次为0.05 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和5 mmol·L-1.通过考察Mg2+与ATP相互作用对荧光反应的影响发现,ATP在与荧光素酶之前预先与Mg2+结合,可以提高荧光反应的效率,使相对发光强度有所增加.相比于传统的培养法和HY-LITE JET A1燃料试验,优化的荧光素酶-荧光素反应体系提高了检测效率、大幅度降低了检测成本.

摘要： 目的 观察DNA损伤修复蛋白——锌指蛋白146(RNF146)下调对荧光素酶稳转胶质瘤细胞株GL261-luc活性的影响.方法 通过干涉慢病毒感染的方法,下调荧光素酶稳转胶质瘤细胞株GL261-luc中RNF146的表达,经实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blot检测GL261-luc细胞中RNF146的敲减效率.Western blot检测RNF146下调后GL261-luc细胞中荧光素酶蛋白的表达水平.比较第1代、第15代和第30代GL261-luc细胞中荧光素酶活性.结果 RNF146干涉慢病毒感染能够下调GL261-luc细胞中RNF146基因表达约为85.7％(P0.05).结论 用慢病毒感染下调GL261-luc细胞RNF146表达,不影响荧光素酶的表达、活性及稳定性,能够用于后续小动物体内成瘤后的活体成像研究.

摘要： 目的:建立稳定表达荧光素酶的人胃癌细胞系(BGC823),为建立活体成像的人胃癌裸鼠移植瘤模型及治疗研究奠定基础.方法:含绿色荧光蛋白(GFP)及荧光素酶的质粒用脂质体转染法稳转到胃癌细胞BGC823中.不同浓度的嘌呤霉素用于筛选细胞,单克隆细胞用有限稀释法挑选,用流式细胞仪检验构建的BGC823-FLuc细胞的纯度.细胞的荧光素酶表达量用荧光素酶底物试剂检测.MTS比较改造前后BGC823细胞的增殖.结果:流式检测显示单克隆细胞系阳性率达到99.9％,且多功能酶标仪检测到荧光信号值.MTS法检测发现改造前后细胞增殖基本一致,说明加入荧光素酶基因未对细胞增殖产生明显影响.结论:表达荧光素酶及绿色荧光蛋白的单克隆胃癌细胞系构建成功.此细胞系具有可用于体外及体内实验以研究肿瘤模型的优势的.

摘要： 为建立一种能够实现病毒活体示踪的狂犬病病毒(RABV),以有效地研究RABV的侵染机制,本研究基于重组RABV rERA载体,利用反向遗传技术构建了包含rERA全长基因组cDNA及萤火虫荧光素酶(Luc)基因的重组质粒,并经Pme Ⅰ酶切鉴定正确后,将该质粒与辅助质粒共转染鼠肾成纤维细胞(BSR),4 d后收集上清液,在BSR细胞盲传3代后收集上清液,经RT-PCR扩增结果显示,获得了 Luc基因的目的条带;间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果显示,上清液接种的细胞出现绿色荧光;将上清液中的重组病毒纯化后电镜观察结果显示重组病毒与亲本病毒均呈弹头状,Western blot结果显示纯化后重组病毒感染BSR细胞后均能够表达RABV 5种结构蛋白,与亲本病毒蛋白表达情况一致,上述结果表明获得了与亲本病毒性状一致的重组病毒,命名为rERA-Luc.将重组病毒在BSR细胞中连续传15代,每代均经PT-PCR及测序鉴定,并经IFA测定每代重组病毒的病毒滴度,分析重组病毒增殖稳定性;测定各代次重组病毒感染BSR细胞48 h后的荧光素酶活性,分析其遗传稳定性.各代次重组病毒的RT-PCR及测序结果显示,Luc基因均未发生突变;IFA结果显示,F5代及以后代次的重组病毒与亲本病毒在体外的病毒滴度无显著差异并能稳定传至15代;荧光素酶活性测定结果显示,重组病毒荧光素酶活性随传代次数的增加逐渐升高且从第5代以后的重组病毒均能够稳定表达荧光素酶,而亲本病毒荧光素酶活性一直维持较低水平,表明重组病毒具有较强的增殖及遗传稳定性.将重组病毒与亲本病毒分别感染BSR细胞和小鼠神经瘤细胞(NA),感染后不同时间(24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h),分别经IFA测定两种病毒的病毒滴度,绘制生长曲线,并测定二者的荧光素酶活性.结果显示,重组病毒与亲本病毒在这两种细胞中的生长特性均无显著差异;且rERA-Luc的荧光素酶活性均随感染时间的延长而逐渐升高,且均在感染后96 h达到峰值,而rERA荧光素酶活性则均较低,表明Luc基因的插入不影响重组病毒的生长特性及嗜神经性.将重组病毒和亲本病毒均以104 ffu/只的剂量分别经肌肉注射(i.m.)和颅内接种(i.c.)6周龄BALB/c SPF级小鼠,同时设置这两种途径接种的PBS对照组,分别记录小鼠的体质量(i.m.组)和观察小鼠的临床症状(i.c.组).结果显示,重组病毒i.m.组小鼠与亲本病毒i.m.组小鼠的体质量变化一致,重组病毒i.c.组小鼠的临床症状以及生存率与亲本病毒i.c.组小鼠无显著差异,而对照组小鼠均无临床症状,结果表明Luc基因的插入不影响亲本病毒的致病力.本研究构建的重组病毒rERA-Luc为研究RABV的致病机制奠定了基础.

摘要： 目的：为检测环境中可能存在的致癌物,建立生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(GADD45α)双荧光素报告基因系统,构建新型人GADD45α荧光素酶报告基因质粒. 方法：在GADD45α基因启动子序列2.2kb及其后基因组DNA序列2.6kb范围内,设计3对引物进行搭桥PCR,获得全长为4924bp的目的序列,插入pGL4.10[luc2]质粒相应位点内.质粒构建成功后测定全长并进行酶切鉴定. 结果：正确扩增了全长为4.9kb的人GADD45α基因片段,成功构建了人GADD45α报告基因质粒(pGD2.2K-luc2). 结论：在质粒设计中加入了存在p53非依赖性非依赖性的乳腺癌易感基因(BRCA1)结合位点的GADD45α基因第1个内含子,构建成功的pGD2.2K-luc2,为转染人源性细胞建立GADD45α双荧光素报告基因系统打下了基础.下一步计划将此质粒转染人源性细胞，评估其实用性及能否用于大规模毒物的检测。

摘要： 目的：构建人表面活性物质蛋白-B(SP-B)基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒,并分析其在H441细胞中的转录活性。方法：以人基因组DNA为模板,PCR扩增SP-B启动子(-218/+435bp)序列片段,构建重组质粒，进行酶切及测序鉴定。结果：细胞裂解液双荧光素酶活性间接反映启动子活性，pGL3-basic/pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒较各自的空白质粒载体荧光素酶活性均明显升高，两组比较差异有统计学意义。pGL4.17重组质粒荧光素酶活性明显高于pGL3-basic重组质粒，差异有统计学意义。结论：成功构建具有sP-B基因转录活性的重组质粒，pGL4.17重组质粒荧光素酶活性高，是后续研究SP-B基因转录调控更好的选择。

摘要： 目的：构建人表面活性物质蛋白-B (SP-B)基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒,并分析其在H441细胞中的转录活性。方法：(1)以人基因组DNA为模板,PCR扩增SP-B启动子(-218/+435 bp)序列片段,通过TA克隆方法连接到pGM-T载体上,筛选阳性克隆将目的片段进行测序。测序鉴定正确后的目的片段被克隆到荧光素酶表达载体pGL3-Basic上构建pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒,酶切及测序鉴定重组质粒；(2)将构建的pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒酶切改造,SP-B启动子克隆进pGL4.17载体构建pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒；经酶切及基因测序无误后,采用脂质体法将构建的两种重组质粒分别和内参质粒pRL-TK同时转染H441细胞,检测双荧光素酶活性。结果：构建的重组质粒经酶切及测序鉴定完全正确，转染H441细胞后，检测细胞裂解液双荧光素酶活性间接反映启动子活性，pGL3-basic/pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒较各自的空白质粒载体荧光素酶活性均明显升高，两组比较差异有统计学意义(t=4.182，P=0.014;t=27.419, P=0.000 )。pGL4.17重组质粒荧光素酶活性明显高于pGL3-basic重组质粒，差异有统计学意义(t=27.712 , P=0.000 )。结论：成功构建具有SP-B基因转录活性的pGL3-basic/pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒，pGL4.17重组质粒荧光素酶活性高，是后续研究SP-B基因转录调控更好的选择。

摘要： 虫荧光素在荧光素酶的催化下能够被氧化而产生生物荧光.荧光素酶是生物体内催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称.随着分子生物学的发展，萤火虫荧光素酶可以用基因工程的方法实现生产.本实验通过克隆萤火虫荧光素酶基因，插入载体在大肠杆菌中转化表达，然后进行细菌培养，对数期收集菌体，用渗透压法、冻融法提取细菌胞质组分，经均质、离心，用凝胶排阻、离子交换等色谱方法可提取高纯度酶.

摘要： microRNA(miRNA)可调控细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程,其具体生物学功能取决于细胞类型和发育阶段等.实验前期研究证明miR17-92cluster参与鸡前脂肪细胞脂肪增殖.为了分析miR-17-92cluster的作用机制,通过miRanda、TargetScan和PicTar等软件共同预测出LRIG1(Leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains protein1)是miR17-92cluster中miR-17-5p,miR-19a及miR-20a的一个潜在靶基因.LRIG1抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.为了验证上述预测结果,开展靶基因的鉴定实验.本研究成功构建出LRIG1的3’UTR区报告基因载体。将报告基因载体与miRNA inhibitor共转染到鸡DF1细胞中，报告基因结果显示：与阴性对照组相比较，加入miRNA-17-5pinhibitor后荧光素酶活性明显升高（P<0.01）；加入miRNA-20a inhibitor后荧光素酶活性升高（P<0.05）；但是加入miRNA-19a inhibitor后与阴性对照组相比荧光素酶活性无显著变化。

摘要： 目的：探讨PPARα的特异性外源性激活物非诺贝特对人肝瘤细胞HepG2细胞PAI-1基因表达的影响和调控机制。rn 方法：不同浓度非诺贝特刺激HepG2细胞,RT-PCR法检测PAI-1和PPARα mRNA水平。构建四个含PAI-1启动子序列从-804至+17间系列缺失体片段驱动的荧光素酶报告基因质粒,转染HepG2细胞,初步确定位于PAI-1启动子序列-804至+17之间的Smad3/4结合元件(SBE)具有调控作用,采用重叠PCR法对该元件进行定点突变并构建相应重组质粒,转染HepG2细胞。WesternBlot法检测非诺贝特诱导下HepG2细胞中Smad3和Smad4的蛋白表达水平。rn 结论：PPARα的特异性外源性激活物非诺贝特可从转录水平抑制HepG2细胞中PAI-1基因的表达，PPARα与PAI-1启动子上的Smad3/4结合元件即SBE参与非诺贝特对HepG2细胞PAI-1基因的转录调控，这一过程涉及到Smads蛋白及其介导的Smad信号转导通路。

摘要： 本研究利用含有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体，可以利用其生物发光的特性定量地检测启动子的启动活性(Nguyen et al.,1988 )。分别将大蒲莲猪和商品猪的USP18基因的5’调控区2.48K片段连入pGL3-basic载体，经荧光素酶活性检测数据统计发现，大蒲莲猪usp18基因启动子活性明显高于商品猪，这与大蒲莲猪USP18 mRNA水平表达量高于商品猪的结果相符。

摘要： 流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的一种人、禽、畜共患的急性传染病，它以高发病率、严重并发症而成为严重威胁人类健康的疾病。特别是新近爆发的高致死率禽流感和A型H1N1病毒引发的流感大流行，更是造成全世界范围内的恐慌。临床上批准使用的抗流感药物主要有金刚烷胺类化合物和神经氨酸酶抑制剂两大类。由于这些药物主要针对病毒颗粒中变异性较强的靶点，使得病毒总是能很快适应并产生耐药性，同时这些药物还存在毒副作用大等问题。因此，亟待寻找新的抗流感病毒药物靶标，发展新型抗病毒药物。流感病毒的基因组依赖其RNA聚合酶的作用进行复制和转录，进而形成病毒颗粒。病毒的RNA聚合酶是由病毒编码的PB1，PB2和PA三个亚基结合组成，同时必须与核蛋白NP结合成复合物后，才能起始病毒基因组的复制和转录。流感病毒RNA聚合酶复合物因其重要功能、机制特殊、高度保守、同源性高等特点，而成为极具发展潜力的药物靶标。由于流感病毒RNA聚合酶作用机制非常复杂，其中不仅涉及多个病毒蛋白，还需要宿主协同因子的参与。这一复杂的催化机制极大地制约了酶活分析方法的发展，直接影响了以RNA聚合酶为靶点的药物的筛选和研发。在本研究中，我们构建了流感病毒RNA聚合酶活性依赖的海肾荧光素酶(Renilla luciferase，简称RLuc)表达载体，并验证了共表达流感病毒RNA聚合酶PA、PB1、PB2亚基和NP蛋白，可以高效诱导RLuc的表达。在荧光素酶底物存在的情况下，通过测定荧光强度，可以定量分析流感病毒RNA聚合酶活性。当上述构成RNA聚合酶复合物的四种病毒蛋白任缺其一，则荧光信号消失。这一结果表明RLuc的表达完全依赖于流感病毒RNA聚合酶复合物的形成。随后，我们通过调整质粒的转染用量，研究各种病毒蛋白的表达水平对该分析系统的影响，进而确定了酶活分析的优化条件。综上所述，该流感病毒RNA聚合酶活性分析方法简便可靠、灵敏特异。可以用于以流感病毒RNA聚合酶为靶点的抗流感病毒药物筛选和药效学评价。

摘要： 在弓形虫外源基因转染研究中，基于弓形虫不同启动子，对叩甲虫荧光素酶和荧光蛋白双报告基因可否在弓形虫转染中实现同时定性和定量检测至今未见尚报道。方法针对弓形虫3个不同启动子GRA1、DHFR和SAG1，构建了一系列荧光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因载体。对弓形虫瞬时转染中影响启动子检测活性的相关条件作了优化。运用荧光倒置显微镜和流式细胞术检测荧光蛋白的表达，用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的活性，并定量监测载体转染效率。结果倒置荧光显微镜观察和流式细胞术检测的结果均显示，不同启动子趋动荧光蛋白表达的强弱不同。流式细胞术检测结果表明，串连YFP荧光蛋白和GFP荧光蛋白在相同启动子趋动下，前者荧光强度大约是后者的3.9倍。用倒置荧光显微镜监测弓形虫瞬时转染，串联YFP报告基因比GFP报告基因敏感性高。但是，串联DHFR－DHFR启动子构建的载体，与GRA1-DHFR串联及SAG1-DHFR串联启动子所构建的载体相比，前者的荧光素酶活性和荧光蛋白表达强度均比后者要低。定量监测同一载体转染效率，结果表明，不论使用哪种启动子，电转105到107弓形虫可检测到荧光蛋白表达，而104没有检测到荧光蛋白表达;而104到107弓形虫可检测到荧光素酶的活性。结论本研究成功构建了以串连YFP和荧光素酶为双报告基因的基于弓形虫3个不同启动子(GRA1、DHFR和SAG1)的瞬时转染载体。荧光素酶报告基因的敏感性高于荧光蛋白报告基因。以GRA1和DHFR为启动子建立的双报告基因系统要比以SAG1启动子建立的双报告基因系统，更适宜于基因转染的监测。

摘要： 针对细菌总数现场检测需求,设计了一种基于ATP(三磷酸腺苷)生物发光技术的细菌总数现场快速检测仪.传统方法检测细菌总数需要2～3天,而利用ATP生物发光技术可在30 min之内完成检测,大大提高了检测速度.本检测仪选取H5773-02型光电倍增管作为光电转换器件以检测微弱光信号,该光电倍增管的工作波长范围为330～850 nm,峰值检测波长为500 nm,ATP生物发光波长为550 nm,两者基本一致,使检测仪具有较高的测量灵敏度.采用流动注射技术,在加入被测样品后分别向样品池中加入检测试剂.由于样品池被密闭在检测腔中,因此可有效减小外界光对测量结果的影响,同时也减小了人为加样对检测重复性的影响,提高检测重复性.利用本检测仪对浓度在10-6～10-14 mol/L内的ATP样品进行了检测.实验表明,测量结果具有明显梯度,测试时间小于400 s时,与标准样品浓度间的线性相关系数达到0.986.设计的细菌总数快速检测仪具有检测速度快、重复性高、操作简单等优点,可适用于食品卫生与安全、环境检测等领域.

摘要： 本发明公开了一种提纯制备高纯度荧光素及荧光素盐的新方法，该方法利用在一定反应介质中加入催化剂使提纯原料与乙酰化试剂反应，形成双乙酰荧光素，从而利用杂质和双乙酰荧光素的不同特性，使杂质分离，再经过皂化、酸化、成盐可以得到高纯度的荧光素或荧光素盐。该方法工艺简单，实际操作容易，环境友好，方便大规模生产。

摘要： 本发明提供一种突变型甲虫荧光素酶等，其在编码野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中，具有以下突变：与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中、第288位的缬氨酸相当的氨基酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸；与其中第376位的亮氨酸相当的氨基酸突变为脯氨酸；与其中第455位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸；或者与其中第488位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或者苯丙氨酸，并且在0.9质量％的氯化钠溶液中由荧光素－荧光素酶发光反应产生的发光强度是在不含氯化钠的溶液中该反应的发光强度的50％以上。

摘要： 本发明提供一种海萤荧光素稳定化组合物及保存海萤荧光素的方法。所述海萤荧光素稳定化组合物包含海萤荧光素或其类似物，以及抗坏血酸或其盐。所述保存海萤荧光素的方法包括：将海萤荧光素或其类似物在抗坏血酸或其盐的存在下进行保存。本发明还提供一种用于海萤生物发光体系的试剂盒，其中所述试剂盒包含海萤荧光素或其类似物，以及抗坏血酸或其盐。本发明还提供一种用于降低海萤生物发光体系的背景的方法，包括：将抗坏血酸或其盐应用到所述海萤生物发光体系。本发明还提供一种测定海萤类生物发光的方法，其特征在于，在海萤荧光素酶和海萤荧光素或其类似物的生物发光测定系统中，在抗坏血酸或其盐的存在下测定生物发光。

摘要： 本发明的目的在于提供一种突变型甲虫荧光素酶，其不易受到NaCl的发光抑制的影响。本发明的突变型甲虫荧光素酶在编码野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中，具有以下突变：与野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中的第294位苯丙氨酸相对应的氨基酸突变为缬氨酸或与第533位天冬氨酸相对应的氨基酸突变为缬氨酸，且在0.9质量％的NaCl溶液中由荧光素‑荧光素酶发光反应产生的发光强度是在不含NaCl的溶液中该反应的发光强度的50％以上。

摘要： 本发明提供一种突变型甲虫荧光素酶等，其在编码野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中，具有以下突变：与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中、第288位的缬氨酸相当的氨基酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸；与其中第376位的亮氨酸相当的氨基酸突变为脯氨酸；与其中第455位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸；或者与其中第488位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或者苯丙氨酸，并且在0.9质量％的氯化钠溶液中由荧光素－荧光素酶发光反应产生的发光强度是在不含氯化钠的溶液中该反应的发光强度的50％以上。

摘要： 提供热稳定性和/或保存稳定性优异的萤火虫荧光素酶和其制造法。萤火虫荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因，其特征在于，在萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中具有：相当于平家萤荧光素酶的第287位的氨基酸置换成丙氨酸、或者相当于第392位的氨基酸突变成异亮氨酸的氨基酸序列。通过利用该基因，能够高效制造稳定性提高了的萤火虫荧光素酶。此外，通过组合第326位的氨基酸置换成丝氨酸的突变、和/或第467位的氨基酸置换成异亮氨酸的突变，能够获得稳定性进一步提高了的萤火虫荧光素酶。

摘要： 提供热稳定性和/或保存稳定性优异的萤火虫荧光素酶和其制造法。萤火虫荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因，其特征在于，在萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中具有：相当于平家萤荧光素酶的第287位的氨基酸置换成丙氨酸、或者相当于第392位的氨基酸突变成异亮氨酸的氨基酸序列。通过利用该基因，能够高效制造稳定性提高了的萤火虫荧光素酶。此外，通过组合第326位的氨基酸置换成丝氨酸的突变、和/或第467位的氨基酸置换成异亮氨酸的突变，能够获得稳定性进一步提高了的萤火虫荧光素酶。

摘要： 本发明属基因工程领域，涉及一种含虫光素酶基因的新型重组体，其特点在于用取自PSV-luc20的萤光虫荧光素酶基因克隆到PIV-III-ompA3质粒中，构建成新型的重组体DNA，将该重组DNA转化大肠杆菌，获得能高产有催化活性的虫光素酶，并将产物分泌到周质区的基因工程菌株，以及用该基因工程菌株生产具有高产活性的虫光素酶，具有培养成分及生产工艺简单，生产周期短等诸多优点。

摘要： 本发明公开了一种基于荧光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管紧张素酶互作检测细胞模型及应用，采用NanoBiT荧光素酶互补原理，在ACE2蛋白的氨基端和RBD羧基端分别接入荧光素大小亚基，两者互补得到有功能的可催化荧光底物发光的功能性复合物。利用该方法检测蛋白抑制剂活性具有灵敏，快捷，信号强、可逆、干扰小、检测方便和成本可控等优点。

摘要： 本发明提供一种海萤荧光素稳定化组合物及保存海萤荧光素的方法。所述海萤荧光素稳定化组合物包含海萤荧光素或其类似物，以及抗坏血酸或其盐。所述保存海萤荧光素的方法包括：将海萤荧光素或其类似物在抗坏血酸或其盐的存在下进行保存。本发明还提供一种用于海萤生物发光体系的试剂盒，其中所述试剂盒包含海萤荧光素或其类似物，以及抗坏血酸或其盐。本发明还提供一种用于降低海萤生物发光体系的背景的方法，包括：将抗坏血酸或其盐应用到所述海萤生物发光体系。本发明还提供一种测定海萤类生物发光的方法，其特征在于，在海萤荧光素酶和海萤荧光素或其类似物的生物发光测定系统中，在抗坏血酸或其盐的存在下测定生物发光。