慢病毒

摘要： 背景:Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5是一种调节糖脂代谢的蛋白分子,可以调控细胞凋亡,且参与抑制动脉粥样硬化的进程。目的:通过构建Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达慢病毒载体,转染人脐静脉内皮细胞,验证Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5调控内皮细胞凋亡的作用。方法:构建Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达慢病毒载体。取处于对数生长期的人脐静脉内皮细胞,分3组培养:空白组不进行慢病毒转染,对照组转染不含Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5基因的空载体慢病毒,实验组转染Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达慢病毒,转染7 d后,采用RT-PCR和Western blot检测Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5的mRNA与蛋白表达。转染7 d后,向3组细胞内加入氧化型低密度脂蛋白溶液,采用CCK-8法测定细胞活力,Hoechst 33342/PI双染及流式细胞技术检测细胞凋亡程度。结果与结论:①实验组Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5的mRNA与蛋白表达均高于空白组、对照组(P0.05);③加入氧化型低密度脂蛋白24 h后,流式细胞术检测显示实验组细胞凋亡率低于空白组、对照组(P<0.05),Hoechst 33342/PI双染显示实验组凋亡细胞数量少于空白组、对照组;④结果表明,过表达Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5可以抑制人脐静脉内皮细胞的凋亡。

摘要： 背景:一些研究已经证实了miR-29a、水通道蛋白4在星形胶质细胞损伤过程中的作用,但其是否存在相互作用以及分子机制尚未见报道。目的:研究miR-29a调控水通道蛋白4表达对过氧化氢诱导星形胶质细胞损伤的影响。方法:①以小鼠原代培养的星形胶质细胞为研究对象,用不同浓度的过氧化氢诱导小鼠星形胶质细胞损伤反应,细胞分为对照组、过氧化氢组、过氧化氢+空载体组、过氧化氢+miR-29a过表达组。采用MTT法检测小鼠星形胶质细胞存活率;Western blot法检测小鼠星形胶质细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3)、水通道蛋白4和胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达水平;实时定量PCR检测小鼠星形胶质细胞中miR-29a的表达水平;流式细胞仪检测小鼠星形胶质细胞凋亡水平。②将12只雌性BALB/c小鼠随机分为空载体组、过表达miR-29a组,每组6只。制备小鼠T10脊髓撞击损伤动物模型,建模后分别注射以下重组慢病毒(空载体、miR-29a过表达载体)。术后第7天,采用免疫组织荧光染色检测小鼠脊髓损伤部位水通道蛋白4和胶质纤维酸性蛋白表达水平。结果与结论:①过氧化氢诱导后星形胶质细胞活性下降,促凋亡相关蛋白Bax、cleaved-caspase-3水平升高,抑凋亡相关蛋白Bcl-2水平降低,且具有浓度依赖效应。在过氧化氢诱导损伤的小鼠星形胶质细胞中,miR-29a表达降低而水通道蛋白4和胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达显著增加;过表达miR-29a能抑制水通道蛋白4的蛋白表达,抑制细胞凋亡。信息学软件预测水通道蛋白4可能是miR-29a的下游靶基因。②在小鼠脊髓撞击损伤模型中,与注射空载体病毒组比较,损伤部位过表达miR-29a能抑制水通道蛋白4和胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达。③以上研究结果表明,miR-29a调控水通道蛋白4能够抑制过氧化氢诱导的星形胶质细胞凋亡。

摘要： 背景:人牙髓干细胞成骨分化的具体调控机制尚不明确,研究其具体机制对干细胞在组织工程中的应用有重要意义。目的:探究慢病毒介导沉默Smad2基因对人牙髓干细胞成骨分化的影响。方法:将培养的第3代人牙髓干细胞分为空白对照组、阴性对照组、Smad2-shRNA组和Smad2-shRNA+转化生长因子β3组。利用qRT-PCR技术检测成骨相关基因RUNX2、骨钙素、Smad2、Smad3及Smad4的mRNA表达,利用Western blot技术检测RUNX2、骨钙素、Smad2/Smad3、p-Smad2/Smad3及Smad4的蛋白表达,各组细胞培养第7,14天进行茜素红染色。结果与结论:①与阴性对照组及空白对照组比较,Smad2-shRNA组RUNX2、骨钙素、Smad2、Smad3和Smad4的mRNA表达量降低,差异有显著性意义(P<0.05);与Smad2-shRNA组比较,Smad2-shRNA+转化生长因子β3组的骨钙素、Smad2、Smad3及Smad4的mRNA表达量明显增高,差异有显著性意义(P<0.05);②与阴性对照组及空白对照组比较,Smad2-shRNA组RUNX2、骨钙素和Smad2/Smad3的蛋白表达量降低,差异有显著性意义(P<0.05);与Smad2-shRNA组比较,Smad2-shRNA+转化生长因子β3组的RUNX2、骨钙素、Smad2/Smad3和Smad4的蛋白表达量明显增高,差异有显著性意义(P<0.05);③使用常规培养基培养以及使用慢病毒载体转染不能诱导人牙髓干细胞的成骨分化,而转化生长因子β3能够正向调控人牙髓干细胞的成骨向分化;④结果表明,转化生长因子β/Smad2信号转导途径在人牙髓干细胞的成骨分化过程中发挥着重要作用。

摘要： 目的:探讨RNA结合蛋白震颤同系物-5(QKI-5)在卵巢癌细胞中的表达以及对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过免疫印迹实验(Western blot)检测正常卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞中QKI-5的表达差异,并选取QKI-5相对表达水平最低的卵巢癌细胞进行过表达慢病毒感染,构建稳定转染细胞系后通过细胞增殖和毒性分析(CCK8)和平板克隆实验检测细胞增殖和克隆能力的变化,通过流式细胞仪检测过表达QKI-5对卵巢癌细胞凋亡的影响。结果:Western blot实验结果显示,在卵巢癌细胞中QKI-5的表达水平相比正常卵巢上皮细胞显著降低,三株卵巢癌细胞中A2780细胞的QKI-5表达水平相对最低,通过慢病毒感染成功构建了稳定过表达QKI-5的A2780细胞系。CCK8和平板克隆实验结果显示,过表达QKI-5基因后A2780细胞增殖活力和克隆形成能力受到抑制(P<0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示,QKI-5表达水平的增加能够显著促进A2780细胞的凋亡(P<0.05)。结论:RNA结合蛋白QKI-5在卵巢细胞中表达水平异常降低,QKI-5表达特异性扩增后能够抑制卵巢癌细胞A2780增殖和克隆形成能力并促进癌细胞发生凋亡。

摘要： 目的:探讨靶向小鼠IL-6基因RNA干扰慢病毒载体颗粒(LV-IL-6-RNAi)对小鼠巨噬细胞株J774A.1细胞IL-6表达的影响,及其对胶原诱导性关节炎(CIA)的治疗作用。方法:设计合成3对特异性针对小鼠IL-6基因的小干扰RNA(siRNA)序列,筛选最高效siRNA序,构建高效LV-IL-6-RNAi。LV-IL-6-RNAi感染小鼠巨噬细胞株J774A.1细胞,并设慢病毒阴性对照(LV-NC-RNAi)、培养基空白对照,RT-qPCR检测J774A.1细胞的IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1βmRNA相对表达水平,以检测LV-IL-6-RNAi体外干扰效率。取DBA/小鼠构建CIA模型并随机分为4组:LV-IL-6-RNAi组、LV-NC-RNAi组、甲氨蝶呤(MTX)阳性对照组、PBS空白对照组,分别关节腔注射LV-IL-6-RNAi、LV-NC-RNAi、腹腔注射MTX、PBS溶液,记录CIA小鼠关节炎评分,ELISA检测小鼠IL-6、IL-1β和TNF-α血清水平,组织病理检测炎症关节的炎症细胞浸润数。结果:成功构建了高效LV-IL-6-RNAi。在体外J774A.1细胞水平上,LV-IL-6-RNAi组IL-6 mRNA相对表达水平显著低于LV-NC-RNAi组、培养基空白对照组(F=33.47,P0.05)。首次免疫注射牛Ⅱ垂胶原后第28~35天成模,成模率为96.43%。首次免疫注射后第35天,CIA-LV-IL-6-RNAi组关节炎评分开始降低,首次免疫注射后第42天,CIA-LV-IL-6-RNAi组关节炎评分显著低于CIA-LV-NC-RNAi、CIA-PBS组(F=10.05,P0.05)。CIA-LV-IL-6-RNAi组和CIA-MTX组炎症关节病理切片高倍镜下炎症细胞的浸润数量均显著少于CIA-LV-NC-RNAi组和CIA-PBS组(F=141.80,P0.05)。结论:成功构建的高效LV-IL-6-RNAi可作为类风湿关节炎(RA)实验性基因治疗的有效手段。

摘要： 目的探索转染SOX2-shRNA载体慢病毒对唾液腺腺样囊性癌(SACC)细胞系SACC-LM和SACC-83生物学行为的影响。方法构建3种SOX2-shRNA慢病毒载体(817、818、819)并将其转染到SACC细胞中,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹(Western blot)筛选出抑制效果最好的shRNA。将抑制效果最好的慢病毒载体转染到SACC-LM、SACC-83细胞后,Western blot检测SOX2、Survivin、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达变化,CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况,细胞划痕实验及Transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力。结果3种慢病毒中SOX2-shRNA-819干扰效果最好。SACCLM、SACC-83细胞转染SOX2-shRNA-819慢病毒后,SOX2、Survivin、N-cadherin的表达下调,E-cadherin的表达上调(P<0.05);细胞增殖能力降低,凋亡能力增强(P<0.05);细胞迁移和侵袭能力下降(P<0.05)。结论shRNA干扰技术降低SOX2表达的同时下调了SACC-LM中Survivin的表达,二者的表达可能具有相关性;SOX2的低表达抑制了SACC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进了凋亡能力。SOX2可能参与了SACC上皮间充质转化过程,为靶向SOX2基因治疗SACC提供了相关的理论依据。

摘要： 目的 构建靶向癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的嵌合抗原受体C2-45/CAR,制备慢病毒,为CEA阳性肿瘤的细胞免疫治疗奠定研究基础。方法 通过基因重组技术将CEA scFv、CD8铰链区和跨膜区、共刺激分子CD137和CD3ζ克隆入慢病毒表达载体pCDH中(pCDH-C2-45/CAR),酶切和测序鉴定,用慢病毒制备试剂盒合成慢病毒LV-C2-45/CAR,梯度稀释法测定病毒滴度,免疫印迹法(Western blotting)检测目的基因表达。结果 经转化、鉴定,慢病毒表达载体pCDH-C2-45/CAR构建成功;成功合成慢病毒LV-C2-45/CAR(对照LV-pCDH),Western blotting检测显示慢病毒LV-C2-45/CAR感染293T细胞后可见C2-45/CAR表达。结论 靶向CEA嵌合抗原受体表达载体及慢病毒制备成功,为CAR修饰T细胞、NK细胞杀伤CEA阳性肿瘤研究奠定基础。

摘要： 目的:研究由慢病毒介导的RNA干扰对乙型脑炎病毒(JEV)感染细胞与小鼠的抑制作用。方法:以JEV的C、NS3、NS4A和NS5基因为靶点,设计特异性siRNA序列,并构建重组传导慢病毒。对慢病毒预处理的BHK21细胞接种JEV,并通过相对定量PCR、病毒蚀斑和间接免疫荧光实验检测慢病毒对JEV的抑制作用。对慢病毒预处理的7日龄乳鼠脑内接种JEV,5 d后测定其脑组织中的病毒滴度;选取3周龄小鼠做攻毒保护实验。结果:在细胞中,4种重组慢病毒均使JEV的RNA载量与病毒滴度降低(P<0.05),其中LV-C组的RNA载量降低了89.7%,病毒滴度下降约1200倍。4组乳鼠的脑组织中,JEV病毒滴度均降低(P<0.05),其中LV-C组病毒滴度下降约1700倍;4种重组慢病毒对3周龄小鼠的攻毒保护率为50%~70%。结论:由慢病毒介导的靶向JEV的C、NS3、NS4A与NS5基因的RNAi对JEV感染细胞与小鼠具有抑制作用,且有一定持续性,其中靶向C基因的RNAi的抗病毒效果最强。

摘要： 为了在绵羊肺成纤维细胞OAR-L1中高效表达外源蛋白,探索适合该细胞的转染方法,本研究比较了聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)、脂质体2000转染试剂(Lipofectamine^(TM) 2000 transfection reagent,Lipo 2000)、成纤维细胞转染试剂盒(Cytofect^(TM) fibroblast transfection kit,CF2)以及慢病毒介导的细胞转染方法在OAR-L1细胞中表达外源蛋白的效果。结果显示:以pLentiCMV-EGFP-Puro或pLentiCMV-mCherry-Puro荧光质粒转染OAR-L1细胞时,细胞密度和转染试剂用量均可影响PEI、Lipo 2000和CF2介导的细胞转染效率,且三者最佳转染效率均不超过30%,而慢病毒介导的细胞侵染不受细胞密度和病毒液用量的限制,获得的荧光细胞数目也显著高于前三者。包装好的病毒液可以在4或-80°C条件下至少保存15 d而侵染效果不受影响。在OAR-L1细胞中共表达2种外源蛋白时,包装获得的2种慢病毒液等比例混合后再侵染的方式能获得更高的共转率。综上所述,慢病毒侵染是一种能够实现在OAR-L1细胞中高效表达外源蛋白的细胞转染方式,本研究结果为其他难转染细胞系转染方式的选择提供了一定的参考。

摘要： 目的:探究RUNX2基因过表达载体修饰骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)来源的外泌体联合碳酸钙支架系统在骨缺损中的效果。方法:以兔源BMSCs为研究对象,利用流式细胞仪对BMSCs进行鉴定。构建RUNX2基因过表达载体,利用慢病毒转染BMSCs,采用超速离心法进行收集外泌体。利用透射电子显微镜观察外泌体的形态,利用Western blot法检测外泌体标志物CD63分子的表达,利用三室并联自动温控反应系统,构建碳酸钙支架。根据是否转染RUNX2基因过表达载体,将BMSCs与碳酸钙支架的复合物分成3组,即BMSCs组,RUNX2过表达组和外泌体组。利用油红O染色和逆转录-聚合酶链反应(reverse-transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR)检测BMSCs的成骨分化。采购成年健康雄性新西兰大白兔9只,清洁级,年龄(12.97±1.21)个月,体质量(19.3±3.6)kg,每组3只。利用手术方法构建颅骨缺损动物模型,利用影像学,HE染色和Masson染色评估骨缺损的修复。结果:流式细胞仪检测结果表明,BMSCs细胞表面CD29蛋白表达为99.5%,CD44蛋白表达为100%,CD11b蛋白表达为0.1%,CD45蛋白表达为0.1%。透射电镜结果显示,外泌体为直径50~150 nm的双层膜囊泡状结构。Western blot结果显示,外泌体的分子标志物CD63表达阳性。油红O染色结果显示,外泌体组BMSCs的成骨分化要明显高于RUNX2过表达组和BMSCs组。RT-PCR检测结果显示,外泌体组BMSCs的RUNX2,BMP-2和碱性磷酸酶的mRNA相对表达量要明显高于RUNX2过表达组和BMSCs组(P<0.05)。影像学结果显示,外泌体组颅骨缺损修复效果要优于RUNX2过表达组。HE染色和Masson染色结果显示,外泌体组颅骨缺损修复效果要优于RUNX2过表达组(P<0.05)。结论:相较于RUNX2基因过表达载体转染,直接提取外泌体,可以更高效的促进BMSCs向成骨细胞分化,与碳酸钙支架相结合后,可以更好地促进骨缺损的愈合,从而为临床上骨缺损的治疗提供新思路和方法。

摘要： 目的:观察携带人端粒酶逆转录酶基因的慢病毒表达载体转染SW626细胞(人卵巢腺癌细胞株)后hTERT基因在靶细胞中的表达.rn 方法:将携带目的基因hTERT的重组慢病毒表达载体及包装系统共转染293T细胞(人胚肾上皮细胞株),通过超速离心沉淀法浓缩病毒上清后转染SW626细胞.转染前将靶细胞分为转染组、空转组及对照组,完成转染后于显微镜下观察靶细胞中绿色荧光蛋白显色,并应用PCR检测SW626细胞中hTERT mRNA的表达.rn 结果:293T细胞经重组慢病毒与包装质粒共转染后能产生重组病毒并且能够成果的将目的基因hTERT高效地转导入靶细胞SW626细胞中并稳定表达,荧光显微镜下可直接观察到GFP;转染后的SW626细胞经检测,其内hTERT基因mRNA表达明显增强.rn 结论:重组慢病毒表达载体LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT能够高效稳定地将外源hTERT基因导入SW626细胞并使其长久表达,为卵巢肿瘤生物治疗研究奠定了科研基础.

摘要： 目的:利用基因重组技术构建LV3-hEGFL7-shRNA慢病毒表达载体.方法:设计靶向人EGFL7基因的小发卡RNA(shRNA)序列,将hEGFL7-shRNA基因片段连接到慢病毒载体pGLV3/H1/GFP+Puro中,构建慢病毒表达质粒LV3-hEGFL7-shRNA,通过酶切、DNA测序验证hEGFL7片段的准确性,将LV3-hEGFL7-shRNA包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度.结果:酶切和测序结果证实EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为2×108TU/ml.结论:成功构建人EGFL7基因shRNA质粒表达载体.

摘要： 目的:构建整合素β1(integrinβ1,ITGB1)基因干扰慢病毒载体,并研究ITGB1对他莫昔芬耐药乳腺癌MCF-7细胞(MCF-7R)的迁移和侵袭能力的影响.rn 方法:针对ITGB1靶序列设计合成4条shRNA序列及1条阴性对照序列NC,构建ITGB1RNAi慢病毒载体及对照病毒载体,并分别进行慢病毒包装,通过内源性筛靶,选取干扰效果最好的一组病毒感染MCF-7R细胞,Western blot检测ITGBl蛋白的表达水平;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力.rn 结果:成功构建4条慢病毒干扰重组质粒,并分别包装成病毒,通过内源性筛靶挑选出效果最佳的慢病毒组,感染MCF-7R细胞后ITGB1基因的蛋白表达量较空白对照CON组(p＜0.01)和阴性对照NC组(p＜0.01)明显降低,且细胞的迁移和侵袭能力明显弱于CON组(p＜0.01)和NC组(p＜0.01).rn 结论:慢病毒介导的shRNA可有效地干扰MCF-7R细胞中ITGB1的表达,并且抑制MCF-7R细胞的迁移和侵袭能力.

摘要： 目的:设计并筛选人IGF-Ⅰ有效RNA干扰片段,构建IGF-Ⅰ-siRNA慢病毒表达载体.方法:对人IGF-Ⅰ基因编码区分析、筛选序列4条,阴性对照序列1条.与pGCL-GFP质粒重组后,转染大肠杆菌感受态细胞.阳性克隆经过鉴定后得到正确重组子,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,体外直接感染表达IGF-I的人血管平滑肌细胞.通过用Realtime-PCR检验干扰效果.结果:1、成功地合成四条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pGCSIL-GFP载体中,构建重组质粒PscSl-1,2,3,4及无关基因的重组质粒PSC-NC,酶切鉴定和测序证实载体构建成功.2、Real time-PCR检测IGF-I的mRNA表达,发现重组质粒PscSI-1转染人血管平滑肌细胞后IGF-I mRNA表达最低,重组质粒PSC-NC转染组细胞内IGF-ImRNA的表达量与空白对照的水平接近(P>0.05).结论:1、成功构建了小的发夹式IGF-I慢病毒表达载体.2、在人IGF-I序列位点1010～1028bp、序列为ACCTTGTCTAAGTGGTTTA可以在人血管平滑肌细胞中实现对人IGF-I基因表达的有效沉默.

摘要： 目的：构建LXRs过表达的慢病毒载体,感染H9C2细胞.过表达LXRs对高糖诱导的H9C2细胞炎症反应.探讨过表达LXRs改善H9C2细胞炎症反应的机制.方法：运用酶切法基因的质粒中获取Nr1h2和Nr1h3对应的基因片段,获得携带Nr1h2：和Nr1h3：基因重组慢病毒.分为五组:①Control组:用低糖9C2：细胞;②High glucose 组:高糖H9C2 细胞;③LXRα组:感染GV287-Nr1h3 慢病毒组;④LXRβ组:感染GV287-Nr1h2慢病毒组;⑤GFP组:感染空载慢病毒组.⑸慢病毒感染后,用CCK-8检测各组H9C2 细胞的增殖情况;qRT-PCR：分别检测LXRα、LXRβ和TNF-α、MCP-1、IL-6 的mRNA 表达水平;Western blot和免疫荧光检测NF-κB的蛋白表达变化。结果：qRT-PCR检测LXR a和LXRβmRNA表达结果:LXR a组和LXR β组mRNA表达水平明显上调(P<0.01); 2.CCK-8检测各组H9C2细胞增殖:High glucose组抑制率最高(P<0.01);而LXR a和LXRR组均能降低由高糖引发的抑制率增高，LXR。组降低幅度更明显(P<0.01);3.qRT-PCR检测TNF-a、MCP-1、IL-6 mRNA表达:High glucose组基因TNF- a、MCP-1、IL-6 mRNA表达上调(P<0.01);LXR a和LXRβ组TNF-a,MCP-1、IL-6 mRNA表达下调，4.免疫荧光检测NF-κB p65蛋白核转位:High glucose组和GFP组可见大部分胞核表达较强的红色荧光，LXR a组和LXR β组分别约见40%和68%的胞核表达红色荧光。5.Western blot检测NF-κB蛋白表达结果:High glucose组蛋白表达水平上调(P<0.01);LXR a和LXR β组能下调由高糖诱导的蛋白高表达，LXR a组下调显著(P<0.01)。结论:(1)过表达LXRs能够改善高糖诱导的H9C2细胞炎性反应，其中LXR a具有更显著的抗炎效应。(2)过表达LXRs能够抑制NF-κB的激活，并可能通过这种效应来改善H9C2细胞的炎性反应，LXRa抑制NF-κB的活性更明显;提示NF-κB通路是LXRs改善心肌细胞炎症反应的主要途径之一。

摘要： 目的：“构建人肝细胞生长因子基因慢病毒表达载体.方法：以含有人肝细胞生长因子cDNA全长片断的pUC-SRα/HGF载体为模板,利用PCR法获得两端带有attB重组位点的PCR融合产物,随后利用PCR技术将其克隆至入门载体pDONR-221的多克隆位点内,得到入门质粒pDown-HGF.结果：PCR及测序结果表明慢病毒表达载体pLV.EX3d.Peo-EF 1 A>HGF>IRES/eGFP构建成功，转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒液滴度为7.9x107TUlml。结论：成功构建了EGFP和人肝细胞生长因子基因共表达的慢病毒表达载体。

摘要： 目的:构建大鼠蛋白激酶Cγ(PKCγ)基因的可调控shRNA干扰慢病毒载体，并在细胞水平鉴定其可调控效率。方法: 将前期构建好的含大鼠PKCγ基因的shRNA干扰序列从质粒pLVTHM酶切和含tet-on可调控序列从质粒pLVPT-tTR-KRAB酶切后连接，连接后的新质粒包装成慢病毒后感染C6细胞，筛选出感染慢病毒的C6细胞经不同浓度的强力霉素诱导后，用免疫印迹技术(westem blot)检测PKCγ基因的蛋白表达水平的改变以评价慢病毒载体的可调控效率。结果:测序证实成功构建了大鼠PKCγ基因的可调控shRNA干扰慢病毒载体，感染C6细胞后经强力霉素诱导可以依递增浓度梯度递降PKCγ蛋白的表达。结论:成功构建大鼠PKCγ基因的可调控shRNA干扰慢病毒载体，且慢病毒载体可被强力霉素诱导而特异高效地抑制PKCγ基因的表达。

摘要： 为研究获得抗猪瘟病毒转基因猪，本研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段，获得4个重组慢病毒，分别感染PK-15细胞，筛选获得阳性细胞，扩大培养后猪瘟病毒，在接毒后72h对病毒进行检测，比较其对猪瘟病毒的干扰效果。将对猪瘟病毒有较好干扰的重组慢病毒转入猪胎儿成纤维细胞中，流式细胞术筛选获得阳性细胞，作为抗猪瘟转基因猪研究的供体细胞，经处理后将细胞核移植到成熟的去核注卵母细胞中，获得体细胞核移植胚胎，移植入发情的受体母猪输卵管中进行转基因猪生产。结果显示，转入慢病毒(P2)的PK-15细胞对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用，故将转入慢病毒P2的猪胎儿成纤维细胞作为抗猪瘟转基因猪的供体细胞，妊娠期满后，获得一头转基因克隆仔猪(临产前死亡)，对其心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、脑等组织中外源插入基因的鉴定表明，该猪为转入干扰Jiv基因干扰载体(P2)的转基因猪。

摘要： 目的:研究运用慢病毒介导的血红素加氧酶1(HO-1)及HO-1 siRNA调控HO-1基因在急性髓系白血病(AML)细胞株中的表达,探讨HO-1基因调控对AML细胞株(Kasumi-1,HL-60)增殖的影响.方法：构建并制备重组Lv-HO-1及Lv-shRNAs-HO-1慢病毒,并感染Kasumi-1、HL-60细胞;应用RT-PCR和Western blot法检测HO-1调控效果,Kasumi-1和HL-60细胞株各分为空白对照组、感染Lv-HO-1(Lv-HO-1组)和感染Lv-shRNA2-HO-1(Lv-shRNA2-HO-1组)3个组,对各实验组以柔红霉素作用诱导细胞凋亡,MTT分析HO-1表达调控对Kasumi-1、HL-60细胞增殖抑制率的影响,探讨柔红霉素IC50值改变与HO-1基因调控的关系;流式细胞术检测其调控对细胞增殖的影响,分析其影响柔红霉素胞内浓度的情况,对Kasumi-1、HL-60细胞周期的改变.

摘要： @@本文探索携带白细胞介素4(IL-4)基因重组复制缺陷型慢病毒感染同种骨髓间充质干细胞（Bone Marrow stromal Cells，BMSCs）后，内耳局部应用对实验性免疫性内耳病模型豚鼠治疗作用；同时探讨BMSCs导入内耳后的活性、分布情况，重组慢病毒载体和重组BMSCs载体细胞导入内耳后IL4基因修饰和产物表达情况、BMSCs作为种子细胞在微环境诱导下向听毛细胞分化的趋势。

摘要： 本发明一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞，属于医学分子生物学领域。本发明的一种重组慢病毒载体，其特征在于：在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40Poly A序列，所述慢病毒载体为FG-12。本发明重组慢病毒的应用，如转染用于移植的干细胞，将使移植到患者体内的干细胞置于本发明重组慢病毒载体的启动子的监控之下，移植的干细胞一旦发生恶性转化，将立即启动重组慢病毒中自杀基因Apoptin的表达，使恶性转化的细胞凋亡而死。在临床使用中，本发明的重组慢病毒对转化干细胞起着即特异地起到预警、反应、示踪、清除的功能。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种融合成像基因及其慢病毒表达质粒、慢病毒和细胞，其制备方法和用途。融合成像基因包括生物发光成像基因、荧光蛋白基因和钙成像基因，三种基因之间通过连接基团连接。将融合基因插入改造后的慢病毒表达质粒，获得携带融合成像基因的慢病毒颗粒。慢病毒颗粒可用于不同类型细胞的感染，获得融合成像基因标记的细胞。经本发明中的融合成像基因标记的细胞，可以同步进行细胞的数量成像检测、形态成像检测以及钙活动功能成像检测，在细胞命运追踪方面具有重要用途。

摘要： 本发明提供了一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：TMEM119启动子、iCre基因、Cx3cr1启动子、loxP位点、DsRed基因和EGFP基因。本发明的慢病毒可以特异性活体标记小胶质细胞，准确地实时区分小胶质细胞与其他细胞，在研究小胶质细胞的发育、行为和功能等方面具有重要意义。

摘要： 本发明涉及一种慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒。该慢病毒包装载体系统包含2个或更多个质粒，能产生只有一次感染能力而无复制能力的慢病毒，其中一个质粒包含顺次连接的启动子、增强子、以及用于编码包膜蛋白的核酸片段，编码包膜蛋白的核酸片段包括用于表达SARS‑CoV‑2的S蛋白的核酸片段或用于表达SARS‑CoV‑2的S蛋白的突变体的核酸片段，用于表达SARS‑CoV‑2的S蛋白的突变体为SARS‑CoV‑2的S蛋白的S1亚基的C端第614位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸。利用上述慢病毒包装载体系统制得的慢病毒可以用于筛选针对SARS‑CoV‑2或其突变株的药物，安全性高。

摘要： 本发明提供一种慢病毒包装系统、其所制得的慢病毒及经该慢病毒转导的细胞及其应用。慢病毒包装系统包含：转移质粒，其包含TAR嵌合5’LTR的核苷酸序列；至少一包装质粒，包含编码TAR RNA结合蛋白的基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列；及包膜质粒。本发明因包含上开质粒而可表达TAR RNA结合蛋白的基因，使所生产的慢病毒有较高的病毒效价，且将所生产的慢病毒用于细胞转导时亦能提升转导率及基因传递效率。本发明另提供一种提高宿主细胞的慢病毒产量的方法，其包含使用前述的慢病毒包装系统转染所述宿主细胞，并能进一步降低制造基因改造细胞的成本。

摘要： 本发明“一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞”，属于医学分子生物学领域。本发明的一种重组慢病毒载体，其特征在于：在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40Poly A序列，所述慢病毒载体为FG-12。本发明重组慢病毒的应用，如转染用于移植的干细胞，将使移植到患者体内的干细胞置于本发明重组慢病毒载体的启动子的监控之下，移植的干细胞一旦发生恶性转化，将立即启动重组慢病毒中自杀基因Apoptin的表达，使恶性转化的细胞凋亡而死。在临床使用中，本发明的重组慢病毒对转化干细胞起着即特异地起到预警、反应、示踪、清除的功能。

摘要： 本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体公开了一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用。本发明在常规慢病毒载体pGreenPuro shRNA基础上，选择性插入EF1a启动子元件，获得pGreenPuro‑Dual质粒，进而获得一种表达CD19‑CAR协同沉默PD‑1的重组慢病毒载体。通过慢病毒包装程序获得表达CD19‑CAR‑plus‑shPD‑1的重组慢病毒，能够体外感染目的细胞并有效表达CD19‑CAR以及抑制PD‑1基因的表达。本发明可用于肿瘤的细胞免疫治疗，具有特异的杀伤肿瘤作用，并对肿瘤的免疫微环境具有潜在的调节作用，为基础实验性研究和临床治疗提供了良好的技术支撑。

摘要： 本发明涉及用于治疗溶原性病毒的组合物，该组合物包括编码分离的核酸的慢病毒载体，该分离的核酸编码两种或更多种基因编辑器，所述基因编辑器选自靶向病毒DNA的基因编辑器、靶向病毒RNA的基因编辑器、及其组合；治疗裂解性病毒的组合物，该组合物包括编码分离的核酸的慢病毒载体，所述分离的核酸编码至少一种靶向病毒DNA的基因编辑器以及靶向病毒RNA的成分；用于治疗溶原性病毒和裂解性病毒的组合物，该组合物包括编码分离的核酸的慢病毒载体，该分离的核酸编码靶向病毒RNA的两种或更多种基因编辑器；用于治疗裂解性病毒的组合物；以及通过向具有病毒的个体施用上述组合物并灭活该病毒来治疗溶原性病毒或裂解性病毒的方法。

摘要： 本发明公开了一种治疗乙型肝炎的慢病毒载体和颗粒，该慢病毒载体和颗粒包含乙型肝炎病毒抗原的编码核苷酸序列，乙型肝炎病毒抗原优选大S抗原，可应用于在有需要的对象中治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染或治疗和/或预防由乙型肝炎病毒感染引起的病症的药物组合物或疫苗中，具有优异的治疗和预防效果。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达单元、重组慢病毒表达载体、重组慢病毒及其制备方法和应用。本发明合成了人源PIRT基因启动子序列和兔源RFT‑I最小启动子序列，并将切割SNARE的蛋白酶编码序列分别插入到这两个启动子下游，制备得到两种不同的重组慢病毒表达载体和病毒。本发明的慢病毒具备特异性抑制外周痛觉发生和信号传导的特点，有效切割了SNARE蛋白，抑制了痛觉神经递质的分泌，达到基因治疗疼痛的目的。