海萤荧光素稳定化组合物及保存海萤荧光素的方法

摘要

本发明提供一种海萤荧光素稳定化组合物及保存海萤荧光素的方法。所述海萤荧光素稳定化组合物包含海萤荧光素或其类似物，以及抗坏血酸或其盐。所述保存海萤荧光素的方法包括：将海萤荧光素或其类似物在抗坏血酸或其盐的存在下进行保存。本发明还提供一种用于海萤生物发光体系的试剂盒，其中所述试剂盒包含海萤荧光素或其类似物，以及抗坏血酸或其盐。本发明还提供一种用于降低海萤生物发光体系的背景的方法，包括：将抗坏血酸或其盐应用到所述海萤生物发光体系。本发明还提供一种测定海萤类生物发光的方法，其特征在于，在海萤荧光素酶和海萤荧光素或其类似物的生物发光测定系统中，在抗坏血酸或其盐的存在下测定生物发光。

说明书

本发明专利申请是基于2006年9月25日提交的发明名称为“海 萤荧光素发光基质及其制造方法”的中国专利申请200680035410.3号 的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种与海萤荧光素酶反应的荧光素(发光基质)的制造 方法、新型的海萤荧光素化合物和其制造技术的确立。

另外，本发明涉及一种与天然的海萤荧光素发光波长不同的衍生 物、背景低的衍生物、组合物、发光测定方法。

背景技术

发光性甲壳类海萤及其近缘物种具有分泌性的发光酶(荧光素酶) 和发光基质(荧光素)，海萤荧光素利用以海萤荧光素酶为催化剂的氧化 反应而发出最大发光波长为460nm的蓝色的光。

由于荧光素酶具有可分泌到细胞外的特征，因此，当将克隆好的 cDNA用作报告基因时，在哺乳类、酵母细胞中合成的蛋白也可分泌到 细胞外。因而，由于不破坏细胞就可以测定海萤荧光素酶的发光活性， 因此，例如可以在细胞外测定哺乳类细胞內的基因转录活性(非专利文 献1～2、专利文献1～3)。另外，可用作酵母细胞中的报告基因检测用分 泌型荧光素酶(专利文献4)。

在利用该发光酶的报道中有如下例子：通过将该分泌型发光酶进 行图像分析而使来自细胞的蛋白质的分泌直观化的例子(非专利文献 3)；通过使用将插入了生长激素基因的转录活性区域的海萤报告基因导 入的哺乳类细胞，连续地测定生物细胞中的转录活性的变化的例子(非 专利文献4)。另外，也有利用海萤荧光素酶和荧光蛋白的融合体将来 自蛋白质的活性肽的处理进行定量的例子(专利文献5)。

在制药领域中，蛋白表达抑制剂及分泌抑制剂等的开发及探索是 重要的，以细胞內的目标蛋白质的基因转录活性的变化为指标进行筛 选。传递伴随抑制剂的效果的基因转录活性的变化是报告基因(蛋白质) 的任务。作为报告蛋白质，要求不仅通知基因的ON/OFF、而且可以分 析抑制剂效果的时效变化(时间分解能高)，或者，要求具有对报告蛋白 质本身不具有抑制效果或不干扰细胞內功能(无细胞毒性)等特性。作为 实现高的时间分解能且没有细胞毒性的报告基因，需要快速地分泌或 代谢在细胞內制作成的报告蛋白质。

海萤荧光素酶被分泌且可以快速地测定细胞外转录活性的变化， 因此，其用途广泛。虽然是唯此有用的报告酶，但海萤荧光素酶的实 用化·通用化还在观望中。这是因为作为基质的荧光素存在不能充分供 给的较大问题的缘故。

另外，作为海萤荧光素的问题，可列举：荧光素难以稳定供给、 荧光素和白蛋白蛋白质等的自发光、发光波长与其他发光体系重叠等。

迄今为止，报道过的海萤荧光素的合成都以作为前体的初荧光素 (etioluciferin)为中间体。对于初荧光素的合成而言，最短的也需要7个 步骤(非专利文献5～7)。由于作为最终步骤的从初荧光素至海萤荧光素 的步骤的收率差，需要大量地制备原料，因此，使荧光素的制造成本 显著提高。根据现有文献中所记载的方法，用3-甲基-2-氧代戊酸和初 荧光素的缩合反应的光学活性的荧光素的合成收率在3阶段为2％(非 专利文献5，图1)。如上所述，由于最终步骤的收率非常低，因此，目 前的现状是，利用有机合成的光学活性的海萤荧光素难以工业化。

由于外消旋体荧光素(非专利文献7)仅显示出天然荧光素的大约 一半的活性、存在不依赖于非天然型荧光素的荧光素酶的发光背景， 因此，光学活性的荧光素的合成在生物鉴定中是非常重要的课题。

另一方面，海萤荧光素和海肾荧光素的基本骨架为咪唑并吡嗪酮 骨架，因此，最大发光波长接近，根据荧光素酶结构而稍有不同，都 为约460nm-约480nm，难以同时测定这两个发光体系。

另外，虽然存在利用海萤荧光素酶和荧光蛋白的融合体将来自蛋 白质的活性肽的处理定量化的例子，但由于海萤荧光素酶的发光最大 值(460nm)与荧光蛋白的发光最大值(525nm)之差(stokes shift)较小、为 60nm，因此，可看到海萤荧光素酶的发光对荧光蛋白的荧光的干涉。 该光干涉在利用荧光蛋白的肽的处理定量化中成为高背景。期望开发 最大发光波长不同的海萤荧光素类似物。

而且，海萤荧光素利用培养液中的白蛋白等而发生化学发光，为 量子收率低的发光。由于自发光为不依赖于荧光素酶量的发光，因此 可在细胞內的海萤荧光素酶的成像或转录活性的测定等中作为背景来 观察。期望开发背景少的海萤荧光素类似物。

目前合成了海萤荧光素衍生物，并发明了用于过氧化物阴离子定 量等的化学发光试剂。但是，还没有开发出成为海萤荧光素酶的基质 的衍生物。

专利文献1：WO90/01542

专利文献2：特开平3-30678

专利文献3：特开2004-187652

专利文献4：特愿2005-169768

专利文献5：PCT/JP03/15828

专利文献6：特开平-60697号公报

专利文献7：特开平5-286976号公报

非专利文献1：Thompson，E.M.，Nagata，S.& Tsuji，F.I.Vargula  hilgendorfii luciferase：a secreted reporter enzyme for monitoring gene  expression in mammalian cells.Gene 96，257-62(1990)

非专利文献2：Nakajima Y，Kobayashi K，Yamagishi K，Enomoto T  and Ohmiya Y：cDNA cloning and characterization of a secreted luciferase  from the luminous Japanese ostracod，Cypridina noctiluca.Biosci. Biotechnol.Biochem.68，565-70，2004

非专利文献3：Inouye，S.，Ohmiya，Y.& Tsuji，F.Imaging of  luciferase secretion from transformed Chinese hamster ovary cells.Proc  Natl Acad Sci U S A 89，9584-7(1992)

非专利文献4：Tanahashi，Y.，Ohmiya，Y.，Honma，S.，Katsuno，Y.， Ohta，H.，Nakamura，H.，Honma，K.Continuous measurement of targeted  promoter activity by a secreted bioluminescence reporter，Vargula  hilgendorfii luciferase.Anal Biochem.289，260-6(2001)

非专利文献5：Kishi，Y.；Goto，T.；Inoue，S.；Sugiura，S.；Kishimoto， H.Tetrahedron Lett.1996.3445-3450

非专利文献6：Karpetsky，T.P.；White，E.H.J.Am.Chem.Soc. 1971，93，2333-2334

非专利文献7：Nakamura，H.Aizawa，M.Takeuchi，D.Murai，A. Shimomura O.Tetrahedron lett.2000，41，2185.

发明内容

本发明的目的在于，解决现有的光学活性的荧光素的制造方法中 步骤多和收率低的问题，同时确立发光波长不同的荧光素及荧光素的 供给。

本发明提供以下的与海萤荧光素酶反应的新型荧光素(发光基质) 及其制造方法。

1.一种制造通式(2)表示的化合物的方法，其特征在于，使通式(1) 表示的化合物与重氮甲烷化合物反应，然后使氧化剂与选自由醇类及 二醇类构成的组中的至少1种反应，

式中，X表示Cl或Br；R¹和R²相同或不同，表示低级烷氧基、 可被取代的芳烷氧基，或R¹和R²与跟它们结合的碳原子一起表示羰基， 或者R¹和R²一起表示亚烷基二氧基。

2.通式(2)表示的化合物，

式中，R¹和R²相同或不同，表示低级烷氧基、可被取代的芳烷氧 基，或R¹和R²与跟它们结合的碳原子一起表示羰基，或者R¹和R²一 起表示亚烷基二氧基。

3.一种制造通式(4)表示的海萤荧光素或其衍生物的方法，其特征 在于，使通式(2)表示的化合物与通式(3)表示的化合物反应，

式中，R¹和R²相同或不同，表示低级烷氧基、可被取代的芳烷氧 基，或R¹和R²与跟它们结合的碳原子一起表示羰基，或者R¹和R²一 起表示亚烷基二氧基；R³表示可被取代的芳基或可被取代的杂环基； Y¹表示可被取代的低级亚烷基或低级亚烯基；Z¹表示氨基、一低级烷 基氨基、二低级烷基氨基、胍基或脒基、或者由保护基保护的氨基、 胍基或脒基。

4.一种制造通式(7)表示的海萤荧光素类似物的方法，其特征在 于，使通式(5)表示的化合物与通式(6)表示的化合物反应，

式中，R¹和R²相同或不同，表示低级烷氧基、可被取代的芳烷氧 基，或R¹和R²与跟它们结合的碳原子一起表示羰基，或者R¹和R²一 起表示亚烷基二氧基；R³表示可被取代的芳基或可被取代的杂环基； R⁵表示可被氟原子取代的低级烷基、可被氟原子取代的环烷基、5元或 6元的芳香环基或杂环基、芳烷基；Z¹表示氨基、一低级烷基氨基、二 低级烷基氨基、胍基或脒基、或者由保护基保护的氨基、胍基或脒基。

5.通式(7)表示的化合物，

式中，R³表示可被取代的芳基或可被取代的杂环基；R⁵表示可被 氟原子取代的低级烷基、可被氟原子取代的环烷基、5元或6元的芳香 环基或杂环基、芳烷基；Z¹表示氨基、一低级烷基氨基、二低级烷基 氨基、胍基或脒基、或者由保护基保护的氨基、胍基或脒基。

6.一种制造通式(8)表示的海萤荧光素衍生物的方法，其特征在 于，使通式(3)表示的化合物与通式(6)表示的化合物反应，

式中，R¹和R²相同或不同，表示低级烷氧基、可被取代的芳烷氧 基，或R¹和R²与跟它们结合的碳原子一起表示羰基，或者R¹和R²一 起表示亚烷基二氧基；R³表示可被取代的芳基或可被取代的杂环基； R⁵表示可被氟原子取代的低级烷基、可被氟原子取代的环烷基、5元或 6元的芳香环基或杂环基、芳烷基；Y¹表示可被取代的低级亚烷基或 低级亚烯基；Z¹表示氨基、一低级烷基氨基、二低级烷基氨基、胍基 或脒基、或者由保护基保护的氨基、胍基或脒基。

7.通式(8)表示的化合物或其盐，

式中，R³表示可被取代的芳基或可被取代的杂环基；R⁵表示可被 氟原子取代的低级烷基、可被氟原子取代的环烷基、5元或6元的芳香 环基或杂环基、芳烷基；Y¹表示可被取代的低级亚烷基或低级亚烯基； Z¹表示氨基、一低级烷基氨基、二低级烷基氨基、胍基或脒基、或者 由保护基保护的氨基、胍基或脒基；其中，在R³为吲哚基或苯基、Y¹为1，2-亚丙基、Z¹为胍基的情况下，R⁵不是仲丁基。

8.如上述5或7所述的化合物或其盐，其具有比天然海萤荧光素 背景低的特性。

9.如上述5或7所述的化合物或其盐，其特征在于，使其与海萤 荧光素酶反应时的最大发光波长与天然型海萤荧光素不同。

10.由下式表示的化合物或其盐。

11.由下式表示的化合物或其盐。

12.由下式表示的化合物或其盐。

13.由下式表示的化合物或其盐。

14.由下式表示的化合物或其盐。

15.一种海萤荧光素稳定化组合物，其包含海萤荧光素或其类似 物和抗氧化剂。

16.一种保存海萤荧光素或其类似物的方法，其特征在于，将海 萤荧光素或其类似物在抗氧化剂存在下进行保存。

17.一种试剂盒，其用于海萤生物发光体系，其中，包含海萤荧 光素或其类似物和抗氧化剂。

18.至少1种抗氧化剂的用于降低海萤生物发光体系背景的应用。

19.一种测定海萤类生物发光的方法，其特征在于，在海萤荧光 素酶和海萤荧光素或其类似物的生物发光测定系统中，在抗氧化剂的 存在下测定生物发光。

20.如上述15～20所述的方法、组合物或试剂盒，其中，抗氧化 剂选自由抗坏血酸或其盐、异抗坏血酸或其盐、连二亚硫酸或其盐、 亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、半胱氨酸、硫 甘油、丁基羟基茴香醚、多酚、硫代硫酸或其盐、硼氢化碱金属构成 的组。

有益效果

根据本发明，可以用简便的方法制造光学活性的海萤荧光素。这 是因为，通过使通式(2)表示的化合物与通式(3)表示的化合物缩合，可 以在1阶段的反应中以高收率得到作为其目标的通式(4)的光学活性体 (图1)。

本发明的通式(7)、(8)的化合物可以利用海萤荧光素酶使发光波长 位移。

例如，本发明的化合物36的最大发光波长可以位移至390nm，发 出紫外区域的光。通过制作化合物36的类似物，可以容易地合成最大 发光波长为约380nm～约400nm的类似物。这种波长区域的光被各种化 合物吸收，从而可以使各种化学物质(例如抗癌剂、视紫质等)活性化。

而且，当在荧光素或其衍生物的存在下将抗氧化剂、特别是抗坏 血酸或其盐、异抗坏血酸或其盐进行海萤类生物发光测定时，背景降 低，S/N比得到改善。

在细胞內含有海萤荧光素酶(酶)或海萤荧光素酶基因的表达体系 中，为了使荧光素酶稳定，大多配合BSA等白蛋白，但抗坏血酸、亚 硫酸盐(例如Na₂SO₃)等抗氧化剂可以抑制由白蛋白引起的背景的上升。

附图说明

图1表示天然海萤荧光素的现有的合成法与本发明的合成法的比 较。

图2表示本发明的海萤荧光素的最大发光波长。

图3表示本发明的海萤荧光素衍生物的应用例。图3A表示海萤荧 光素酶及海萤荧光素酶和荧光蛋白融合体的发光原理(A1表示海萤荧 光素酶及荧光素类似物36，A2表示海萤荧光素酶和绿色荧光蛋白质的 融合体及荧光素类似物36。)，图3B表示双报告基因检测(测定2个启 动子序列A，B的基因转录活性的基因构筑体)，图3C表示利用双报告 基因检测的发光光谱的变化(I：启动子A活性化了的光谱(仅表达启动 子A)，II：启动子B活性化前的光谱，III：启动子B活性化后的光谱， ↑：随着启动子B活性化，相对发光活性(B/A)增加。)。

具体实施方式

在本说明书中，亚烷基二氧基可列举：亚乙二氧基、亚丙二氧基、 亚丁二氧基、亚戊二氧基、亚己二氧基等碳原子数为2～6、优选碳原子 数为2～4的亚烷基二氧基。

重氮甲烷化合物可列举：重氮甲烷、三甲基甲硅烷基重氮甲烷等。

低级烷基可列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁 基、仲丁基(R⁵的情况，优选光学活性的仲丁基)、叔丁基、戊基、己基 等碳原子数为1～6、优选碳原子数为1～4的直链或具有支链的烷基。

作为被氟原子取代的低级烷基，可列举由氟原子、氢原子和碳原 子构成的氟代低级烷基及由氟原子和碳原子构成的全氟代低级烷基， 作为氟代低级烷基，可列举上述低级烷基中的1个以上(不是全部)的氢 原子被氟原子取代而成的低级烷基。作为全氟代低级烷基，可列举上 述低级烷基中的全部氢原子被氟原子取代而成的低级烷基。作为R⁵表 示的全氟代低级烷基，可列举：CF₃、CF₂CF₃、CF₂CF₂CF₃、CF(CF₃)₂、 CF₂CF₂CF₂CF₃、CF₂CF(CF₃)₂、CF(CF₃)CF₂CF₃、C(CF₃)₃、 CF₂CF₂CF₂CF₂CF₃、CF₂CF(CF₃)CF₂CF₃、CF(CF₂CF₃)₂、 CF(CF₃)₂CF₂CF₂CF₂CF₂CF₂CF₂CF₂CF₃、CF₂CF(CF₃)CF₂CF₂CF₃、 CF(CF₂CF₃)(CF₂CF₂CF₃)、C(CF₃)₂CF₂CF₂CF₃、C(CF₃)(CF₂CF₃)₂等碳原 子数为1～6的直链或具有支链的全氟代烷基，优选可列举碳原子数为 3～6的具有支链的全氟代烷基。

氟代烷基可列举上述全氟代低级烷基中的1个以上(不是全部)的 氢原子被氟原子取代而成的碳原子数1～6的直链或具有支链的氟代烷 基，优选可列举碳原子数为3～6的具有支链的氟代烷基。

环烷基可列举：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环 辛基等碳原子数为3～8、优选碳原子数为5～6的环烷基。

作为被氟原子取代而成的环烷基，可列举由氟原子、氢原子和碳 原子构成的氟代环烷基及由氟原子和碳原子构成的全氟代环烷基，作 为氟代环烷基，可列举上述环烷基中的1个以上(不是全部)的氢原子被 氟原子取代而成的环烷基。作为全氟代环烷基，可列举上述环烷基中 的全部氢原子被氟原子取代而成的环烷基。

R⁵表示的5元或6元的芳香环或杂环基可列举：苯基、吡啶基、 吡咯基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、嘧啶基、吡 嗪基、噻吩基、呋喃基、哒嗪基。

低级烷氧基可列举：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正 丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等碳原子 数为1～6、优选碳原子数为1～4的直链或具有支链的烷氧基。

一低级烷基氨基可列举：甲氨基、乙氨基、正丙氨基、异丙氨基、 正丁氨基、异丁氨基、仲丁氨基、叔丁氨基、戊氨基、己氨基等被碳 原子数为1～6、优选碳原子数为1～4的直链或具有支链的烷基单取代而 成的氨基。

二低级烷基氨基可列举：二甲氨基、二乙氨基、二正丙氨基、二 异丙氨基、二正丁氨基、二异丁氨基、二仲丁氨基、二叔丁氨基、二 戊氨基、二己氨基等被碳原子数为1～6、优选碳原子数为1～4的直链或 具有支链的烷基双取代而成的氨基。

R³表示的杂环基可列举：3-吲哚基、1-异吲哚基、3H-吲哚-2-基、 1H-异吲哚-3-基、3-异喹啉基、1-异喹啉基、(2-、3-或4-)喹啉基、1- 酞嗪基、2-萘啶基、2-喹唑啉基、2-苯并咪唑基、(2-或3-)苯并呋喃、 1-异苯并呋喃、(2-或3-)苯并噻吩、1-异苯并噻吩等1个6元的芳香环(可 以是杂环)和1个5元或6元的环缩合成的杂环基。

杂环基、芳烷基、芳烷氧基、芳基的取代基可列举：卤原子(特别 是氯原子或氟原子)、甲基、乙基、乙酰基、甲氧基、OH、SH、COOH、 氨基、甲氨基、二甲氨基、硝基、氰基、三氟甲基等，可以被1～3个 这些取代基取代。

R³表示的芳基可列举：萘基、苯基、联苯基、蒽基、菲基、芴基、 茚基、非那烯基(Phenalenyl)、苊基、芘基等。

芳烷基可列举：苄基、1-苯乙基、2-苯乙基、1-苯丙基、2-苯丙基、 3-苯丙基、萘甲基等碳原子数为7～12的芳烷基。

芳烷氧基可列举：苄氧基、1-苯乙基氧基、2-苯乙基氧基、1-苯丙 基氧基、2-苯丙基氧基、3-苯丙基氧基、萘甲基氧基等碳原子数为7～12 的芳烷氧基。

Z¹表示的氨基、胍基或脒基的保护基可以广泛例示：叔丁氧羰 (BOC)基、苄氧羰(Cbz)基、Fmoc基等通常的保护基。

Y¹表示的低级亚烷基可列举：CH₂、CH(CH₃)、CH₂CH₂、 CH₂CH(CH₃)、CH(CH₃)CH₂、CH₂CH₂CH₂、CH₂CH(CH₃)CH₂、 CH₂CH₂CH₂CH₂等碳原子数为1～6、优选碳原子数为1～4的亚烷基，低 级亚烯基可列举：CH＝CH、CH＝C(CH₃)、C(CH₃)＝CH、CH＝CHCH₂、 CH＝C(CH₃)CH₂、CH₂CH＝CH、CH＝CHCH₂CH₂等碳原子数为1～6、优 选碳原子数为1～4的亚烯基。

下面，对用路线1表示的化合物2的制造方法进行说明。

<路线1>

(式中，R¹及R²如上述定义所述。)

本制造法是将阿恩特-艾斯特尔特反应设定为主要反应的三步骤。 首先，相对于(+)-2-甲基丁酸(1A)1摩尔，使用1摩尔左右到过量的亚 硫酰氯，在室温下使其反应1～24小时，由此得到酰基氯。接着，当使 用2当量的三甲基甲硅烷基重氮甲烷或重氮甲烷使得到的酰基氯在 0～4℃下反应1～4小时时，得到重氮酮化合物。对得到的重氮酮化合物 而言，使用1当量左右的氧化剂(特别是次氯酸叔丁酯)，在当量或过量 的醇或二醇存在下、使其在0～4℃下反应1～2小时，由此可以得到新型 的光学活性的化合物(2)。另外，R¹和R²为苄氧基的情况，可以在催化 剂量的氧化铂的存在下，通过加氢分解得到通式(2)的化合物(醛体)。

氧化剂可列举次氯酸叔丁酯等。

对R¹和R²而言，随着与氧化剂并用的醇(甲醇、乙醇、正丙醇、 异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇等碳原子数为1～6的直链 或具有支链的低级醇、或苄醇等可以具有取代基的芳烷醇)或二醇(乙二 醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，3-丁二醇、 1，4-丁二醇、2，3-丁二醇等碳原子数为2～6的二醇)而被导入，例如在使 用甲醇时，R¹和R²都为甲氧基，在使用苄醇时，R¹和R²都为苄氧基。 另外，如果并用甲醇和乙醇，则可得到R¹和R²分别为甲氧基和乙氧基 的化合物。

在本发明的1个实施方式中，作为具有取代基的芳烷氧基，可列 举例如：被羟基、低级烷氧基、氰基、硝基、氨基、一低级烷基氨基、 二低级烷基氨基、卤原子(F，Cl，Br，I)、低级烷基、SH、烷硫基(S-低级烷 基)、亚乙二氧基等取代基进行1～3取代而成的芳烷氧基。

<路线2>

(式中，R¹、R²、R³、Y¹及Z¹如上述定义所述。)

对反应而言，通过相对于通式(3)的化合物1摩尔，使用通式(2)的 化合物约1摩尔～约4摩尔，在酸的存在下或不存在下、在约65℃～约 100℃的温度下使其反应1～2小时而有利地进行。

通式(3)的化合物的制造方法用下面的路线3进行说明。

<路线3>

(式中，R³及Z¹如上述定义所述。Y^1a表示CH₂CH₂CH₂。R⁴表示 卤原子、特别是Br或Cl。)

对路线3表示的通式(5)或通式(3)的化合物的制造方法进行说明。

Z¹表示氨基、一低级烷基氨基、二低级烷基氨基、胍基或脒基、 或者由保护基保护的氨基、胍基或脒基，在上述中间体的制造方法中， 优选为被保护的氨基、胍基或脒基。

通式(5)或通式(3)的制造方法将铃木偶联反应设定为主要反应。当 相对于公知的2-氨基-3，5-二卤化氨基吡嗪(9A)1摩尔，使用1摩尔的乙 烯基硼酸试剂(9B)1摩尔，在钯催化剂和碱的存在下使其反应1～2小时 时，可得到烯烃化合物(通式(9))。由得到的通式(9)的化合物通过使用 了R³B(OH)₂的铃木偶联反应可以得到通式(5)的化合物。

另一方面，相对于烯烃化合物(9)1摩尔，在10％摩尔的氧化铂的 存在下，通过加氢而将烯烃还原后，可以同样地通过使用了R³B(OH)₂的铃木偶联反应得到通式(3a)的化合物。

用下述路线4对通式(7)的化合物的制造方法进行说明。

<路线4>

(式中，R¹、R²、R³、R⁵及Z¹如上述定义所述。)

相对于通式(5)的化合物1摩尔使用通式(6)的化合物约1摩尔～约4 摩尔，在酸的存在下或不存在下、在65～100℃的温度下使其反应1～2 小时，由此可得到通式(7)的化合物。

<路线5>

(式中，R¹、R²、R³、R⁵、Y¹及Z¹如上述定义所述。)

相对于通式(3)的化合物1摩尔使用通式(6)的化合物约1摩尔～约4 摩尔，在酸的存在下或不存在下、在65～100℃的温度下使其反应1～2 小时，由此可得到通式(8)的化合物。

本发明的化合物作为海萤荧光素是有用的。

在1个优选的实施方式中，对本发明的化合物而言，使其与海萤 荧光素酶反应时，其最大发光波长与天然型海萤荧光素的相比，向长 波长侧或短波长侧位移15nm以上，因此，可以与海肾荧光素区别测定。

而且，在1个优选的实施方式中，本发明的化合物为稳定的化合 物，且具有低背景的特性。具体而言，本发明的化合物与天然型荧光 素相比，背景减少约5％以上。

在本发明中，通过并用海萤荧光素或其类似物和抗氧化剂，可以 使海萤荧光素或其类似物稳定化。而且，通过在抗氧化剂的存在下进 行包含海萤荧光素酶和海萤荧光素或其类似物的海萤类生物发光的测 定，可以增强发光信号，且降低发光背景，可以大幅度地改善S/N比。

抗氧化剂可列举：抗坏血酸或其盐、异抗坏血酸或其盐、连二亚 硫酸或其盐、亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、 半胱氨酸、硫甘油、丁基羟基茴香醚、多酚、硫代硫酸或其盐、硼氢 化碱金属等，这些抗氧化剂可以单独使用1种或组合使用2种以上。 优选可列举抗坏血酸、异抗坏血酸或其盐。在组合2种以上抗氧化剂 时，优选组合抗坏血酸和至少1种其他抗氧化剂。

作为抗坏血酸盐、异抗坏血酸盐、亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、焦亚 硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐，可列举：钠、钾、锂、铯等碱 金属盐，铵盐，钙、镁等碱土金属盐等。另外，硼氢化碱金属可列举： 硼氢化钠(NaBH₄)、硼氢化钾、硼氢化锂、硼氢化铯等。

在将抗坏血酸添加于海萤生物发光体系中时，其添加浓度优选为 约0.05M～约1M。

包含海萤荧光素或其类似物和抗氧化剂的组合物，在使海萤荧光 素或其类似物(溶液或粉末、颗粒、结晶等固体成分)稳定化方面优选。 在该组合物中，每1重量份海萤荧光素或其类似物，混合抗氧化剂约 40000～约800000重量份。

本发明的海萤荧光素或其类似物被添加于包含海萤荧光素的体系 中，在这种体系中，大多在约0.1％～约1％的白蛋白(HAS或BSA、特 别是BSA)的存在下进行荧光素酶检测。该白蛋白使测定系统中的背景 显著地上升，但当使该测定体系中存在抗坏血酸、亚硫酸钠等还原剂 时，可以显著地抑制由白蛋白引起的背景的上升。

因此，包含海萤荧光素或其类似物和抗氧化剂(特别是抗坏血酸、 亚硫酸盐)的组合物，不仅使海萤荧光素或其类似物在室温下具有保存 稳定性，而且可以在测定时抑制由白蛋白引起的背景上升，因此特别 优选。

实施例

下面，基于实施例，更详细地说明本发明。

实施例1：通式(2A)的化合物(光学活性的1，1-二乙氧基-3-甲基戊 -2-酮)的制造

在光学活性的S-2-甲基丁酸(1g)的CH₂Cl₂溶液中，滴加亚硫酰氯 (1.2ml)。直接在室温下搅拌24小时。将反应液浓缩，得到酰基氯。用 1∶1的THF-乙腈(15ml)使酰基氯溶解，在0℃下加入2M的 TMSCHN₂(10ml)，一小时后将溶液浓缩。用乙醇(10ml)使该溶液溶解， 在0℃下滴加tert-BuOCl(1ml)。在0℃下将反应液搅拌1小时。将反应 液进行浓缩，用硅胶柱进行提纯，得到S-1，1-二乙氧基-3-甲基戊-2-酮 (0.6g，39％)。¹H NMR(500MHz，CD₃Cl)0.86(3H，t，J＝7Hz)，1.08(3H，d， J＝7Hz)，1.24(6H，t，J＝7Hz)，1.31-1.73(2H，m)，2.93(1H，q，J＝7Hz)， 3.51-3.71(4H，m)，4.63(1H，s)；IR(KBr)2955，2871，1727，1486，1367， 1120，1063cm^-1，[α]_D²⁴＝+22(c 1.0二氯甲烷)。

实施例2：使用通式(2A)和通式(10)的化合物制造通式(11)的化合 物(光学活性的海萤荧光素)

在茄形烧瓶(5mL)中加入化合物(10)(10mg)、水(0.1ml)、1，1-二乙 氧基-3-甲基戊-2-酮(0.02ml)、乙醇(0.1ml)，在80℃下加热30分钟。加 入48％HBr(0.02ml)，进一步加热10分钟后，进行减压浓缩。用乙醇使 残渣溶解，用LH-20柱进行提纯，得到化合物(11)(7.1mg，50％)。¹H NMR (500MHz，CD₃OD)0.96(3H，t，J＝7Hz)，1.45(3H，d，J＝7Hz)，1.81-1.99(2H， m)，2.33(2H，quintet，J＝7Hz)，3.17(1H，sextet，J＝7Hz)，3.41(2H，q， J＝7Hz)，3.44(2H，q，J＝7Hz)，7.18-7.21(2H，m)，7.50(1H，d，J＝7Hz)， 8.01(1H，s)，8.07(1H，d，J＝7Hz)，8.44(1H，s)，[α]_D²⁴＝+22(0.046，乙腈-水 -10％TFA：39-60-1)，得到的化合物(11)显示出与天然荧光素相同的活性 (试验例1)。

实施例3：利用通式(12)和通式(10)的化合物制造通式(11)的化合 物(光学活性的海萤荧光素)

在茄形烧瓶(5ml)中加入化合物(10)(11mg)、水(0.2ml)、(+)-仲丁 基乙二醛(0.01ml)、甲醇(0.1ml)，在65℃下加热1小时。在使反应液回 到室温后，加入一滴48％的HBr，进行减压浓缩。用乙醇使残渣溶解， 用LH-20柱进行提纯，得到4mg化合物(11)(31％)。¹H NMR(500MHz， CD₃OD)0.96(3H，t，J＝7Hz)，1.45(3H，d，J＝7Hz)，1.81-1.99(2H，m)， 2.33(2H，quintet，J＝7Hz)，3.17(1H，sextet，J＝7Hz)，3.41(2H，q，J＝7Hz)， 3.44(2H，q，J＝7Hz)，7.18-7.21(2H，m)，7.50(1H，d，J＝7Hz)，8.01(1H，s)， 8.07(1H，d，J＝7Hz)，8.44(1H，s)。

实施例4：通式(13)～(16)的化合物的制造

化合物(13)的合成。

在2-氨基-3，5-二溴氨基吡嗪(1g、4mmol)及乙烯基硼酸试剂(0.8g) 的二烷72ml-饱和Na₂CO₃(24ml)溶液中加入Pd(PPh₃)₄(50mg)。在80℃ 下将混合物加热1小时。冷却后，用乙酸乙酯稀释反应混合物，用食 盐水洗涤，用硫酸钠使其干燥。过滤后进行浓缩，得到粗提取物。用 色谱法提纯粗提取物，得到所希望的生成物(450mg，34％)。¹H NMR (500MHz，CDCl₃)，1.44(9H，s)，3.96(2H，br)，4.69(2H，br)，4.82(1H，br)， 6.40(1H，d，J＝15Hz)，6.87(1H，br)，7.95(1H，s)。

化合物(14)的合成

在化合物(13)(0.4g，1mmol)及1-(苯磺酰)-3-吲哚硼酸(0.73g，2mmol) 的二烷50ml-饱和Na₂CO₃(24ml)溶液中加入Pd(PPh₃)₄(30mg)。在80℃ 下将混合物加热1小时。冷却后，用乙酸乙酯稀释反应混合物，用食 盐水洗涤，用硫酸钠使其干燥。过滤后进行浓缩，得到粗提取物。用 色谱法提纯粗提取物，得到所希望的生成物。将所希望的生成物用8ml 甲醇-二烷溶液溶解，加入5N氢氧化钠(2ml)。在室温下搅拌一夜。 进行后处理后，用色谱法提纯混合物，得到化合物(14)(170mg，46％)。 ¹H NMR(500MHz，CDCl₃)，1.45(9H，s)，4.04(2H，br)，4.55(2H，br)， 4.80(1H，br)，6.61(1H，d，J＝15Hz)，6.94(1H，br)，7.21-7.27(2H，m)， 7.41(1H，d，J＝7Hz)，7.66(1H，d，J＝2.5Hz)，8.41(1H，br)，8.35(1H，s)。

化合物(15)的合成

用TFA(三氟乙酸)溶液使化合物(14)溶解，用1小时进行搅拌并浓 缩。用色谱法提纯浓缩得到的混合液，得到化合物(15)(170mg)。

¹HNMR(500MHz，CD₃OD)3.85(2H，d，J＝7Hz)，6.98-7.17(4H，m)， 7.41(1H，d，J＝7Hz)，7.77(1H，s)，8.28(1H，d，J＝7Hz)，8.34(1H，s)。

化合物(16)的合成

将化合物(15)(150mg，0.6mmol)、吡唑-1-甲脒(175mg)、 DIEA(303mg)的DMF溶液在室温下搅拌一夜。加入乙醚，得到沉淀。 用甲醇使沉淀溶解，通过重结晶得到化合物(16)(95mg，53％)。¹H NMR (500MHz，CD₃OD)4.20(2H，d，J＝7Hz)，7.05-7.17(4H，m)，7.43(1H，d， J＝7Hz)，7.87(1H，s)，8.12(1H，d，J＝7Hz)，8.08(1H，s)。

实施例5：使通式(16)与通式(12)的化合物反应而制造通式(17)的 化合物

化合物(17)的合成

在茄形烧瓶中加入化合物(16)(7mg，22mmol)、水(0.1ml)、化合物 (12)(0.02ml)、乙醇(0.05ml)，在100℃下加热30分钟。加入 48％HBr(0.02ml)，进一步加热10分钟后，进行减压浓缩。用乙醇使残 渣溶解，用LH-20柱进行提纯，得到化合物(17)(3.5mg，39％)。¹H NMR (500MHz，CD₃OD)0.96(3H，t，J＝7Hz)，1.44(3H，d，J＝7Hz)，1.81-1.99(2H， m)，4.20(2H，d，J＝7Hz)，7.18-7.21(4H，m)，7.42(1H，d，J＝7Hz)，7.94(1H，s)， 8.07(1H，d，J＝7Hz)，8.11(1H，s)。

实施例6：通式(10)的化合物的合成

化合物(18)的合成

使化合物(13)(1g，0.3mmol)溶解于乙醇(50ml)中，向其中加入氧化 铂(100mg)。在氢气环境下剧烈搅拌24小时。用垫有硅藻土的玻璃过滤 器对反应液进行抽滤。将滤液进行浓缩，用柱色谱法进行提纯，得到 化合物(18)。(800mg，79％)化合物(18)的物性：¹H NMR(500MHz，CDCl₃) 1.44(9H，s)，2.03(2H，d，J＝7Hz)，2.80(2H，d，J＝7Hz)，3.28(2H，d，J＝7Hz)， 7.95(1H，s)。

化合物(10)用与实施例4表示的化合物(16)的制造方法相同的方法 制造。化合物(10)的物性：¹H NMR(500MHz，CDCl₃)2.03(2H，d，J＝7Hz)， 2.80(2H，d，J＝7Hz)，3.28(2H，d，J＝7Hz)，7.08-7.16(2H，m)，7.41(1H，d， J＝7Hz)，7.90(1H，s)，8.30(1H，s)。

实施例7：使通式(10)的化合物与通式(6)所包含的化合物(19)、 (20)、(21)、(22)、(23)反应，分别合成化合物(24)、(25)、(26)、(27)、 (28)。

化合物(24)的合成：在茄形烧瓶中加入化合物(10)(30mg)、水 (0.4ml)、19(0.030ml)、乙醇(0.2ml)、49％HBr(0.03ml)，在100℃下加热 1小时。使反应液回到室温后，进行减压浓缩。用乙醇使残渣溶解，用 LH-20柱进行提纯，得到化合物(24)(15mg，38％)。¹H NMR(500MHz， CD₃OD)2.33(2H，quintet，J＝7Hz)，2.54(3H，s)，3.31(2H，t，J＝7Hz)， 3.43(2H，t，J＝7Hz)，7.17-7.22(2H，m)，7.47(1H，d，J＝7Hz)，7.98(1H，s)， 8.01(1H，d，J＝7Hz)，8.31(1H，s)；1R(KBr)3376，3175，1661，1550， 1454cm^-1。

化合物(25)可以用与化合物(24)的制造方法相同的方法得到。化合 物(25)的物性：¹H NMR(500MHz，CD₃OD)1.41(3H，t，J＝7Hz)，2.33(2H， quintet，J＝7Hz)，2.95(2H，q，J＝7Hz)，3.35(2H，t，J＝7Hz)，3.43(2H，t， J＝7Hz)，7.16-7.22(2H，m)，7.47(1H，d，J＝7Hz)，7.99(1H，s)，8.02(1H，d， J＝7Hz)，8.35(1H，s)；IR(KBr)3376，3175，1661，1550，1454cm^-1。

化合物(26)可以用与化合物(24)的制造方法相同的方法得到。化合 物(26)的物性：¹H NMR(500MHz，CD₃OD)1.50(6H，t，J＝7Hz)，2.29(2H， quintet，J＝7Hz)，3.32(1H，sextet，J＝7Hz)，3.37(2H，q，J＝7Hz)，3.43(2H，q， J＝7Hz)，7.11-7.14(2H，m)，7.40(1H，d，J＝7Hz)，7.96(1H，s)，7.94(1H，d， J＝7Hz)，8.22(1H，s)；IR(KBr)3376，3175，1655，1548，1452cm^-1。

化合物(27)可以用与化合物(24)的制造方法相同的方法得到。化合 物(27)的物性：¹H NMR(500MHz，CD₃OD)1.03(6H，d，J＝7Hz)，2.18(1H， m)，2.33(2H，quintet，J＝7Hz)，2.78(2H，d，J＝7Hz)，3.35(2H，t，J＝7Hz)， 3.43(2H，t，J＝7Hz)，7.16-7.22(2H，m)，7.47(1H，d，J＝7Hz)，7.99(1H，s)， 8.04(1H，d，J＝7Hz)，8.36(1H，s)；1R(KBr)3376，3175，1661，1550， 1454cm^-1。

化合物(28)可以用与化合物(24)的制造方法相同的方法得到。化合 物(28)的物性：¹H NMR(500MHz，CD₃OD)2.27(2H，quintet，J＝7Hz)， 2.99(2H，t，J＝7Hz)，3.41(2H，t，J＝7Hz)，7.14-7.22(2H，m)，7.43(1H，d， J＝7Hz)，7.87(1H，s)，8.02(1H，s)，8.06(1H，d，J＝7Hz).

实施例8

化合物(30)的合成：在茄形烧瓶中加入化合物(10)(10mg)、水 (0.1ml)、29(0.020ml)、乙醇(0.1ml)、49％HBr(0.01ml)，在100℃下加热 1小时。使反应液回到室温后，进行减压浓缩。用乙醇使残渣溶解，用 LH-20柱进行提纯，得到化合物(30)(6mg，42％)。¹H NMR(500MHz， CD₃OD)2.24(2H，quintet，J＝7Hz)，3.25(2H，t，J＝7Hz)，3.39(2H，t，J＝7Hz)， 4.27(2H，s)，7.10(2H，dd，J＝7Hz)，7.24(1H，t，J＝7Hz)，7.30-7.45(5H，m)， 7.93(1H，dd，J＝7Hz)，7.96(1H，s)，8.27(1H，s)。

化合物(32)的合成：在茄形烧瓶中加入化合物(10)(10mg)、水 (0.1ml)、31(0.020ml)、乙醇(0.1ml)、49％HBr(0.01ml)，在100℃下加热 1小时。使反应液回到室温后，进行减压浓缩。用乙醇使残渣溶解，用 LH-20柱进行提纯，得到化合物(32)(5.0mg，34％)。¹H NMR(500MHz， CD₃OD)1.84(3H，d，J＝7Hz)，2.29(2H，quintet，J＝7Hz)，3.38(2H，t，J＝7Hz)， 3.42(2H，t，J＝7Hz)，4.60(1H，q，J＝7Hz)，7.16(2H，dd，J＝7Hz)，7.24(1H，t， J＝7Hz)，7.32(2H，t，J＝7Hz)，7.40(2H，d，J＝7Hz)，7.43(1H，dd，J＝7Hz)， 7.97(1H，dd，J＝7Hz)，7.98(1H，s)，8.27(1H，s)。

化合物(34)的合成：在茄形烧瓶中加入化合物(10)(10mg)、水 (0.1ml)、33(0.020ml)、乙醇(0.1ml)、49％HBr(0.01ml)，在100℃下加热 1小时。使反应液回到室温后，进行减压浓缩。用乙醇使残渣溶解，用 LH-20柱进行提纯，得到化合物(32)(5.2mg，35％)。¹H NMR(500MHz， CD₃OD)0.99(3H，t，J＝7Hz)，1.84(3H，d，J＝7Hz)，2.32(4H，m)，3.41(2H，t， J＝7Hz)，3.44(2H，q，J＝7Hz)，4.29(1H，t，J＝7Hz)，7.16-7.23(3H，m)， 7.30(2H，t，J＝7Hz)，7.44(2H，d，J＝7Hz)，7.47(1H，dd，J＝7Hz)，7.95(1H，dd， J＝7Hz)，7.97(1H，s)，8.34(1H，s)。

化合物(35)的合成：在化合物(13)(0.2g，0.6mmol)及2-萘硼酸 (103mg，0.6mmol)的二烷50ml-饱和Na₂CO₃(24ml)溶液中加入 Pd(PPh₃)₄(40mg)。在80℃下将混合物加热1小时。冷却后，用乙酸乙 酯稀释反应混合物，用食盐水洗涤，用硫酸钠使其干燥。过滤后进行 浓缩，得到粗提取物。用色谱法提纯粗提取物，得到所希望的生成物。 用1ml的TFA(三氟乙酸)溶液使得到的化合物溶解，搅拌1小时并进行 浓缩。进一步用3.5ml的DMF使三氟乙酸盐化合物溶解，加入吡唑-1- 甲脒(280mg)、DIEA(301mg)，在室温下搅拌一夜。加入乙醚，得到沉 淀。用甲醇使沉淀溶解，并进行重结晶，得到化合物(35)(135mg，70％)。 ¹H NMR(500MHz，CD₃OD)2.21(2H，quintet，J＝7Hz)，2.90(2H，t，J＝7Hz)， 3.37(2H，t，J＝7Hz)，7.46(2H，d，J＝7Hz)，7.50(1H，d，J＝7Hz)，7.86(2H，d， J＝7Hz)，8.01(1H，dd，J＝7Hz)，8.30(1H，s)，8.37(1H，s)。

化合物(36)的合成：在茄形烧瓶中加入化合物(35)(10mg)、水 (0.1ml)、化合物(2A)(0.020ml)、乙醇(0.1ml)、49％HBr(0.01ml)，在100℃ 下加热1小时。使反应液回到室温后，进行减压浓缩。用乙醇使残渣 溶解，用LH-20柱进行提纯，得到化合物(36)(3.5mg，27％)。¹H NMR(500MHz，CD₃OD)0.96(3H，t，J＝7Hz)，1.47(3H，d，J＝7Hz)，1.86(2H， m)，2.35(2H，quintet，J＝7Hz)，3.19(1H，m)，3.43(2H，t，J＝7Hz)，3.48(2H，t， J＝7Hz)，7.55(2H，d，J＝7Hz)，7.90(1H，d，J＝7Hz)，8.01(2H，d，J＝7Hz)， 8.14(1H，d，J＝7Hz)，8.60(1H，s)，8.78(1H，s)。

化合物(37)的合成：在茄形烧瓶中加入化合物(16)(10mg)、水 (0.1ml)、化合物33(0.020ml)、乙醇(0.1ml)、49％HBr(0.01ml)，在100℃ 下加热1小时。使反应液回到室温后，进行减压浓缩。用乙醇使残渣 溶解，用LH-20柱进行提纯，得到化合物(37)(4.4mg，30％)。¹H NMR(500MHz，CD₃OD)1.83(3H，d，J＝7Hz)，4.20(2H，d，J＝7Hz)，4.60(1H， q，J＝7Hz)，7.18-7.32(8H，m)，7.42(1H，d，J＝7Hz)，7.94(1H，s)，8.07(1H，d， J＝7Hz)，8.11(1H，s)。

试验例1：海萤荧光素类的发光光谱性测定

在0.1ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，将海萤荧光素酶(最 终浓度100ng/ml)和海萤荧光素或具有烯烃基的新型海萤荧光素类似物 (化合物(17))混合，测量累计30秒的发光光谱，结果为，化合物(17)的 发光最大波长与天然荧光素相比，向长波长侧位移约15nm。

试验例2：海萤荧光素类的发光光谱的测定

在0.1ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，将海萤荧光素酶(最 终浓度100ng/ml)和新型海萤荧光素类似物(化合物(30)、(32)、(34)、(36)、 (37))混合，测量发光光谱(图2)。

结果可知，海萤荧光素为2位上具有苄基的化合物(30)和2位上具 有仲丁基且6位上具有萘基的化合物(36)时，生物发光波长与天然荧光 素(11)相比，向短波长位移；2位上含有具有支链的苄基的化合物(32)、 (34)与天然荧光素(11)相比，向长波长位移。可以控制以往不能控制的 海萤荧光素酶的发光波长。特别是化合物(36)的发光最大波长显著地向 紫外线区域(390nm)位移，且可以显示出与现有的发光体系不同的发光 色。在该发光最大波长390nm处，几乎不受由海肾荧光素(蓝)或萤荧光 素酶(从黄绿至红色)引起的发光的光干涉，因此，不使用滤光片就可以 测量发光。另外，由于该化合物(36)的发光最大波长与绿色荧光蛋白、 黄色荧光蛋白质的荧光最大波长之差(stokes shift)较大，因此，如果利 用该基质，则由于海萤荧光素酶的发光导致的对荧光蛋白的荧光最大 波长的光干涉降低，因此，适于利用海萤荧光素酶和荧光蛋白质的融 合体对来自蛋白质的活性肽的处理进行定量。

实施例9

在含有或不含0.3M抗坏血酸钠的0.1ml的100mM Tris-HCl缓冲 液(pH7.5)或0.1ml的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)/0.3M的NaCl中， 混入海萤荧光素(最终浓度1μM)，测定10秒钟的发光值(背景)，然后 加入海萤荧光素酶(最终浓度5ng/ml)，测定10秒钟由荧光素酶产生的 发光值。

将结果示于表1。

而且，测定在室温下24小时后的荧光素的活性。将结果示于表2。

如表1所示，含有抗坏血酸钠盐的缓冲体系，S/N至少改善16倍 以上。

另外，由表2所示可知，荧光素在含有0.3M抗坏血酸钠盐的0.1ml 的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，即使在室温下也是稳定的。

[表1]刚添加海萤荧光素后的测定值

[表2]

添加海萤荧光素24小时后的测定值

实施例10：超过24小时的室温下的海萤荧光素的保存

在含有0.3M抗坏血酸钠和0.02M亚硫酸钠的100mM Tris-HCl缓 冲液(pH7.5)中，混入海萤荧光素(最终浓度1μM)和海萤荧光素酶(最终 浓度5ng/ml)，测定10秒钟由荧光素酶产生的发光值。而且，测定在室 温下放置的荧光素在24小时后的生物发光活性。将结果示于表3。

[表3]

由表3所示可知，含有荧光素、0.3M抗坏血酸钠盐和0.02M的 Na₂SO₃的0.1ml的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)与单独的0.3M抗坏 血酸钠盐(实施例9的24小时后，表2)相比，室温下的稳定性进一步提 高。

实施例11：利用作为抗氧化剂的抗坏血酸钠和亚硫酸钠降低BSA 的背景

在没有抗氧化剂的条件下，在含有0.3M抗坏血酸钠、0.3M抗坏 血酸钠和0.02M的Na₂SO₃的100mM Tris-HCl缓冲液/1％BSA(pH7.5) 中，混入海萤荧光素(最终浓度1μM)，测定10秒钟的发光值(背景)， 然后加入海萤荧光素酶(最终浓度5ng/ml)，测定10秒钟由荧光素酶产 生的发光值。将结果示于表4。

[表4]

由表4所示可知，含有荧光素、0.3M抗坏血酸钠盐和0.02M的 Na₂SO₃的0.1ml的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，由BSA引起的发 光背景约降低10倍，S/N之比改善14倍左右。

产业实用性

本发明的海萤荧光素发光基质，可以应用于利用海萤荧光素酶和 海萤荧光素类似物(发光波长不同)的双报告基因检测法等。具体而言：

1.对利用发光最大波长为390～620nm、发出发光波长不依赖于测 定条件的光的2种海萤荧光素酶及海萤荧光素酶和荧光蛋白质的融合 体基因的2种基因转录活性，用分泌到细胞外的蛋白质进行测量的体 系。

2.利用海萤荧光素酶及海萤荧光素类似物反应而发光最大波长达 到390-520nm的发光反应。如果为海萤荧光素类似物36，则最大发光 波长约为390nm(图3A)。

3.利用海萤荧光素酶和荧光蛋白质的融合体及海萤荧光素类似物 反应而发光最大波长达到500-620nm的发光反应。例如，如果为海萤 荧光素酶和GFP，则约为510nm(图3A)。

4.2，3的组合优选最大发光波长相差100nm以上，但如果为30nm， 则可以进行颜色分割，用该组合进行双报告基因检测。

5.在海萤荧光素酶基因上游插入启动子A，在海萤荧光素酶和荧光 蛋白质的融合体上游插入启动子B(图3B)，在将2种基因构筑体在细 胞內转染，转染后培养一定时间，然后向回收的培养液中或培养板上 直接加入海萤荧光素类似物，用彩色滤光片分离，测定两种的发光量， 并测定启动子A、B的活性量(由于不需要进行细胞破碎，因此可以直 接用活的细胞测定基因转录活性)(图3C)。在仅启动子A活性化时，仅 能观察到最大发光波长390nm的发光，但随着启动子B的活性化，在 510nm附近能观察到峰，其增大。发光光谱可以通过滤光片简单地分 离。