重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达

摘要

目的构建重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron,并观察其在非小细胞肺癌细胞株PC-9转染后对萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶表达。方法以双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2中的嵌合体内含子(设计长度为133 bp)为模板,PCR扩增后插入到psiCHECK-2质粒中,即获得重组双荧光素酶报告基因质粒psi-CHECK-2-Intron。取psiCHECK-2-Intron质粒,转染至感受态大肠杆菌中,采用琼脂糖凝胶电泳实验观察目的基因片段长度,并对目的基因片段进行基因测序。将重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron、双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2分别转染至PC-9细胞中,记为转染组、对照组,采用qRT-PCR法检测两组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA,采用双荧光素酶活性实验检测两组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性。结果目的基因片段长度为133 bp,基因序列正确,无突变和缺失,表明重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建成功。转染组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA的相对表达量分别为2.213±0.038、2.004±0.025,对照组分别为1.004±0.012、1.003±0.010,两组相比,P均<0.05。转染组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性分别为2.974±0.099、1.948±0.052,对照组分别为1.000±0.018、1.000±0.020,两组相比,P均<0.05。结论成功构建了重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron;psiCHECK-2-Intron转染PC-9细胞后,细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达均升高。