荧光素酶报告基因

摘要： 目的:建立幼年特发性关节炎10p11.21遗传位点敲除的单克隆细胞系。方法:首先利用自身免疫病致病变异的遗传和表观遗传精细定位平台鉴定10p11.21遗传位点可能的因果变异;通过全表型组关联研究(PheWAS)数据库确定这一位点的因果变异与其他疾病的相关性;荧光素酶报告基因实验来验证候选因果变异是否具有转录调控功能;利用CRISPR/Cas9技术将因果变异所在基因组区域进行敲除。结果:生物信息学分析的结果显示10p11.21遗传位点的单核苷酸多态性(SNP)rs7100025的PICS值为0.7057,可能是这一位点的因果变异;PheWAS数据库检索结果显示rs7100025与多种免疫疾病具有显著相关性;rs7100025具有调控基因转录的功能,正向插入包含G等位基因和A等位基因的rs7100025序列可以提高荧光素酶表达水平,并且G等位基因相较于A等位基因效果更加明显;成功设计构建了删除rs7100025所在基因组区域的guide RNA质粒,并在Jurkat细胞系中将rs7100025位点进行敲除。筛选得到的单克隆细胞系的基因型在Sanger测序中得以验证。结论:精细定位幼年特发性关节炎10p11.21遗传位点可能的因果变异rs7100025(PICS值为0.7057),并成功建立这一变异敲除的单克隆Jurkat细胞系,敲除的片段大小为456 bp。

摘要： Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因,调控自噬起始和自噬体成熟.在肌肉分化过程中,Beclin 1基因表达上调,自噬增加;此外MEK5-ERK5信号活化并调控成肌细胞分化.因此,在肌肉分化过程中,MEK5-ERK5信号通路可能调控Beclin 1基因表达.目的 是阐明MEK5对成肌细胞Beclin 1基因启动子活性的调控.将不同长度Beclin 1启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12.双荧光素酶报告基因检测实验结果显示,含Beclin 1基因起始密码子上游586碱基对DNA片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性.MEK5α显著增加p-354荧光素酶活性,并有剂量依赖性;而MEK5β显著降低p-354荧光素酶活性.MEK5β能够拮抗MEK5α对p-354荧光素酶活性的调控.与MEK5对Beclin 1基因启动子调控结果一致,MEK5αCA上调细胞Beclin 1 mRNA表达,MEK5βDD下调Beclin 1 mRNA表达,并且MEK5βDD抑制MEK5αCA对Beclin 1 mRNA表达的促进作用.此外,转录因子CREB家族成员CREB3,CREBP和CREBL1能够显著上调p-354荧光素酶活性.CREB3呈剂量依赖性显著上调p-354荧光素酶活性,并与MEK5α具有协同效应.MEK5α和MEK5β对Beclin 1启动子具有不同调控作用,CREB可能是其下游效应因子.

摘要： 探讨调控 TFF3的上游 microRNA 在甲状腺乳 头状癌(thyroid papillary carcinoma,PTC)TPC-1细胞系上皮间质转化(EMT)中的作用。分别以lip3000将 miR- 7-5p mimic及其对照(NC)转染 TPC-1细胞建立实验组和对照组,检测 miR-7-5p对细胞恶性生物学行为(增殖、 侵袭、迁移能力)的影响,荧光素酶报告基因验证 miRNA-7-5p与 TFF3的靶向关系;realtime PCR、免疫印迹和 免疫细胞化学技术(ICC)检测 miR-7-5p对 TFF3表达的调节以及对 TPC-1细胞上皮间质化指标及 MAPK 通路 关键蛋白 ERK1/2磷酸化水平影响。

摘要： 单克隆抗体因其具有特异性、高效性以及低毒副作用的特点而在恶性肿瘤、自身免疫疾病以及器官移植排斥的治疗上占据了非常重要的地位,成为众多药企的研发目标.单克隆抗体类药物的体外生物学活性检测是其质量控制中至关重要的一环.单克隆抗体类药物的生物学活性检测方法主要有细胞增殖抑制法、细胞毒性法、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性法(ADCC)、补体依赖的细胞毒性法(CDC)和报告基因法等几类方法.文章根据单克隆抗体类药物的作用特点分别对靶向肿瘤细胞单抗类药物、靶向细胞因子单抗类药物、靶向免疫细胞或者免疫检查点相关分子单抗类药物及抗体偶联药物和双特异性抗体等其他单抗类药物的体外生物学活性的检测方法进行综述.

摘要： 目的克隆并构建葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)启动子的荧光素酶报告基因载体并检测其活性。方法以ZR75-1细胞提取的基因组为模板进行PCR扩增,将获得的GLUT1启动子片段酶切后连接至荧光素酶报告载体pGL4-basic中,重组质粒pGL4-basic-GLUT1经测序正确后与空载体分别转染293T细胞,并检测启动子活性;再将pGL4-basic-GLUT1同myc-HIF1α或对照质粒pXJ-40-myc转染ZR75-1细胞,分别在高糖和低糖条件下培养,检测启动子活性,探讨低氧诱导因子1α(HIF1α)对GLUT1启动子活性的影响。结果DNA测序显示,扩增片段与GLUT1启动子片段的序列一致。荧光素酶活性实验显示,转染pGL4-basic-GLUT1后,GLUT1启动子较对照组有较高活性(P<0.001);低糖条件下,pGL4-basic-GLUT1与myc-HIF1α共转染,GLUT1启动子活性更强(P=0.042)。结论成功构建了GLUT1启动子报告基因载体,明确了HIF1α在高糖和低糖条件下对GLUT1启动子活性的增强作用,为深入研究GLUT1在肿瘤细胞代谢中的作用奠定了基础。

摘要： 建立一种通用型荧光素酶报告基因检测系统.以NF-κB信号通路为基础,用NF-κB-RE-Luc2P慢病毒感染HEK293细胞获得单克隆细胞系,并使用TNF-α 进行了刺激验证;为证明该细胞系具备通用和改造能力进一步感染了FGF家族受体FGFRⅡ,筛选获得单克隆然后用FGF类药物进行刺激验证.结果表明,在TNF-α 刺激实验中,响应值与TNF-α 浓度呈现剂量依赖效应,且信噪比可达100倍以上,表明细胞系建立成功.FGF类药物刺激验证实验中,响应值与药物浓度可拟合成剂量依赖的"S"型曲线,表明该细胞系可用于FGF类药物活性检测.获得了NF-κB-RE-Luc2P HEK293和以此细胞系为基础改造得到的细胞系FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293,由于NF-κB是细胞内众多信号通路的交汇点,因此针对NF-κB信号通路,该细胞系具备通用性.

摘要： 目的:通过构建双荧光素酶报告基因重组质粒验证miRNA-199a-5p(miR-199a-5p)与ECE1基因的靶向调控关系.方法:通过microRNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-199a-5p与ECE1基因3'UTR潜在的互补结合位点,PCR技术扩增ECE1基因3'端非翻译区,将此序列与miR-199a-5p mimics或空质粒(NC)共转染到pmirGLO-ECE1-野生型(WT)的293细胞里;将此序列突变序列与miR-199a-5p mimics或NC共转染到pmirGLO-ECE1-突变型(MUT)的293细胞里,共四组,检测四组细胞中荧光素酶活性.结果:成功构建双荧光素酶报告基因重组质粒pmirGLO-ECE1-WT和pmirGLO-ECE 1-MUT.与野生型NC(4.30±0.53)组及突变型miR-199a-5p mimics组(4.465±0.3968)比较,野生型miR-199a-5p mimics组(1.686±0.4098)荧光素酶活性明显降低,P＜0.05,有显著差异;突变型miR-199a-5pmimics组(4.465±0.3968)与突变型miR-199a-5pNC(4.18±0.498)组及野生型NC(4.30±0.53)组两两比较,P＞0.05,无明显差异.结论:miR-199a-5p与野生型ECE1存在结合位点,miR-199a-5p对野生型ECE1重组质粒荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-199a-5p能够靶向调控ECE1基因.

摘要： 目的：通过构建HIV-Ⅰ型假病毒,建立筛选抗HIV-Ⅰ型病毒药物的平台.方法：通过双质粒转染包被HIV-Ⅰ型假病毒,感染靶细胞,并用药物干预,最终通过检测荧光素酶报告基因的表达量,来评价药物抗HIV-Ⅰ型假病毒的能力.结果：通过双质粒的转染,获得了高浓度的假病毒,并成功构建了筛选药物平台.结论：此次构建的药物筛选平台可以用于筛选抗HIV-Ⅰ型假病毒药物的研究.

摘要： 目的：建立靶向人载脂蛋白A-I（Apo A-I）调控序列的药物筛选模型，为筛选新型抗动脉粥样硬化药物奠定基础。方法：PCR扩增Apo A-I上游调控序列，构建重组的荧光素酶报告基因质粒pGL4-ApoP1～P5，选择pGL4-ApoP2和pGL4-ApoP4转染人肝癌细胞HepG2建立稳定转染细胞株，通过检测荧光素酶的表达活性变化来筛选人Apo A-I基因表达上调剂。结果：利用两个稳定转染细胞株成功建立了人Apo A-I基因表达上调剂筛选模型，应用阳性化合物进行评价，Z因子分别为0.56和0.68，均大于0.5。结论：该筛选模型可有效应用于人Apo A-I基因表达上调剂的高通量筛选。

摘要： 为了将外源蛋白或抗原稳定表达展示于大肠杆菌的外膜上,应用大肠杆菌DY330介导的重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术,将长度为1653bp的荧光素酶报告基因(luc)敲入DY330染色体与外膜蛋白基因lpp、ompA融合表达,定量分析表达于细菌外膜的萤光素酶结果证明:外源萤光素酶蛋白能够与外膜蛋白融合表达于细菌外膜,1pp.ompA-luc融合蛋白表达于细菌外膜效率最高,不会影响细菌的生长繁殖。

摘要： 本发明提供了一种含有肉牛DKK3基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒及其应用，所述质粒包含bta‑miR‑25与牛DKK3结合的靶点，其构建包括设计DKK3基因3’UTR区扩增引物并加入酶切位点Pme I和Xho I，以牛肾细胞(MDBK)cDNA为模板进行扩增，将PCR产物及pmirGLO Vector分别用限制性内切酶Pme I和Xho I进行双酶切，将酶切后纯化的载体pmirGLO Vector和DKK3基因3’UTR片段连接，转化，培养，PCR检测，测序，将测序正确的菌液重新扩大培养，质粒提取等步骤，本发明为筛选调控DKK3表达的miRNAs、评估miRNAs对DKK3表达的调控作用提供了简单易行的工具，具有灵敏度高、速度快和费用低等优点；本发明还为DKK3的表达调控带来了更深层次的认知，能运用于家畜肉质遗传改良分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。

摘要： 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及猪C1QTNF3基因的双荧光素酶报告基因载体及其制备方法与应用。本发明提供猪C1QTNF3基因的双荧光素酶报告基因载体，其包含猪C1QTNF3基因的3'UTR序列。该载体中双荧光素酶报告基因可以作为检测指标，准确、高效地反映猪C1QTNF3的3'UTR序列受调控元件的调控作用。该载体可用于猪C1QTNF3调控元件的筛选和调控机制的研究，具有操作简便、快速、特异性高、准确性高的优势，为挖掘调控C1QTNF3基因表达的miRNA以及猪C1QTNF3基因的功能研究提供了有效的工具和方法。

摘要： 本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，提供了一种绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用。本发明提供的绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体，含有双荧光素酶报告基因载体和TNPO1基因的3’UTR区序列片段，该重组载体可以稳定表达绵羊TNPO1基因，作为一个生物模块用于各种相关技术领域；本发明提供的构建方法操作简便，可以通过筛选基因准确得到带有目的基因的重组载体，并且重组载体可以稳定表达目的基因；本发明提供的重组载体可以用于检测TNPO1基因表达活性，同时筛选得到靶向调控TNPO1基因的miRNA‑21，miRNA‑21负调控抑制TNPO1基因表达。

摘要： 本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，提供了一种绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用。本发明提供的绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体，含有双荧光素酶报告基因载体和CNKSR2基因的3’UTR区序列片段，该重组载体可以稳定表达绵羊CNKSR2基因，作为一个生物模块用于各种相关技术领域；本发明提供的构建方法操作简便，可以通过筛选基因准确得到带有目的基因的重组载体，并且重组载体可以稳定表达目的基因；本发明提供的重组载体可以用于检测CNKSR2基因表达活性，同时筛选得到靶向调控CNKSR2基因的miRNA‑21，miRNA‑21负调控抑制CNKSR2基因表达。

摘要： 本发明提供了一种人DNMT1基因3’‑UTR的荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用，该荧光素酶报告基因载体包括荧光素酶报告基因载体和DNMT1基因的3’‑UTR区核苷酸片段，荧光素酶报告基因载体为pMIR‑REPORT™，DNMT1基因的3’‑UTR区核苷酸片段的核苷酸序列如下所示：该荧光素酶报告基因载体的构建方法，其包括如下步骤：将经限制性核酸内切酶酶切的DNMT1基因的3’‑UTR区核苷酸片段，通过连接酶，连接到经相同的限制性核酸内切酶酶切的荧光素酶报告基因载体中，通过筛选获得人DNMT1基因的3’‑UTR荧光素酶报告基因载体。

摘要： 本发明提供了一种基于猪NLRP6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，属于基因工程技术领域，将NLRP6基因启动子连接到pGL3‑Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体；所述NLRP6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本发明明确了NLRP6基因启动子在NLRP6基因中的具体位置，将NLRP6基因启动子连接到pGL3‑Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体具有转录活性。

摘要： 本发明提供了一种用于监测gtfD和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株、制备方法及其应用，涉及生物学技术领域。本发明所构建的用于监测gtfD和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株能够通过检测荧光素的强弱来判断gtfD和ftf的表达情况，进而通过动态检测这两个基因表达可监测VicK磷酸酶的活性状态，以此来筛查阻断VicK磷酸酶活性的潜在小分子化合物或药物。本发明的荧光素酶报告基因菌株检测流程简单，技术敏感性低，同时能够大大节省检测时间和试剂成本。

摘要： 本发明属于生物工程技术领域。具体涉及一种荧光素酶报告基因iGLuc、基因系统及其应用。所述的报告基因iGLuc的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述的报告基因iGLuc的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的报告基因iGLuc中IL‑1β前体的N端和C端之间的蛋白切割位点能被其它蛋白酶的切割位点替换，然后采用相应的蛋白酶进行切割，能通过荧光素酶的活性水平反映蛋白酶的切割效率，也能反映相应蛋白酶的切割活性，依据此原理构建一种检测蛋白酶切割活性的荧光素酶报告基因系统，及其在检测蛋白酶切割活性中的应用，在通量化筛选蛋白酶抑制剂或激动剂中的应用。

摘要： 本发明公开了一种鸡STRN3基因3’非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明的鸡STRN3基因3’非翻译区的双荧光素酶报告基因的载体为pmiR‑Glo，双荧光素酶报告基因载体包含鸡STRN3基因3'非翻译区序列，该重组载体可以稳定表达鸡STRN3的3'非翻译区序列基因。本发明的鸡STRN3基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体可用于检测STRN3基因3'非翻译区上SNP位点对STRN3基因表达的影响，可用于检测STRN3基因3'非翻译区上SNP位点与miR‑383‑5p的靶向关系以及miR‑383‑5p负调控抑制STRN3基因表达。

摘要： 本发明提供了一种含有肉牛DKK3基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒及其应用，所述质粒包含bta‑miR‑25与牛DKK3结合的靶点，其构建包括设计DKK3基因3’UTR区扩增引物并加入酶切位点Pme I和Xho I，以牛肾细胞(MDBK)cDNA为模板进行扩增，将PCR产物及pmirGLO Vector分别用限制性内切酶Pme I和Xho I进行双酶切，将酶切后纯化的载体pmirGLO Vector和DKK3基因3’UTR片段连接，转化，培养，PCR检测，测序，将测序正确的菌液重新扩大培养，质粒提取等步骤，本发明为筛选调控DKK3表达的miRNAs、评估miRNAs对DKK3表达的调控作用提供了简单易行的工具，具有灵敏度高、速度快和费用低等优点；本发明还为DKK3的表达调控带来了更深层次的认知，能运用于家畜肉质遗传改良分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。