鸡STRN3基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种鸡STRN3基因3’非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明的鸡STRN3基因3’非翻译区的双荧光素酶报告基因的载体为pmiR‑Glo，双荧光素酶报告基因载体包含鸡STRN3基因3'非翻译区序列，该重组载体可以稳定表达鸡STRN3的3'非翻译区序列基因。本发明的鸡STRN3基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体可用于检测STRN3基因3'非翻译区上SNP位点对STRN3基因表达的影响，可用于检测STRN3基因3'非翻译区上SNP位点与miR‑383‑5p的靶向关系以及miR‑383‑5p负调控抑制STRN3基因表达。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸡STRN3基因3’非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用。

背景技术

STRN、STRN3(SG2NA)和STRN4(Zinedin)是Striatin蛋白家族成员，包含多种蛋白质结合区，如凹陷蛋白结合区、卷曲螺旋区、钙调蛋白结合区和WD重复区，这些区域调节钙调蛋白家族二聚化，与多种蛋白包括钙调蛋白和凹陷蛋白紧密关联。Striatin蛋白家族在中央和外周神经系统中高表达，在鼠脑和鼠神经元培养中部分敲低钙调蛋白可分别诱导夜间活动减少和树突细胞生长缺陷，Striatin蛋白同时也在其他组织和细胞系中表达，它们能调控紧密连接蛋白ZO1定位和内皮NO合酶的雌激素诱导激活。Striatin蛋白家族也可以形成蛋白磷酸酶和蛋白激酶的复合物。研究表明，striatin蛋白家族可作为蛋白磷酸2A(PP2A)的调控亚基，调控涉及细胞增殖、分化、凋亡和转化的信号通路。最近研究表明，PP2A全酶包含的纹状蛋白是许多称其为纹状蛋白交联磷酸酶和激酶(STRIPAK)的蛋白质复合物的核心组分。STRIPAK复合物在多数物种中是保守的，被认为在基础生物过程中起着至关重要的作用。

miRNA是一类长度为19-23nt的内源性非编码单链RNA分子，可降解靶mRNA或阻抑翻译，从而完成对靶mRNA的转录调控、参与胚胎发育、器官形成、细胞增殖、分化、凋亡、代谢、病毒感染、肿瘤发生及一系列的生理或病理过程。miRNA通过与靶mRNA的3’UTR不完全碱基配对与靶mRNA相互作用来发挥作用，或者引发靶mRNA降解或者抑制其翻译。研究表明，在哺乳动物和鸡性腺中雌雄二形miRNA可能在性腺发育中起关键作用，包括生殖细胞分化、配子形成和类固醇生成。在动物中，人们认为miRNAs主要通过翻译抑制而不是mRNA降解来发挥作用，对在胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中差异表达miRNA的转录组测序分析揭示了miRNA功能的重要线索，并表明一些miRNAs可以下调大量的mRNA。

miR-383是近年来癌症领域研究中较为热门的一种miRNA，认为它的表达水平与多种癌症的恶性程度呈显著负相关。miR-383-5p是miR-383的主要成熟体，因而研究其对细胞凋亡和增殖的影响对肿瘤相关研究具有重要参考价值。许多研究结果表明，miR-383-5p在髓母细胞瘤、胶质瘤、肝癌细胞、结肠癌细胞中都存在表达异常下调的现象。还有研究发现，在成熟停滞型男性不育患者和雄性不育动物的睾丸组织中，miR-383-5p的表达同样出现异常下调的现象，同时生精细胞呈现过增殖状态。

综上可知，miR-383-5p和STRN3在机体调控过程中起着至关重要的作用，然而，miR-383-5p和STRN3在基因和信号通路调控机制的相关研究还未见报道。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供了一种鸡STRN3基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用。

本发明目的是通过以下方式实现：

本发明提供了一种鸡STRN3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体，所述鸡STRN3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体含有双荧光素酶报告基因载体和STRN3基因的3’UTR区核苷酸片段。

进一步地，所述双荧光素酶报告基因载体为pmiR-Glo。

进一步地，所述STRN3基因的3’UTR区核苷酸片段的核苷酸序列如下所示：

gagggaacgcgtcactgccatcgataaggttaccaataagacactacgtctgatctgcctgagtgaaggctcttaagtggggcaggtttcagttggtgaagcgtatgtctgttctttaggtgtctttatgcaaacgtggagtctgatcttacaaaagacttttattttggactctgtgtgctgccttagggttaggaatgaatacaataaagtattttttctagtcttccacaaaacttttctgatcagtttgcgagttttgatgagttttgtaaggtttctgttttacaaactatgaat。

进一步地，所述STRN3基因的3’UTR区核苷酸片段能够通过碱基互补配对与miR-383-5p结合。

本发明还提供了上述鸡STRN3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体的构建方法，主要包括以下步骤：将经限制性核酸内切酶酶切的STRN3基因3’UTR区核苷酸片段，通过连接酶，连接到经相同的限制性核酸内切酶酶切的双荧光素酶报告基因载体中，通过筛选获得鸡STRN3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体。

进一步地，通过PCR扩增得到所述STRN3基因的3’UTR区核苷酸片段，所述PCR扩增所用的引物oligo包括：

STRN3-3'UTR—oligo-1:5’-TCTAGTTGTTTAAACGAGCTCGAG-3’；

STRN3-3'UTR—oligo-10:5’-CAGGTCGACTCTAGACTCGAGATTCATAGTT

TGTAAAACAGAAACCTTACAAAACTCA-3’。

进一步地，所述STRN3-3’UTR-oligo-1含有SacI限制性内切酶的酶切位点；所述STRN3-3’UTR-oligo-10含有XhoI限制性内切酶的酶切位点。

进一步地，所述双荧光素酶报告基因载体为经过SacI和XhoI限制性内切酶双酶切的pmiR-Glo。

进一步地，所述连接酶为T4DNA连接酶，连接条件为22℃连接2小时。

本发明还提供了上述鸡STRN3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体在检测鸡STRN3基因表达活性中的应用。

本发明还提供了上述鸡STRN3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体在筛选miRNA靶基因的应用。

本发明还提供了上述鸡STRN3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体在检测miRNA调控鸡STRN3基因的调控机制上的应用。

进一步地，所述miRNA为miRNA-383-5p。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

1、本发明通过SacI和XhoI双酶切pmiR-Glo质粒后回收酶切产物，将STRN3基因3’UTR区核苷酸片段克隆至萤火虫荧光素酶luc基因的下游，构建可用于在不同组织来源的细胞中分析STRN3基因的3’UTR序列，该载体可稳定表达鸡STRN3基因，同时双荧光素酶报告基因可作为检测指标反映鸡STRN3基因的表达量，可用于研究STRN3基因3’UTR细胞特异性机制。

2、本发明提供的鸡STRN3基因双荧光素酶报告载体可用于检测STRN3基因3'非翻译区上SNP位点对STRN3基因表达的影响，可用于检测STRN3基因3'非翻译区上SNP位点与miR-383-5p的靶向关系，miR-383-5p负调控抑制STRN3基因表达。

3、本发明提供的鸡STRN3基因双荧光素酶报告载体及其制备方法还可用于筛选候选miRNA预测靶基因，并对miRNA在细胞水平上调控预测的靶基因的调控机制进行研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1：miR-383-5p与预测靶基因STRN3基因3’UTR区碱基互补茎环结构图。

图2：STRN3-3’UTR区片段PCR电泳结果图，其中，1：突变型，398bp；2：野生型，378bp。

图3：pmiR-Glo载体的结构示意图。

图4：鸡STRN3基因双荧光素酶报告载体双酶切电泳结果图。

图5：野生型鸡STRN3基因双荧光素酶报告载体测序结果图。

图6：突变型鸡STRN3基因双荧光素酶报告载体测序结果图。

图7：miR-383-5p mimics对293T细胞荧光素酶表达的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

实施例1：miR-383-5p靶基因预测

利用miRDB、TargetScan和miRanda这三个网站来预测miR-383-5p靶基因，求其交集并根据与靶基因3’UTR碱基互补配对原则、得分及研究重点，miR-383-5p筛选得到STRN3基因，其与miR-383-5p的结合位点为AGACUAGA。在线预测结果显示，靶基因分别与差异表达miRNA gga-miR-383-5p的结合位点是高度保守和稳定的。利用Targetscan、RNAhybrid软件预测miR-383-5p与靶基因3’-UTR的结合位点和碱基互补茎环结构。

实施例2：通过PCR方法得到STRN3基因3’UTR序列片段

1、根据GenBank中的鸡STRN3基因序列(XM015287636.1)中的3’UTR区，截取miR-383-5p与STRN3基因3’UTR结合位点附近100bp，合成引物oligo序列，STRN3-gga383野生型基因上下游引物分别加上SacI和XhoI酶切位点及保护碱基，STRN3基因3’UTR扩增的引物oligo序列如下：

表1STRN3基因3’UTR扩增的引物oligo序列

引物由苏州吉玛基因股份有限公司合成；

2、将表1的引物oligo分别溶解配制成50μM引物oligo溶液，分别取相同体积的上述引物oligo溶液至1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix；

3、以此配制好的oligo mix为模板，进行第一轮PCR反应，PCR体系如下：

循环条件：

4、以第一轮PCR反应的产物为模板，用oligo-1和oligo-10进行第二轮PCR反应；

PCR体系如下：

循环条件：

第一轮PCR可得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物，再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带；

5、PCR反应完成后，利用Agarose电泳并切胶回收STRN3-gga383野生型基因片段。

实施例3：鸡STRN3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体的构建

1、用SacI和XhoI对STRN3-gga383野生型基因片段进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：

2、用SacI和XhoI对基因载体P-miRGLO(见图3)进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：

3、电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收STRN3-gga383野生型基因片段和载体P-miRGLO；

4、用T4 DNA ligase连接双酶切得到的STRN3-gga383野生型基因片段和线性化的基因载体P-miRGLO，22℃连接2小时，连接体系如下：

5、将连接产物转化感受态细胞；

6、从平板上挑取克隆菌落，提取质粒并做鉴定挑出阳性克隆；

7、重组质粒测序验证，将测序正确的野生型重组载体命名为STRN3-WT。

实施例4：突变型鸡STRN3基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体的构建

1、引物oligo设计，STRN3-gga383突变型基因上下游引物分别加上SacI和XhoI及保护碱基，用于目的基因的克隆，设计突变，将靶序列中的TCTGATC突变为AGACATG，其他引物oligo序列同野生型引物。按照实施例2，3所述步骤构建鸡STRN3-gga383突变型双荧光素酶报告基因载体，对重组载体进行测序验证，结果如图5和图6所示，成功将靶序列TCTGATC突变为AGACATG，将测序正确的突变型重组载体命名为STRN3-MT。

实施例5：细胞转染实验

将生长状态良好的293T细胞以2×10

各试验组设3个平行孔，每组试验重复3次。转染细胞分组如下：①转染pmirGLO(空质粒组)；②共转染pmirGLO(空质粒)+NC(阴性对照)；③共转染STRN3-WT+NC；④共转染STRN3-WT+miR-383-5p mimics；⑤共转染STRN3-MT+NC；⑥共转染STRN3-MT+miR-383-5pmimics。

实施例6：双荧光素酶活性测定与统计分析

细胞转染48h后，收集细胞，检测细胞内双荧光素酶报告活性。各试验组设3个平行孔，每组试验重复3次。具体步骤为：去除旧培养基，PBS清洗2次，加入250μL稀释好的1×PLB(被动裂解缓冲液)，置于水平摇床室温下晃动15min，使细胞被动裂解，得到裂解液，在EP管中加入100uL LARII(荧光素酶检测试剂II)，加入20μl上述裂解液，混合均匀后，检测萤火虫荧光素酶的活性，检测后，在原管中迅速加入100μL Stop&Glo Reagent，混匀检测海肾荧光素酶活性，计算两者比值。

所有数据以均数±标准差表示。所有统计分析，p<0.05是显著的。使用GraphPadPrism软件对所有统计显著性进行单因素方差分析和t检验。各试验组设3个平行孔，每组试验重复3次。

双荧光素酶活性检测结果可知，STRN3-WT+miR-383-5p mimics组的293T细胞组荧光素酶活性与其余各组相比显著降低了46％左右(P<0.01)，在统计学上具有极显著差异，其余5组无显著差异。

上述结果表明，miR-383-5p可以抑制STRN3-3'UTR荧光素酶报告基因载体的活性，主要是因为miR-383-5p与STRN3-3'UTR荧光素酶报告基因载体中的STRN3-3'UTR存在相互作用；而对STRN3-3'UTR荧光素酶报告基因载体中的STRN3-3'UTR进行定点突变后，miR-383-5p与突变后的STRN3-3'UTR荧光素酶报告载体的相互作用消失，同时也进一步证明miR-383-5p对STRN3-3'UTR的调控作用，同时，STRN3-3'UTR荧光素酶报告基因载体能够用于分析检测miR-383-5p，基于miR-383-5p和STRN3均与鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程密切相关，为研究此过程中基因和信号通路调控机制奠定基础。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林省农业科学院

<120> 鸡STRN3基因3'UTR的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用

<130> 20210316

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagggaacgc gtcactgcca tcgataaggt taccaataag acactacgtc tgatctgcct 60

gagtgaaggc tcttaagtgg ggcaggtttc agttggtgaa gcgtatgtct gttctttagg 120

tgtctttatg caaacgtgga gtctgatctt acaaaagact tttattttgg actctgtgtg 180

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