酵母双杂交

摘要： MAPKKs是促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应主要成员之一,位于该级联反应通路中间,对信号传递起着收集和发散的关键作用。有研究表明马铃薯StMAPKK4基因响应干旱胁迫,为进一步探究该基因的生物学功能,本研究对StMAPKK4基因进行了生物信息学分析。结果表明,StMAPKK4与科民茄亲缘关系最近。其含有蛋白激酶家族的Protein kinase domain(PF00069)结构域,位置定位于64~302 aa之间。StMAPKK4含有多个激素(茉莉酸甲酯、乙烯、脱落酸、ABA)及胁迫相关响应元件。qRT-PCR分析结果表明,StMAPKK4基因在马铃薯茎中表达量最高,且在干旱及盐处理下均上调表达。亚细胞定位表明该基因定位于细胞膜上。利用酵母双杂交方法筛选出8个与StMAPKK4相互作用的蛋白,并通过回转试验验证了其互作的真实性。对互作蛋白进行Blast比对结果显示,StMAPKK4与多酚氧化酶、藻蓝蛋白、天冬氨酸转氨酶、渗透素、磷酸盐转运蛋白等多种蛋白互作,初步判断StMAPKK4可能参与光合作用响应机制、植物体低温、干旱及盐胁迫等一系列非生物胁迫、促进根系对磷元素的吸收等生理生化过程。

摘要： 自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是指植株的雌蕊对自身花粉和异体花粉进行识别从而抑制自身花粉萌发的特性,PUB(Plant U-Box)蛋白在植物抗逆及信号转导过程中起着重要的作用.本研究通过分析甘蓝自花授粉0～60 min的柱头转录组数据,筛选到1个受自花授粉诱导上调表达的PUB蛋白编码基因BoPUB9.BoPUB9 cDNA序列长度为1368 bp,gDNA序列全长1720 bp,含有1个臂重复结构域和1个U-box结构域.荧光定量PCR结果显示,BoPUB9基因在甘蓝的不同组织中均有表达,在萼片中的表达量最高,花瓣、雄蕊、柱头表达量次之,在花粉花蕾中表达量相对较低,同GUS染色结果保持一致.BoPUB9基因在自花授粉0～30 min内快速上调表达,15 min后为异花授粉后表达量的20多倍,在30 min后达到差异最大,自花授粉后的表达量为异花授粉的40多倍.亚细胞定位结果显示,BoPUB9蛋白在细胞核和细胞质中均有表达,且BoPUB9蛋白在大肠杆菌中被成功诱导表达,相对分子质量为51 kD,与预测结果一致.酵母双杂交与poll-down结果显示,SRK胞内域与PUB9蛋白存在相互作用.推测BoPUB9可能是一种参与甘蓝自交不亲和反应过程的新基因,这为甘蓝自交不亲和的进一步研究和利用提供了新内容.

摘要： 自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是指植株的雌蕊对自身花粉和异体花粉进行识别从而抑制自身花粉萌发的特性,PUB(Plant U-Box)蛋白在植物抗逆及信号转导过程中起着重要的作用。本研究通过分析甘蓝自花授粉0~60 min的柱头转录组数据,筛选到1个受自花授粉诱导上调表达的PUB蛋白编码基因BoPUB9。BoPUB9 cDNA序列长度为1368 bp,gDNA序列全长1720 bp,含有1个臂重复结构域和1个U-box结构域。荧光定量PCR结果显示,BoPUB9基因在甘蓝的不同组织中均有表达,在萼片中的表达量最高,花瓣、雄蕊、柱头表达量次之,在花粉花蕾中表达量相对较低,同GUS染色结果保持一致。BoPUB9基因在自花授粉0~30 min内快速上调表达,15 min后为异花授粉后表达量的20多倍,在30 min后达到差异最大,自花授粉后的表达量为异花授粉的40多倍。亚细胞定位结果显示,BoPUB9蛋白在细胞核和细胞质中均有表达,且BoPUB9蛋白在大肠杆菌中被成功诱导表达,相对分子质量为51 kD,与预测结果一致。酵母双杂交与poll-down结果显示,SRK胞内域与PUB9蛋白存在相互作用。推测BoPUB9可能是一种参与甘蓝自交不亲和反应过程的新基因,这为甘蓝自交不亲和的进一步研究和利用提供了新内容。

摘要： 【目的】揭示水稻化感抗(耐)稗草的转录调控机制,为遗传修饰改良水稻化感性状做铺垫,也为杂草的防控提供新途径。【方法】利用SMART技术,通过同源重组方式,在Y2H菌株中构建水稻受稗草胁迫的酵母cDNA文库;利用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ构建OsMYB57 C端缺失的pGBK-OsMYB57诱饵载体,按照Yeastmaker^(TM) Yeast TransformationSystem 2操作检测诱饵自激活活性;用酵母双杂交技术筛选OsMYB57互作蛋白,将所得互作蛋白的编码序列构建至pGAD载体,并与诱饵载体共转化Y2HGold菌株验证蛋白互作,再以BiFC技术进一步验证蛋白间的互作。【结果】酵母cDNA文库库容量为1.36×10^(7) CFU/mL,插入片段在250~2000 bp,平均长度大于1000 bp,重组率为100%,库容量大且质量良好;筛选出4个有注释的互作蛋白,分别是16号RZFP34、50号4HTR、51号BM1PD和74号GTP1;回转验证及BiFC结果显示RZFP34、4HTR、BMIPD、GTP1与OsMYB57在植物细胞中相互作用,其中RZFP34是一个E3亚型泛素连接酶,在植物中响应非生物逆境胁迫应答,且水稻OsRZFP34基因启动子区含有与水稻化感调控有关的水杨酸和茉莉酸等激素响应及MYB转录因子结合域相关元件。【结论】RZFP34通过与OsMYB57互作参与水稻化感转录调控而发挥作用。

摘要： 采用TRIzol法提取绵羊卵巢组织总RNA,运用RT–PCR技术扩增绵羊微管解聚蛋白基因(STMN1)的编码区序列;通过同源重组技术构建重组诱饵表达载体p GBKT7–STMN1,鉴定该诱饵蛋白在酵母双杂交系统中的自激活活性、细胞毒性和表达情况;利用诱饵质粒p GBKT7–STMN1从绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交cDNA文库筛选互作的宿主蛋白。结果显示:成功构建重组诱饵质粒p GBKT7–STMN1,并对酵母细胞无自激活活性和细胞毒性作用,且能在酵母细胞中正常表达;筛选获得12个与STMN1相互作用的克隆,经测序比对分析和点对点验证,得到CREB和FOXM1共2个互作的宿主蛋白,这2个蛋白可能参与调控细胞的增殖、周期、凋亡等过程。

摘要： [目的]探究葡萄WDR1蛋白的作用机理,丰富原花青素和花青苷物质合成调控机理。[方法]采用PCR技术克隆葡萄WDR1基因CDS区,运用生物信息学分析对其编码蛋白理化性质、亲疏水性、信号肽及跨膜结构域、二级结构、三级结构、保守结构域等进行预测;将VvWDR1的CDS全长克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,转化酵母感受态细胞并进行毒性及自激活检测分析;通过酵母双杂系统对葡萄WDR1与MYBPA2、MYC2蛋白互作机制进行研究。[结果]WDR1基因cDNA全长1011 bp,编码366个氨基酸,分子量37.8 kD,等电点5.07,分子式为C1671H2588N458O518S11;无信号肽且不具有跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构中无规则卷曲39.29%,β-折叠26.79%,α-螺旋22.02%,β-转角11.90%;该蛋白含有5个WD40基序。同时对葡萄WDR1蛋白进行系统进化分析,发现与PhAN11、AtTTG1的同源性较高;成功构建表达载体pGBKT7-WDR1、pGBKT7-MYC2、pGADT7-MYC2,并鉴定出VvWDR1在酵母细胞中无自激活活性且无毒性;酵母双杂交试验结果显示,共转化pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYBPA2与pGBKT7-WDR1/pGADT7-MYC2的酵母菌可以在SD/-Trp-Leu-His-Ade的四缺培养基上正常生长。[结论]克隆得到葡萄WDR1基因,对其进行生物信息学分析,且通过酵母双杂交证明VvWDR1与VvMYBPA2、VvMYC2编码的蛋白之间存在相互作用。

摘要： MYB102转录因子在番茄响应低温胁迫中起着重要作用,为了进一步探究番茄转录因子MYB102的分子作用机理,筛选其蛋白,以“Bolgogragsky”为材料,从番茄的根、茎、叶、花、果以及萼片组织中提取总RNA,以其为模板合成双链cDNA,纯化后与载体pGADT7-Rec共转化入酵母Y187感受态细胞中构建酵母双杂交cDNA文库。经测定,文库容量为2.31×10^(7) CFU,cDNA文库的转化效率为7.02×10^(6) CFU/μg,文库滴度为2.5×10^(8) CFU/mL,重组率为97%,插入的cDNA片段长度主要分布在250~2000 bp。结果表明,构建的番茄cDNA文库符合酵母双杂交文库要求,可用于筛选MYB102的互作蛋白。

摘要： 为进一步探索波形蛋白(vimentin)调控绒山羊绒毛生长的作用机制,以内蒙古遗传种子资源阿尔巴斯白绒山羊皮肤中的毛囊组织为材料,利用PCR技术和酵母双杂交技术对根据GenBank中山羊的vimentin蛋白序列,运用蛋白质互作在线软件预测和液相色谱质谱联用采集免疫共沉淀数据筛选出肌动蛋白(ACTB)和vimentin进行基因引物设计、克隆、酵母表达载体构建和蛋白互作鉴定。结果显示:成功克隆出绒山羊vimentin基因CDS区序列的长度为1 401 bp, ACTB基因CDS区序列的长度为1 128 bp;构建了酵母表达载体;试验组共转化pGBKT7-vimentin与pGADT7-ACTB的Y2HGold菌株在二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基和四缺板SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-GaL/AbA培养基上,均能生长出淡蓝色菌落,而在对照组共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基上长出白色菌落,表明共转化的pGBKT7-vimentin与pGADT-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac被激活,共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac未被激活。提示:vimentin与ACTB两种蛋白间存在相互作用。

摘要： 【目的】分析布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的蛋白结构及细胞定位,筛选宿主细胞内与其存在相互作用的靶蛋白,为后续研究BPE005的生物学功能奠定基础。【方法】通过生物信息学软件对BPE0005的蛋白结构进行初步分析;构建PDRRED2-C1-BPE005重组荧光定位载体,转染人胚肾上皮细胞293T,通过扫描激光共聚焦显微镜观察BPE005的细胞定位;构建PGBKT7-BPE005诱饵载体,验证诱饵载体是否有细胞毒性和自激活现象;以小鼠巨噬细胞RAW264.7 mRNA的cDNA文库为AD文库菌液,检测文库滴度,通过酵母双杂交系统筛选宿主细胞内与BPE005相互作用的靶蛋白。【结果】布鲁氏菌分泌蛋白BPE005属于疏水性蛋白,内含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链。成功构建PDRRED2-C1-BPE005荧光定位载体和PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体,BPE005定位于宿主细胞核。PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体无酵母细胞毒性和自激活现象,AD文库菌液滴度>2×10^(7)/mL,筛选出4个宿主细胞内与BPE0005存在相互作用的蛋白:RNA聚合酶Ⅱ多肽G、补体因子H、鸟苷酸环化酶2G及颗粒蛋白。经复筛、测序、BLAST比对、一对一验证后,最终筛选出1个在宿主细胞内与BPE005具有较强相互作用的靶蛋白(RNA聚合酶Ⅱ多肽G)。对该蛋白的作用网络分析表明,RNA聚合酶Ⅱ多肽G对宿主细胞内mRNA的转录和合成具有重大影响。【结论】布鲁氏菌分泌蛋白BPE005定位于宿主细胞核,在宿主细胞内可与RNA聚合酶Ⅱ多肽G产生较强相互作用,对进一步阐明布鲁氏菌感染过程中关键效应分子的作用机制具有指导意义。

摘要： 【目的】BLH基因家族是广泛存在于植物中的转录因子,其与KNOX等转录因子的互作被认为在植物的次生壁发育中起重要调控作用。本研究拟克隆光皮桦BlBLH1基因,分析其表达模式,并筛选能与其互作的蛋白。【方法】利用Blast等软件在光皮桦基因组序列中鉴定获得BlBLH1序列,克隆验证后对其进行多序列比对、系统进化等生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析BlBLH1在光皮桦不同组织、器官和应拉木形成中的表达模式;通过酵母双杂交技术筛选BlBLH1互作的蛋白,并采用双分子荧光互补实验(BiFC)进一步验证其与部分蛋白在拟南芥细胞内的互作。【结果】BlBLH1基因序列全长为2128 bp,开放阅读框(ORF)为1830 bp,编码609个氨基酸,具有SKY、BEL和HD 3个保守结构域。系统进化分析显示,BlBLH1与拟南芥BLH1有最近的同源关系。表达分析显示BlBLH1在雄花序中的表达量最高;在木质化茎段中的表达量次之;在应拉木诱导过程中,BlBLH1在应拉木中的表达量均显著高于对照。通过酵母双杂交筛选获得结构蛋白、酶、转录因子等47个与BlBLH1互作较强的蛋白;BiFC验证结果表明,BlBLH1与BlKNOX4、BlKNOX9在拟南芥原生质体内存在互作关系。而且,三者在茎段和应拉木的表达趋势基本一致。【结论】可从光皮桦中分离获得BlBLH1基因,生物信息学、表达和蛋白互作分析的结果表明BlBLH1参与光皮桦木材形成过程,且存在与KNOX蛋白的互作关系。

摘要： 蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起的反刍动物虫媒(如库蠓、伊蚊等)传染病.蓝舌病病毒基因组由10个大小不同的双股RNA组成,分别编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4).其中VP2蛋白由L2基因(2900bp左右)编码,以三聚体的形式存在;VP5蛋白是由M6基因(1639bp)编码,也以三聚体形式存在,VP5蛋白比较保守,是BTV的另一个型特异性抗原,它与VP2共同决定BTV的血清型;VP7蛋白是由S7基因(1156bp)编码的,它高度保守,是BTV的主要核心粒子,含有群特异性抗原决定簇.本实验分别构建了酵母双杂交系统中三个诱饵质粒pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP5与pGBKT7-VP7,并验证其自激活和毒性作用,为今后利用绵羊肾细胞的cDNA文库筛选互作蛋白,以及开展BTV与宿主细胞的相互作用研究奠定了基础.本实验所构建的三个诱饵质粒经验证均无自激活活性和毒性作用，以期进一步筛选与其相互作用的宿主细胞靶蛋白并研究其在病毒感染和致病性方面所起的重要作用，为今后利用酵母双杂交系统筛选相关蛋白，深入研究BTV的侵染机制奠定了基础。

摘要： 酵母双杂交技术自提出至今，在基因和蛋白质研究中已得到广泛应用，并取得了许多有价值的结果。除了在酵母中应用外，此项技术已扩展到哺乳动物和植物细胞的研究中汹3。用酵母双杂交技术鉴定的多种受体、转录因子、蛋白激酶、磷酸化酶、肿瘤发生蛋白、细胞骨架蛋白以及参与细胞周期调控的因子举不胜举。但从总体来说，此项技术在免疫、细胞、动物、医学等领域中的应用明显多于植物，国内在这方面的研究尤为欠缺。迄今，人们对植物的生长、发育以及一系列生理过程中的许多问题尚不明确。随着酵母双杂交技术的不断发展和完善，必将会推动这些问题的解决。在经典的酵母双杂交理论基础之上，科学家们又发展了酵母单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系统和核外双杂交系统以及哺乳动物杂交系统等衍生系统，使酵母双杂交系统在研究蛋白这一领域能够充满活力。随着酵母双杂交系统及其衍生系统在各个领域应用的不断深入，相信该系统将在生命研究过程和分子生物学发展中发挥越来越重要的作用。

摘要： 采用同源克隆技术获得侵染甘蔗的高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将以上基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKT7-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供了基础.

摘要： 为了解猪附红细胞体的感染机制,本试验利用酵母双杂交方法,筛选与猪附红细胞体α-烯醇化酶相互作用的宿主蛋白.采用定点突变引物和Overlap-PCR方法扩增猪附红细胞体α-Eno基因的全长序列,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒转化至酵母菌株Y2H中,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活现象,利用酵母双杂交系统从猪外周血单个核细胞(PBMC)文库中筛选与α-Eno相互作用的宿主蛋白.结果显示,构建的诱饵载体pGBKT7-α-Eno无毒性作用和自激活现象.以pGBKT7-α-Eno为诱饵,筛选共获得了4个与α-Eno蛋白存在相互作用的宿主蛋白:β-肌动蛋白、前导丛生蛋白、60S核糖体蛋白L11、核酸内切酶/反转录酶.本试验通过酵母双杂交技术筛选出与猪附红细胞体α-Eno相互作用的多种宿主蛋白,为进一步研究猪附红细胞体的感染机制奠定了基础.

摘要： 为筛选猪附红细胞体α-烯醇化酶与宿主互作的靶蛋白,本试验构建了可以用于酵母双杂交技术筛选的α-烯醇化酶的诱饵载体pGBKT7-Eno.采用Overlap-PCR技术从感染猪附红细胞体血液DNA中扩增了Eno基因全长序列,定向克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组诱饵载体转化酵母Y2H,并验证其在酵母细胞中毒性作用和有无自激活现象.结果显示,本试验成功构建了诱饵载体pGBKT7-Eno,并证明其对酵母细胞无毒性,且对报告基因无自激活.表明诱饵载体pGBKT7-Eno可用于酵母双杂交系统筛选与α-烯醇化酶相互作用的宿主蛋白.

摘要： 为构建应用于酵母双杂交系统的牛肝脏组织cDNA文库,试验提取牛肝脏组织的总RNA,运用SMA-RT和LD-PCR技术合成cDNA,并与文库线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187中,构建酵母双杂交c-DNA文库.文库滴度高达5×108cfu/mL,插入片段集中在1-2 kb之间,具有较好的多态性,随机挑取的20个克隆测定重组率为90％.较高的库容量、较长的插入片段以及较高的重组率保证了文库的完整性和覆盖度.本试验为进一步研究新孢子虫早期感染状况下的重要蛋白与宿主蛋白发生的相互作用奠定了基础.

摘要： 本研究以柔嫩艾美耳球虫顶体膜蛋白1为诱饵,在柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白,为研究参与子孢子入侵过程中的相关蛋白提供重要的分子基础.首先利用酵母双杂交技术成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子的cDNA文库,以cDNA文库反复冻融后上清为模板,可扩增出柔嫩艾美耳球虫特异性基因,表明构建的文库质量较好.同时,以EtAMA1基因为目标,构建了应用于酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-EtAM-A1,并对该诱饵载体进行鉴定、自转录活性检测和细胞毒性检测.结果显示经过4次筛选后获得了710个蓝色克隆,随机挑选42个蓝斑克隆提质粒后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,PCR鉴定后测序,获得了14个单一的阳性质粒,其中5个未知基因、7个未命名蛋白、2个已报道蛋白.这些结果为以后进一步研究鸡球虫入侵宿主细胞提供了基础.

摘要： 构建了用于苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorot(i)c leaf spot virus,ACLSV)外壳蛋白(coat protein,CP)酵母双杂交试验的诱饵载体,并进行了自激活及毒性验证.以含有ACLSV CP特异性序列的重组质粒为模板,经PCR扩增获得合有NdeⅠ/PstⅠ双酶切位点的CP特异性序列,连接到pMD18-T simple载体,测序鉴定正确后,NdeⅠ/PstⅠ双酶切获得的CP目的基因与同样双酶切的酵母质粒载体pGBKT7连接,转化酵母菌株Y2H gold,并进行自激活与毒性试验.结果表明重组质粒pGBKT7-CP序列正确,转化酵母菌株无自激活、无毒性.

摘要： 为了研究TuMV与不结球白菜的互作，以TuMV接种的不结球白菜叶片为材料,构建cDNA文库。以TuMV响应基因LRK01为探针,与文库杂交,筛选得到28个阳性克隆,经过测序和同源性比对分析表明,一条编码真核延伸因子Tu(EF-Tu)的基因可能参与了不结球白菜与TuMV的互作。通过酵母双杂交验证了EF-Tu与LRK01互作，实时定量分析显示TuMV侵染抑制该基因的表达。

摘要： 目的：是筛选BVDV E0蛋白相互作用的人参蛋白,探讨E0基因提高人参皂苷合成的分子机理.方法：将BVDV E0基因与pGBK-T7质粒重组构建诱饵质粒,同时构建人参酵母双杂交cDNA文库,通过酵母双杂交技术筛选与BVDV E0蛋白相互作用的人参蛋白,再通过PCR鉴定、β-半乳糖苷酶活性鉴定和回转鉴定验证蛋白的相互作用.结果：成功构建诱饵载体和人参酵母双杂交cDNA文库,并筛选得到BVDV E0蛋白相互作用人参蛋白.结论：人参cDNA文库与BVDV E0蛋白相互作用的蛋白是真核细胞翻译起始因子5A(eIF-5A).

摘要： 本发明公开一种双杂交酵母及检测环境污染物类/抗盐皮质激素作用的方法，(1)构建含有pGBKT7‑MR酵母表达质粒和pGADT7‑TIF2酵母表达质粒的双杂交酵母；(2)将所得双杂交酵母与盐皮质激素标准品共培养，检测报告基因表达的酶的酶活性，以酶活性对盐皮质激素标准品浓度绘制标准曲线；(3)相同条件下将待测环境污染物与所得双杂交酵母共培养，将所得酶活性带入所述标准曲线中，计算所得的盐皮质激素标准品剂量即为环境污染物的类盐皮质激素剂量。本发明的目的在于构建一种能同时表达盐皮质激素受体和受体共激活因子的双杂交酵母，并在此基础上建立一种快速、经济的检测环境污染物对盐皮质激素受体干扰活性的生物测试方法。

摘要： 本发明公开了一种新的评估由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量的方法，该方法能够体现文库中插入基因数量、基因丰度等关键性指标，解决了传统的由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量评估方法的片面性，适合一般的实验室进行准确的文库评估。该方法通过文库15轮循环数的PCR扩增、产物回收之后的浓度测定和电泳情况初步判断，之后将回收产物进行高通量测序、de novo组装后详细分析，获得文库的插入基因数量、基因丰度等关键性指标，完成由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量的准确评估。同时，还能获得无参考基因组物种基因的序列信息，为下一步互作蛋白编码基因的克隆提供基础。

摘要： 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酵母双杂交文库构建方法专利申请事宜。该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，具体包括：转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计、制备cDNA模板、PCR扩增、磷酸化处理、连接重组接头、构建全长转录因子的文库质粒、质粒转化并构建文库等步骤。本申请所提供全长转录因子酵母双杂交文库构建方法，是对现有构建方法的进一步综合性改进，具有转录因子阳性筛选率高、筛选准确性高、所构建文库质量高等优点，同时由于对于相关操作步骤有所优化，因而能够节省构建时间和构建成本，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

摘要： 一种用于高通量受体基因筛查的新型膜蛋白酵母双杂交方法。本发明公开了一种膜外酵母双杂交系统及其应用，所述系统包括钓饵表达载体和猎物表达载体，所述钓饵表达载体包括钓饵表达单元序列，所述钓饵表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与钓饵编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得，所述猎物表达载体包括猎物表达单元序列，所述猎物表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得或者所述猎物表达单元序列是将猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列直接融合后获得。所述系统可用于研究发生在细胞膜外侧的蛋白相互作用。

摘要： 本发明涉及膜蛋白实验技术领域，且公开了一种基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，一种基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，包括以下材料诱饵克隆：pBT3‑STE‑A、诱饵载体：pBT3‑STE、文库酵母质粒：草膜文库、Clontech酵母双杂交系统、培养基、贮备液。该基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，通过将诱饵质粒转化受体菌NMY51中及其自激活检测、文库筛选、筛库结果、酵母阳性克隆鉴定及测序比对与测序比对结果、酵母阳性克隆鉴定及测序比对与测序比对结果、酵母阳性克隆回转验证等步骤，通过酵母阳性克隆回转验证将筛选得到的34个酵母阳性克隆，均能在SD‑TL、SD‑TLH+30mM 3AT、SD‑TLHA+30mM 3AT缺陷性平板上生长，从而得到最终的膜蛋白，解决了与pBT3‑STE‑A作用的蛋白不易发现的问题。

摘要： 本发明公开了一种高通量酵母双杂交文库筛选方法。属于分子生物技术领域。该方法包括如下步骤：酵母诱饵菌株的制备；酵母诱饵菌株与文库菌的杂交；交配后培养物的培养与检测：将交配后培养物置于半固态培养基中，冰上培养，使液态培养基凝固成半固态胶冻状，之后培养收集酵母细胞，并提取酵母细胞质粒进行PCR扩增，凝胶电泳检测。该方法采用半固态凝胶培养基培养来代替经典方法中涂板培养的步骤，缩减了工作量，也免去挑选单克隆进行检测时的大量重复操作。

摘要： 本发明涉及发酵酵母筛选基因技术领域，且公开了一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7‑gA9‑nosc‑221、诱饵载体pGBKT7、文库酵母质粒pGADT7‑多肽cDNA、Clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液。具体包含将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测、文库筛选、酵母阳性克隆鉴定及测序比对、酵母阳性克隆回转验证，以构建到pGBKT7载体上的gA9‑nosc‑221基因为诱饵，筛选酵母双杂交多肽文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7‑gA9‑nosc‑221相互作用的多肽，该确定多肽蛋白的方法更加高效，大大提高了研究的效率。

摘要： 本发明公开了一种新的评估由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量的方法，该方法能够体现文库中插入基因数量、基因丰度等关键性指标，解决了传统的由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量评估方法的片面性，适合一般的实验室进行准确的文库评估。该方法通过文库15轮循环数的PCR扩增、产物回收之后的浓度测定和电泳情况初步判断，之后将回收产物进行高通量测序、de novo组装后详细分析，获得文库的插入基因数量、基因丰度等关键性指标，完成由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量的准确评估。同时，还能获得无参考基因组物种基因的序列信息，为下一步互作蛋白编码基因的克隆提供基础。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，特别涉及酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用。该酵母双杂交载体包括：pNC‑GADT7载体和pNC‑GBKT7载体；所述pNC‑GADT7载体于pGADT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框；所述pNC‑GBKT7载体于pGBKT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框。该Nimble Cloning的酵母双杂交载体，以方便目标基因克隆到载体。具有操作简单、克隆效率高、可标准化克隆等优点。

摘要： 本实用新型公开了一种酵母双杂交用培养皿，属于生物工程领域。一种酵母双杂交用培养皿，包括培养皿，培养皿上盖有盖子，培养皿上固定连接有一对横杆，横杆上固定连接有竖杆，竖杆上转动连接有卡柱，竖杆与卡柱之间连接有连接杆，卡柱靠近盖子的一端固定连接有硅胶垫，硅胶垫上连接有清洁布，硅胶垫与清洁布之间连接有一对相匹配的尼龙贴，横杆的底部低于培养皿的底部，卡柱上开凿有凹槽，横杆、竖杆、卡柱和连接杆均为玻璃材质；本实用新型易于对培养皿及其内部的物质起到保护作用，当培养皿不慎从高处坠落或经过剧烈的震动后，培养皿及其内部的物质易于被保存完好，不易影响酵母双杂交实验的进程，提高实验效率。