表达载体

摘要： 为进一步探索波形蛋白(vimentin)调控绒山羊绒毛生长的作用机制,以内蒙古遗传种子资源阿尔巴斯白绒山羊皮肤中的毛囊组织为材料,利用PCR技术和酵母双杂交技术对根据GenBank中山羊的vimentin蛋白序列,运用蛋白质互作在线软件预测和液相色谱质谱联用采集免疫共沉淀数据筛选出肌动蛋白(ACTB)和vimentin进行基因引物设计、克隆、酵母表达载体构建和蛋白互作鉴定。结果显示:成功克隆出绒山羊vimentin基因CDS区序列的长度为1 401 bp, ACTB基因CDS区序列的长度为1 128 bp;构建了酵母表达载体;试验组共转化pGBKT7-vimentin与pGADT7-ACTB的Y2HGold菌株在二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基和四缺板SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-GaL/AbA培养基上,均能生长出淡蓝色菌落,而在对照组共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基上长出白色菌落,表明共转化的pGBKT7-vimentin与pGADT-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac被激活,共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac未被激活。提示:vimentin与ACTB两种蛋白间存在相互作用。

摘要： 为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果对油菜开花早晚进行了调控,导致FIL基因在不同材料中的表达效果不一致。

摘要： 为研究GBSS基因在百合鳞茎形成及发育过程中影响鳞茎淀粉合成代谢的作用机理,构建干扰GBSS基因的RNAi载体为其在转录水平沉默表达提供材料。从百合鳞片克隆GBSS基因300 bp的保守序列,通过BP与LR反应将该序列正反向连接到干扰载体pJawohl8-RNAi中,经过酶切反应鉴定所构建RNAi表达载体的正确性。实验成功构建pDONR221-GBSS入门克隆与pJawohl8-RNAi-GBSS表达载体,为在百合鳞茎淀粉合成代谢途径中研究GBSS基因功能及对鳞茎发育的影响提供了材料与思路。

摘要： 为研究胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells,TECs)中雌激素(estradiol,E2)对长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表达的调节作用,本研究首先培养小鼠胸腺髓质上皮细胞系1(medullary thymic epithelial cell line 1,MTEC1),经50 nmol/L E2作用24 h后,观察对细胞表型变化的影响,并用CCK-8试剂盒检测细胞活力;提取细胞总RNA,运用实时荧光定量PCR技术验证E2对lncRNA-2410006H16Rik表达的调节作用;最后运用RT-PCR技术扩增其目的基因,构建pEGFP-N1-lncRNA-2410006H16Rik重组过表达载体.结果显示,50 nmol/L E2能够明显抑制MTEC1的增殖,且相较于对照组细胞,50 nmol/L E2处理组细胞的D450nm值极显著降低(P＜0.01),表明其细胞活力极显著下降.实时荧光定量PCR结果显示,在E2作用下,lncRNA-2410006H16Rik在MTEC1细胞中的表达极显著上调(P＜0.01),约是对照组的2倍,与高通量测序结果一致.经RT-PCR、双酶切及测序结果分析显示,试验成功构建pEGFP-Nl-lncRNA-2410006H16Rik表达载体.结果表明,TECs中lncRNA-2410006H16Rik的表达与E2作用密切相关,为后续在细胞水平上进一步验证lncRNA-2410006H16Rik的调节功能奠定了基础.

摘要： [目的]筛选适合枸杞内生真菌(Fusarium nematophilum)NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体,为后期研究该菌株在宿主植物中的侵染行为和定殖规律奠定基础.[方法]采用PEG介导原生质体转化法,分别将GFP标签蛋白表达载体pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG转入NQ8GⅡ4菌株,对比4种NQ8GⅡ4转化子的荧光强度、遗传稳定性、拮抗活性和致病性,筛选GFP标签蛋白的最佳表达载体.[结果]枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株对潮霉素B(HmB)的耐受质量浓度为20 mg/L,对遗传霉素(G418)的耐受质量浓度为80 mg/L.通过PEG介导原生质体转化,获得pFL2转化子272株、pDL2转化子57株、r-KNT转化子73株和KNTG转化子226株,其转化效率分别为13.60,2.85,3.65和11.30株/μg.荧光显微观察发现,表达载体pDL2和KNTG的转化子所产生的荧光强度明显强于表达载体r-KNT和pFL2的转化子.连续培养5代后,pDL2转化子的遗传稳定率高达89.47％,pFL2、rKNT和KNTG转化子的遗传稳定率分别仅为67.28％,68.49％和58.85％.4种转化子对枸杞胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的拮抗活性以及对枸杞离体叶片的致病性均与野生型菌株无明显差异.[结论]pDL2更适合用作NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体.

摘要： [目的]旨在纯化玉米ZmCCT基因缺失区段的原核表达蛋白.[方法]依据ZmCCT氨基酸序列中的CCT保守功能区,利用PCR技术获得ZmCCT基因的缺失突变体DNA片段,分别构建4个原核蛋白表达缺失区段.[结果]成功获得3个缺失区段的原核蛋白:ZmCCT1-300,ZmCCT300-540和ZmCCT1-540.[结论]该研究不仅有助于ZmCCT多克隆抗体的纯化,还将为探索ZmCCT的抗病分子机理奠定基础.

摘要： 为提高蛋白表达量,研究选用串联表达技术对鸡β-防御素5(AvBD-5,也称Gal-5)重组蛋白进行表达及其生物学活性检测.按照NCBI上鸡β-防御素5的cDNA编码区序列,优化其基因序列后串联得到2×Gal-5,将2×Gal-5与pET-28a双酶切后连接为重组表达载体pET-28a-2×Gal-5,之后将pET-28a-2×Gal-5转化到大肠杆菌(BL21)中诱导表达蛋白;重组蛋白表达成功后对其进行纯化以及体外抗菌活性的测定.结果表明,重组蛋白2×Gal-5在BL21中成功表达,分子质量约为12 ku,主要以包涵体形式存在;纯化后的重组蛋白对大肠杆菌有明显的抗菌活性,对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和链球菌抗菌活性较弱.试验成功构建可串联表达Gal-5且具有生物学活性的大肠杆菌原核表达载体.

摘要： 目的:串联丙型肝炎病毒(HCV)中和抗原表位嵌合在乙型肝炎病毒(HBV)S基因不同区域并对形成的病毒样颗粒(VLP)进行比较.方法:选取3种HCV中和抗原表位进行串联,分别嵌合在HBV S基因亲水区和氨基端胞外区,构建两种表达载体pCI-NEm S和pCI-S1Em S2.通过10次重复实验转染人胚胎肾细胞293T(HEK293T细胞)后收集培养上清,经过浓缩、纯化制备VLP-NEm S和VLP-S1Em S2.采用电化学发光法对两种VLP进行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)定量检测,分析两种VLP含量均值的差异.结果:VLP-S1Em S2的HBsAg均值低于VLP-HBS(P<0.05),而VLP-NEmS与VLP-HBS比较差异无统计学意义(P=0.157).结论:胞外区嵌合VLP-NEm S与亲水区VLP-S1 Em S2浓度结果有区别,胞外区含量较高.

摘要： 文章对枯草芽孢杆菌蛋白酶同源建模的三维结构进行分析,并对基因密码子和不同生物细胞载体基因密码子偏好性进行比较,确定枯草芽孢杆菌蛋白酶比较一致的表达载体.结果表明,枯草芽孢杆菌蛋白酶三维预测模型超过90％氨基酸残基落在最适区,属于高质量的预测模型,其主要结构是α-螺旋和不规则结构.对枯草芽孢杆菌蛋白酶基因与不同候选生物细胞载体基因组进行比较,发现巴斯德毕赤酵母是枯草芽孢杆菌蛋白酶最适合的表达载体.

摘要： 为研究羊痘病毒宿主范围基因(Hrg)063的特性及生物学功能,采用overlap PCR技术将绿色荧光蛋白(GFP)基因与063基因两侧的同源臂连接起来,把扩增的目的基因插入到PEASY-T1克隆载体中,构建以GFP基因为报告基因的063基因缺失表达载体,并测序鉴定;用脂质体Lipofectamine 2000转染表达载体到羊痘病毒感染的羊睾丸原代细胞中,挑取荧光显微镜下表达为绿色荧光的063基因缺失的羊痘重组病毒,并传代纯化.成功的构建了Hrg 063缺失的表达载体(PEASY-Δ063-GFP),测序结果表明063基因的上下游同源臂与GFP报告基因大小约900 bp,与理论相符.转染后表达载体与羊痘病毒重组,得到了063基因缺失的山羊病毒SS株、TS株和疫苗株3个毒株重组病毒,但纯化时重组病毒不能正常传代.该研究中063基因缺失表达载体的构建为其生物学特性及功能的研究奠定了基础.

摘要： 淡水纤毛虫嗜热四膜虫成为近年来新的重组亚单位疫苗生产平台.这种单细胞真核生物表达平台非常容易进行外源基因的遗传操作,而且易于工业化生产.嗜热四膜虫大部分代谢作用是产生可以释放到胞外的膜蛋白,为重组亚单位疫苗的制备和分离纯化提供了便利.本研究将常用的氯化镉诱导的MTT1启动子替换成HSP70启动子,实现热诱导表达,同时改造了原有的表达载体,把新霉素抗性基因换成嘌呤霉素抗性表达盒,从而提高了重组四膜虫的筛选效率,达到优化表达载体的目的.

摘要： AGPAT6是AGPAT家族的一个亚型,且具有GPAT酶活性.研究表明,AGPAT6基因在小鼠褐色脂肪组织、乳腺上皮细胞中高水平表达,影响甘油三酯的合成.本实验根据已发表的牛AGPAT6基因序列设计引物,以牛的cDNA为模板,扩增AGPAT6基因,并将目的基因连接到带有红色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEF1α-IRES-DsRed-Express2中,成功构建过表达AGPAT6基因载体.将构建的表达载体转染到牛乳腺上皮细胞24h后,在荧光显微镜下能观察到红色荧光.

摘要： 目的:对栗酒裂殖酵母中CDC2基因进行克隆,并采用基因工程手段构建淡水舟形藻表达载体.rn 方法:利用试剂盒提取栗酒裂殖酵母的总DNA,以其为模板进行PCR克隆CDC2基因,再将pBI121载体质粒和CDC2基因进行BalⅠ和SmaⅠ双酶切,电泳分离和检测,然后切割载体和基因片段所在的凝胶分别进行胶回收,最后连接回收片段构建载体.rn 结果:克隆得到长度约为1.2kb的CDC2基因片段与NCBI网站所公开的CDC2基因序列最大同源性达98％,连接长度分别约为11.5kb和1.2kb的双酶切片段得到重组载体pBI121-CDC2,并导入淡水舟形藻中成功表达.rn 结论:成功构建栗酒裂殖酵母CDC2基因的淡水舟形藻表达载体.

摘要： MicmRNAS(miRNAS)是一类重要的非编码单链小分子RNA,通常在转录后水平调节基因的表达.本研究基于miR167/ARF类转录因子调控模式的保守性，通过在miRbase中下载马铃薯已知m1R167的成熟序列并预测其靶基因，并通过对其靶基因序列进行功能分析，发现马铃薯miR167调控的靶基因序列为ARF类转录因子家族成员；并利用人工miRNA技术构建了马铃薯amiR167表达载体，后期将转化导入马铃薯来研究miR167/ARF的调控模式，为有目的地利用amiRNA进行马铃薯遗传改良奠定理论基础。

摘要： 目的:利用基因重组技术构建LV3-hEGFL7-shRNA慢病毒表达载体.方法:设计靶向人EGFL7基因的小发卡RNA(shRNA)序列,将hEGFL7-shRNA基因片段连接到慢病毒载体pGLV3/H1/GFP+Puro中,构建慢病毒表达质粒LV3-hEGFL7-shRNA,通过酶切、DNA测序验证hEGFL7片段的准确性,将LV3-hEGFL7-shRNA包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度.结果:酶切和测序结果证实EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为2×108TU/ml.结论:成功构建人EGFL7基因shRNA质粒表达载体.

摘要： 黄酮醇合酶(flavonol synthase,FLS)是黄酮化合物代谢途径中的关键酶之一.本研究在红花转录组测序结果中获得FLS中间序列的基础上,采用RT-PCR和RACE技术,从我国传统中药材红花花瓣中克隆到黄酮醇合酶基因的全长cDNA.该基因全长1201bp,开放阅读框1011bp,编码336个氨基酸.系统进化分析表明，红花FLS基因编码氨基酸与同属菊科植物氨基酸具有一定的同源性，其中与金光菊的亲缘关系最近。根据红花FLS基因片段设计PCR引物进行荧光定量PCR,结果表明，红花FLS基因在吉红油姊妹系的盛花期表达量最高。同时，通过分子生物学方法，成功构建pBASTA-FLS植物表达载体，为后续研究该基因的功能鉴定及在黄酮化合物合成途径中的作用奠定了基础。

摘要： 多基因复合性状是当前转基因植物发展的主要特色,而且在转基因产品安全评价中,要求去除选择标记基因,以避免选择标记基因可能带来的安全性问题.因此,培育多性状无选择标记基因的转基因植物是当前研究的热点问题之一.目前已提出多种去除筛选标记或多基因转化系统,其中同一载体中含有多个T-DNA的共转化策略是能够同时实现去除筛选标记和多基因转化的简单有效的方法,但多克隆位点中有限的酶切位点限制了插入基因的数目.本研究通过同尾酶技术和双T-DNA技术的结合，构建了多基因双T-DNA植物表达系统。此系统包含2个载体:一个为双T-DNA的植物表达载体DT2300,另一个为基因表达盒构建载体2300M。构建的多基因表达系统能够至少表达6个目标基因，而且通过后代筛选，从而建立起了无选择标记的多基因共转化技术体系，为多基因共转化提供了新的有用工具。

摘要： 猪干扰素-α(PoIFN-α)具有广谱的抗病毒作用.目前,重组猪干扰素-α大都通过大肠杆菌表达系统获得,但均以不可溶、无活性的包涵体形式存在.本研究中,通过优化密码子、筛选低温诱导表达载体以及优化表达条件,获得了可溶的、具有生物活性的重组猪干扰素-α8.首先,将密码子优化后的猪干扰素-α8克隆至低温表达载体pColdⅡ,然后将该重组表达载体转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),并通过IPTG诱导表达.通过优化IPTG的诱导浓度和诱导时间,最终获得可溶表达的重组猪干扰素-α8.随后,利用镍柱对所得重组蛋白进行纯化,最终的纯化蛋白量可达100mg/L培养液,经Western blot验证.该纯化蛋白对水疱性口炎病毒的抗病毒活性达1.0×109IU/mg.本研究提供了一种可生产大批量具有可溶性和生物活性的重组猪干扰素-α8的方法,可用于研究和生产.

摘要： 甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mamestra brassicae multiple nucleopolyhedrovirus,MbMNPV)作为广谱杆状病毒生物杀虫剂已广泛应用.本文成功构建一个能在多种商品化昆虫细胞中进行外源蛋白表达和基因工程操作的Ⅱ组甲型杆状病毒Bac-to-Bac表达载体系统,该系统能在Tn368细胞中表达回复的病毒多角体蛋白,也可高效表达其他外源蛋白.该系统的建立为MbMNPV广谱杀虫特性机制研究及重组高效广谱杆状病毒株构建提供便利工具,具有商业开发价值.

摘要： 利用植物油体表达系统生产蛋白,是生物反应器研究的热点.具有生产成本低、来源广、易于大规模生产、不含危害人类健康的病原生物等优点,并且重组蛋白可以在种子内长期、稳定地贮存.肝细胞生长因子(HGF)是1984年Nakamura从肝部分切除的鼠血浆中分离和部分纯化并命名的,成熟HGF是由重链(α链)与轻链(β链)通过链间二硫键连接而成的异二聚体.利用基因工程表达人HGF(hHGF)是大量获取具生物活性HGF的有效途径。而利用植物油体表达系统表达HGF不仅价格低廉，而且植物来源广，易于大规模生产，可大大降低生产成本。研究利用转基因拟南芥和红花种子成功地特异性表达了人HGF(hHGF)并获得了转基因拟南芥T3代和转基因红花T2代。为利用植物油体表达系统生产药用蛋白奠定了基础，同时提供了一个可能使用的大规模产hHGF的方法。

摘要： 本发明提供了一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段，本发明的线性化表达载体构建方法包括下列步骤：设计并构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段；将前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段采用连接酶连接获得线性双链DNA表达载体。本发明还进一步提供了用于线性化表达载体构建的类载体片段。本发明通过高效准确的连接反应制备类似线性化载体片段，避开了通过繁琐耗时的环状质粒载体的构建而获得线性化载体片段的过程，同时目的基因末端的产生不受其序列的限制可以极大简化操作、降低成本并缩短实验周期，在酵母等表达系统中具有很好的应用前景。

摘要： 本发明公开了一种基于转录组测序构建棒状杆菌组成型表达载体启动子的方法，本发明还公开了基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子、含有该启动子的表达载体以及该表达载体转化宿主细胞谷氨酸棒状杆菌获得的重组菌株。用本发明获得的启动子构建的表达载体，对数期目的基因蛋白表达量低，但稳定期目的蛋白表达量相对于对数期大幅度提高，且对宿主菌生长影响低，质粒传代稳定性高，适合于对数期不需要表达，而稳定期需要高度表达的目的基因的载体构建，尤其适合于氨基酸发酵用工程菌株的构建。

摘要： 本发明公开了一种基于转录组测序构建棒状杆菌组成型表达载体启动子的方法，本发明还公开了基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子、含有该启动子的表达载体以及该表达载体转化宿主细胞谷氨酸棒状杆菌获得的重组菌株。用本发明获得的启动子构建的表达载体，对数期目的基因蛋白表达量低，但稳定期目的蛋白表达量相对于对数期大幅度提高，且对宿主菌生长影响低，质粒传代稳定性高，适合于对数期不需要表达，而稳定期需要高度表达的目的基因的载体构建，尤其适合于氨基酸发酵用工程菌株的构建。

摘要： 本发明涉及一种大豆耐盐基因GmMYB173及其表达载体和表达载体的应用，提供了一种大豆耐盐基因GmMYB173，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的大豆耐盐基因GmMYB173能够提高大豆的耐盐能力。

摘要： 本发明提供了一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段，本发明的线性化表达载体构建方法包括下列步骤：设计并构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段；将前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段采用连接酶连接获得线性双链DNA表达载体。本发明还进一步提供了用于线性化表达载体构建的类载体片段。本发明通过高效准确的连接反应制备类似线性化载体片段，避开了通过繁琐耗时的环状质粒载体的构建而获得线性化载体片段的过程，同时目的基因末端的产生不受其序列的限制可以极大简化操作、降低成本并缩短实验周期，在酵母等表达系统中具有很好的应用前景。

摘要： 本公开提供了一种裂殖壶菌的表达载体、表达载体的构建方法及应用，属于基因工程领域。所述表达载体包括：pSc‑18S rDNA载体、裂殖壶菌的启动子和终止子的组合、抗性‑荧光双筛选标记的基因序列；所述启动子和终止子的组合包括以下组合中的至少一种：启动子PT和终止子TT的组合、启动子PA1和终止子TA的组合、启动子PA2和终止子TA的组合以及启动子PE2和终止子TE的组合。本公开通过一种高效的裂殖壶菌基因组编辑及转化子筛选技术，通过将抗性‑荧光双筛选标记以融合蛋白表达的形式通过基因枪高效的整合至裂殖壶菌染色体，基于表达的荧光强弱可进行基因编辑元件的测试和转化子的快速筛选，尤其是在表达内源基因时，该技术优势非常突出。

摘要： 本说明书实施例公开了一种表达载体，其包括载体骨架，所述载体骨架不含大肠杆菌复制子；及控制拷贝单元，所述控制拷贝单元包括ori2区、oriV区、sopA基因、sopB基因、inCC区和repE基因。本说明书实施例还公开了一种构建表达载体的方法。本说明书实施例公开的表达载体可高效克隆毒性基因。

摘要： 本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶、编码基因、表达载体、双元表达载体及其应用。本发明所述DFR酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对日本蛇根草花瓣组织的转录组进行测序，根据测序结果设计引物，扩增得到控制日本蛇根草花色苷合成的OjDFR1基因的cDNA，通过表达载体得到所述DFR酶，进而验证其具有DFR酶的催化活性，从而证明了本发明提供的DFR酶可以控制日本蛇根草花色苷的合成，编码该DFR酶的基因可以用于植物花色苷的改良。

摘要： 本发明公开了一种控制水稻种子萌发的miR1866基因、过表达载体、gRNA表达载体、制备方法及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明依据CRISPR/Cas9和高表达miRNA的技术原理对水稻中miR1866基因的表达进行调控。设计miR1866基因小干扰片段，构建pH‑Ubi‑CAS9‑miR1866和pTCK303‑miR1866表达载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，以潮霉素(Hyg)抗性标记筛选获得阳性转基因植株，分别测序和qRT‑PCR的方法鉴定miR1866的突变和miR1866基因表达量，结果表明：分别获得了miR1866突变植株和miR1866高表达植株。具有重要应用价值的水稻miR1866突变植株和miR1866高表达植株，与野生型日本晴相比，miR1866突变植株种子萌发速率显著变慢，而miR1866高表达植株种子萌发速率显著加快。

摘要： 本发明提供了一种环状RNA表达载体及使用所述表达载体的适用于circRNA互作RNA或蛋白的TRAP方法，解决了传统的TRAP实验目前只应用LncRNA等互作RNA或蛋白研究的局限性问题。