双重PCR

摘要： 研究利用双重PCR技术同时鉴定番茄抗斑萎病毒病基因Sw-5和抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-2,鉴定结果与单引物PCR完全吻合。其中Sw-5的连锁标记在纯合抗病和感病材料中分别扩增出574 bp和464 bp的特异条带,在杂合抗病材料中可同时扩增出以上两条带;Ty-2的连锁标记在纯合抗病和感病材料中分别扩增出900 bp和800 bp的特异条带,在杂合抗病材料中同样扩增出两条带。利用双重PCR方法对17份待检测番茄材料进行鉴定,条带清晰,且辨识度高。该技术极大地提高了Sw-5和Ty-2基因的鉴定效率。

摘要： 为建立有效鉴别副溶血性弧菌及携带耐热相关溶血毒素基因的毒性弧菌的方法,用副溶血性弧菌种属特异性基因tlh及毒性基因trh设计引物进行双重PCR检测,对双重PCR体系进行优化,并对其特异性及PCR灵敏度进行检测,验证双重PCR体系检测能力及对人工污染样品的灵敏度。结果表明,该方法对海产品中的副溶血性弧菌及携带trh毒性基因的弧菌具有检测特异性,且灵敏度较高,可为食品检测提供一定的参考依据。

摘要： 鸭2型腺病毒(Ducka denovirus2,DAdV-2)病和鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)病是严重影响我国水禽养殖的两种病毒性疾病。雏鸭阶段两种疾病的发病路和死亡率高。鸭腺病毒感染主要表现为精神萎靡、沉郁和消瘦,排浅黄白色的粪便。病理变化为肝脏肿大并有白色针尖状坏死点灶,肾脏及脾脏肿大充血,胰腺有白色点状坏死。而鸭圆环病毒常呈潜伏感染,并入侵鸭的免疫系统,导致机体的免疫功能下降,对多种条件性病原抵抗力减弱,使其更易遭受其他致病因素的侵袭。

摘要： 为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和弓形虫(Toxoplasma gondii)的双重PCR方法,根据GenBank上已登录的PCV2和弓形虫基因的保守序列,设计了2对特异性引物,并对反应体系及条件进行了优化。首先对单一PCR检测条件进行摸索,确定其最佳检测条件和灵敏性;进而建立两种病原的双重PCR检测方法,通过对退火温度、灵敏性和特异性进行测试,最终确定该方法的反应体系及条件。结果显示:双重PCR方法对PCV2和弓形虫的最低检出限分别为78.16和29.19μg/mL;对伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)等均无扩增,特异性良好。利用该方法对来自川渝地区部分猪场的63份临床样本进行检测,并与单一PCR检测结果进行比对,两种方法的符合率为100%。以上结果说明,本试验建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性强、结果可靠、方便经济,可用于PCV2和弓形虫的实验室快速检测。

摘要： 番鸭白肝病是2014年以来我国番鸭流行的一种新疫病,其病原为一种与鸭腺病毒B型法国GR株同源性较高的新型腺病毒,暂命名为鸭腺病毒B血清2型(DAdV-B2),将法国GR株命名为鸭腺病毒B血清1型(DAdV-B1)。为建立同时检测DAdV-B1和DAdV-B2的方法,本研究根据GenBank中DAdV-B1 fiber基因和DAdV-B2 fiber1基因序列特征,分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可以同时检测这两种病毒的双重PCR方法。结果显示:优化后的PCR方法最佳退火温度为60.1°C,最适引物浓度为0.16μmol/L;利用该方法对DAdV-B1、DAdV-B2、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、禽腺病毒血清4型(FAdV-4)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、新型呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭源鹅细小病毒(MDGPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和禽坦布苏病毒(ATUMV)等检测,结果显示,该方法仅对DAdV-B1和DAdV-B2有特异性扩增,对其他鸭临床常见病原均无扩增,特异性较强。将DAdV-B1 fiber和DAdV-B2 fiber1质粒标准品等体积混合并作10倍倍比稀释后作为模板,利用该双重PCR方法检测,结果显示,该方法对DAdV-B1 fiber和DAdV-B2 fiber1质粒标准品的最低检测限分别为175拷贝/μL和163拷贝/μL,对DAdV-B2的最低检出滴度为1×10^(1) TCID_(50),敏感性较高。批内和批间的重复性试验检测结果均一致,重复性好。利用该双重PCR与单一PCR方法同时对64份临床样品检测,结果显示二者的符合率为100%,其中DAdV-B2的阳性率为79.7%(51/64),DAdV-B1的阳性率为4.7%(3/64)。以上结果表明本研究建立的双重PCR方法特异性较强、敏感性较高和稳定性较好,为DAdV-B1和DAdV-B2的临床鉴别检测及其分子流行病学调查提供了技术手段。

摘要： 为建立龟源致病性鲍曼不动杆菌和摩氏摩根菌双重PCR诊断方法,应用鲍曼不动杆菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB基因的特异性引物,对单重和双重PCR反应的退火温度、引物浓度、MgCl2浓度、dNTP浓度等进行优化.试验结果显示,鲍曼不动杆菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB基因引物分别进行PCR扩增后,均获得特异性条带,与预期结果一致;rpoB和gyrB基因的上、下游引物各为0.3μmol/L,退火温度为59.3°C,dNTP浓度为0.5 mmol/L,MgCl2浓度为5 mmol/L时,PCR扩增效果最佳;特异性试验结果显示,本方法仅对摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌有扩增,对其他病原菌如肺炎克雷伯氏菌、维氏气单胞菌及恶臭假单胞菌等无扩增;灵敏性结果表明,本方法对鲍曼不动杆菌和摩氏摩根菌最低检测质量浓度分别为4.12×10-3 ng/μL和1.257×10-3 ng/μL.通过对临床病料样本的检测分析证明,本方法与单重PCR检测结果一致.本试验所建立的针对两种病原菌检测的双重PCR方法特异性强、灵敏度高,可为龟鳖类鲍曼不动杆菌和摩氏摩根菌的鉴别诊断和临床调查提供帮助.

摘要： 以PRRSV、PRV的核酸为模板,基于优化的单重PCR扩增体系,建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的双重PCR检测方法。结果表明,引物对PRRSV、PRV能进行特异性扩增,目的片段大小分别为261、401 bp,单重PCR方法特异性好,对PRRSV、PRV的检测限分别为0.1412、6.96 pg。应用建立的双重PCR方法对58份临床样品进行检测,与单重PCR方法检测结果的符合率为100%。研究建立的双重PCR方法可用于临床上PRRSV和PRV的病原学诊断。

摘要： 为建立一种能同时快速检测鸭疫里氏杆菌(RA)和鸭坦布苏病毒(DTMUV)的PCR方法,根据NCBI公布的RA dnaB基因和DTMUV PrM基因分别设计并合成两对特异性引物,通过对双重PCR反应的引物浓度和退火温度进行优化筛选.优化引物浓度组合为:RA引物0.5μmol/L,DTMUV引物为1μmol/L,最佳退火温度为53°C.特异性试验表明,该方法对鹅细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、番鸭细小病毒、I型鸭肝炎病毒、沙门氏菌、大肠杆菌的核酸扩增结果均为阴性,RA和DTMUV的检测结果为阳性.敏感性测定表明,该双重PCR方法最低能检出RA和DNAV-1的核酸量分别为6.7 pg和3.6 pg.本研究建立的检测方法检测实验室保存的8份临床病料,RA的阳性率为62.5％,DTMUV阳性率为37.5％.综上所述,建立的PCR方法特异性强、敏感性和稳定性良好,为RA和DTMUV的临床病料检测提供了技术支撑.

摘要： 为快速鉴别诊断鹅星状病毒(GoAstV)和鹅细小病毒(GPV),根据GoAstV和GPV基因序列保守区域设计了两对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测这两种病毒的PCR诊断方法.该方法能够特异性扩增出两种病毒的相应片段,而对鹅副粘病毒(GPMV)、鹅流感病毒(GAIV)、鹅腺病毒(GADV)、鹅圆环病毒(GoCV)均无扩增,对重组质粒的最低检测拷贝数分别为1.25×103copies和1.25×105 copies.应用该方法对50份鹅临床脏器样品进行检测,结果检测出GoAstV 35份、GPV 2份,GoAstV和GPV混合感染2份.结果 表明,研究建立的双重PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于GoAstV和GPV的流行病学调查和疾病监测.

摘要： 为建立鸡毒支原体(MG)与滑液囊支原体(MS)双重PCR检测方法,一次反应即可诊断鸡毒支原体与滑液囊支原体感染情况.根据GenBank公开的MG和MS基因序列,设计了2对质粒构建引物和2对检测引物,优化检测反应体系与条件,进行灵敏性试验、特异性试验和临床检测应用.结果显示,该方法对MG和MS阳性质粒的最低检测限为10拷贝/μL;与常见的H 9禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、Ⅰ群禽腺病毒4型、副鸡嗜血杆菌和鸡大肠埃希氏菌6种病原无交叉反应;应用该方法检测335份样品,MG单阳性率为7.8％,MS单阳性率为31.3％,MG和MS双阳性率为17.0％,两种支原体总的感染率为56.1％.成功建立了检测MG和MS的双重PCR检测方法,为流行病学调查和诊断提供了可靠的技术手段.

摘要： 本研究根据CDV核蛋白(N)基因和CPV、MEV结构蛋白VP2基因的相对保守区设计了两对特异性引物，经试验条件的优化，建立了同时检测CDV和CPV／MEV的双重PCR方法。通过检测36份临床样品，对双重PCR方法和胶体金试纸条方法进行了对比试验。结果表明，建立的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可扩增出5.63 ng的总核酸量;与试纸条方法相比，双重PCR方法对CDV检出率提高了5.56％，对CPV／MEV检出率提高了2.78％。说明该方法可用于检测宠物犬和毛皮动物中CDV和CPV／MEV的混合感染。

摘要： 本研究根据CDV核蛋白(N)基因和CPV、MEV结构蛋白VP2基因的相对保守区设计了两对特异性引物，经试验条件的优化，建立了同时检测CDV和CPV／MEV的双重PCR方法。通过检测36份临床样品，对双重PCR方法和胶体金试纸条方法进行了对比试验。结果表明，建立的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可扩增出5.63 ng的总核酸量;与试纸条方法相比，双重PCR方法对CDV检出率提高了5.56％，对CPV／MEV检出率提高了2.78％。说明该方法可用于检测宠物犬和毛皮动物中CDV和CPV／MEV的混合感染。

摘要： 本研究根据CDV核蛋白(N)基因和CPV、MEV结构蛋白VP2基因的相对保守区设计了两对特异性引物，经试验条件的优化，建立了同时检测CDV和CPV／MEV的双重PCR方法。通过检测36份临床样品，对双重PCR方法和胶体金试纸条方法进行了对比试验。结果表明，建立的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可扩增出5.63 ng的总核酸量;与试纸条方法相比，双重PCR方法对CDV检出率提高了5.56％，对CPV／MEV检出率提高了2.78％。说明该方法可用于检测宠物犬和毛皮动物中CDV和CPV／MEV的混合感染。

摘要： 本研究根据CDV核蛋白(N)基因和CPV、MEV结构蛋白VP2基因的相对保守区设计了两对特异性引物，经试验条件的优化，建立了同时检测CDV和CPV／MEV的双重PCR方法。通过检测36份临床样品，对双重PCR方法和胶体金试纸条方法进行了对比试验。结果表明，建立的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可扩增出5.63 ng的总核酸量;与试纸条方法相比，双重PCR方法对CDV检出率提高了5.56％，对CPV／MEV检出率提高了2.78％。说明该方法可用于检测宠物犬和毛皮动物中CDV和CPV／MEV的混合感染。

摘要： 本研究根据CDV核蛋白(N)基因和CPV、MEV结构蛋白VP2基因的相对保守区设计了两对特异性引物，经试验条件的优化，建立了同时检测CDV和CPV／MEV的双重PCR方法。通过检测36份临床样品，对双重PCR方法和胶体金试纸条方法进行了对比试验。结果表明，建立的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可扩增出5.63 ng的总核酸量;与试纸条方法相比，双重PCR方法对CDV检出率提高了5.56％，对CPV／MEV检出率提高了2.78％。说明该方法可用于检测宠物犬和毛皮动物中CDV和CPV／MEV的混合感染。

摘要： 为查明新疆奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌主要流行血清型，采用玻片凝集和双重PCR对不同地区奶牛乳房炎乳样申分离的117株金黄色葡萄球菌进行血清分型。结果表明荚膜多糖5型占10.26%(12/117)，8型占13.68%(16/117)，336型占64.96%(76/117)，未分型菌株占11.11%(13/117).该研究为新疆奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗菌株的筛选提供了依据.

摘要： 为查明新疆奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌主要流行血清型，采用玻片凝集和双重PCR对不同地区奶牛乳房炎乳样申分离的117株金黄色葡萄球菌进行血清分型。结果表明荚膜多糖5型占10.26%(12/117)，8型占13.68%(16/117)，336型占64.96%(76/117)，未分型菌株占11.11%(13/117).该研究为新疆奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗菌株的筛选提供了依据.

摘要： 为查明新疆奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌主要流行血清型，采用玻片凝集和双重PCR对不同地区奶牛乳房炎乳样申分离的117株金黄色葡萄球菌进行血清分型。结果表明荚膜多糖5型占10.26%(12/117)，8型占13.68%(16/117)，336型占64.96%(76/117)，未分型菌株占11.11%(13/117).该研究为新疆奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗菌株的筛选提供了依据.

摘要： 为查明新疆奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌主要流行血清型，采用玻片凝集和双重PCR对不同地区奶牛乳房炎乳样申分离的117株金黄色葡萄球菌进行血清分型。结果表明荚膜多糖5型占10.26%(12/117)，8型占13.68%(16/117)，336型占64.96%(76/117)，未分型菌株占11.11%(13/117).该研究为新疆奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗菌株的筛选提供了依据.

摘要： 目的建立一种快速有效地检测由牛分支杆菌引起的出口牲猪结核病的实时定量双重荧光PCR检测方法。方法以牛分支杆菌16S rRNA基因和IS6110因为靶序列，建立实时定量双重荧光PCR方法;通过敏感性实验、特异性和干扰实验等验证所建方法的敏感性、特异性、稳定性;尝试用5种方法对牲猪结核病疑似病料组织进行DNA提取;用建立的方法对搜集的猪结核病疑似病料进行检测并与剖解方法和分离培养方法进行比较。结果建立的方法稳定性强、特异性和敏感性好。结论建立的实时定量双重荧光PCR方法可快速、敏感，特异地检测由牛分支杆菌引起的出口牲猪结核病。

摘要： 本发明公布了一种马尔堡，埃博拉双重病毒荧光定量PCR检测新方法及该双重病毒检测PCR体系，由引物和探针、Premix Ex Taq反应液、灭菌Tris水组成，两对引物和探针的特异性良好，灵敏度颇高，非常适用于马尔堡、埃博拉病毒同时检测，与其它几种虫媒出血热病毒如黄热，登革，裂谷热无交叉反应。

摘要： 本发明公开了一种羊吕氏泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体双重PCR专用引物，引物的核苷酸序列为：羊吕氏泰勒虫专用引物T.lu7：如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示；嗜吞噬细胞无浆体专用引物SSAP2：如SEQ NO.3和SEQ NO.4所示。羊吕氏泰勒虫专用引物T.lu7的扩增产物大小为962bp，嗜吞噬细胞无浆体专用引物SSAP2的扩增产物大小为641bp。本发明基于

摘要： 本发明提供一种两类羊病原体双重PCR专用引物及双重PCR检测方法，属于预防兽医学领域。本发明根据羊口疮病毒的B2L基因和丝状支原体簇的16S rRNA基因序列，设计了两对特异性引物ORFVB2L和Mm‑cluster，建立了快速检测羊口疮病毒和丝状支原体簇双重PCR方法。电泳图中出现304bp的特异性片段为羊口疮病毒阳性；出现1232bp的特异性片段为丝状支原体簇阳性。本发明可实现同一反应体系中对羊口疮病毒和丝状支原体簇进行检测，具有快速、特异、敏感性高等优点，便于流行病学的大规模调查，对于科学防控这两种疾病具有重要的经济和社会意义。

摘要： 本发明公布了一种马尔堡，埃博拉双重病毒荧光定量PCR检测新方法及该双重病毒检测PCR体系，由引物和探针、Premix Ex Taq反应液、灭菌Tris水组成，两对引物和探针的特异性良好，灵敏度颇高，非常适用于马尔堡、埃博拉病毒同时检测，与其它几种虫媒出血热病毒如黄热，登革，裂谷热无交叉反应。

摘要： 本发明公开了非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重数字PCR检测引物探针组合物及其检测方法。所述双重数字PCR检测引物探针组合物包括非洲猪瘟病毒引物探针和猪圆环病毒2型引物探针。本发明还提供检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型的方法，所述方法包括使用所述的双重数字PCR引物探针组合物对待测样品进行数字PCR检测，根据数字PCR检测结果判断或辅助判断是否为目的病原菌。本发明提供的试剂或方法操作简便，灵敏性和重复性好，可以精准把控疫病控制效果。

摘要： 本发明目的在于提供一种非疾病诊断用途的禽腺病毒4型、8型双重荧光定量PCR快速检测试剂盒及方法。所述试剂盒包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的四段引物序列。灵敏性结果显示，该快速检测试剂盒能检测出FAdV‑4阳性与FAdV‑8阳性的最低拷贝数分别为1.38×104copies/μL与1.38×103copies/μL。特异性结果显示该方法能特异性扩增FAdV‑4与FAdV‑11特异性扩增，具有良好特异性。重复性试验结果显示，组内变异系数均少于1.5％，组间变异系数均少于3.0％，重复性良好。该检测方法具有耗时短、成本低的优势，具有良好的市场应用前景。

摘要： 本发明属于分子检测技术领域，涉及一种能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR方法及应用，以人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫阳性对照混合物为模板，以毛滴虫属特异性引物为扩增引物进行扩增，以第一轮PCR获得的扩增产物为模板，以人五毛滴虫种特异性引物和巴特里四毛滴虫种特异性引物的混合物为引物进行扩增，用于同时检测人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫。本发明的方法能特异性地扩增人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫目的片段，最低能检查到500fg/μL的阳性对照DNA。

摘要： 本发明提供一种检测新型貉细小病毒的双重PCR引物组、试剂盒及其应用，本发明采用双重PCR能同时快速鉴别检测nRDPV与其他食肉动物原细小病毒1型。如果同时扩增出了261bp和648bp的产物，则所检测样品中存在新型貉细小病毒nRDPV感染；若只扩增出261bp，则所检样品中存在其他食肉动物原细小病毒1型病毒感染；如果未扩增出261bp和648bp的片段，则所检样品中无食肉动物原细小病毒1型病毒和新型貉细小病毒nRDPV感染。本发明首次建立了针对型貉细小病毒的PCR检测方法，具有检测便捷快速、特异性强、敏感性高等优点，可以快速准确地实现nRDPV的检测。

摘要： 本发明公开了用于鉴别花蓟马和西花蓟马的双重PCR检测引物及方法。本发明的检测引物包括花蓟马种特异性引物对FiF1和FiR1以及西花蓟马种特异性引物对FoF2和FoR2。本发明利用双重PCR技术，单次单管反应即可对花蓟马和西花蓟马样本或两个物种的混合样本进行同步检测，解决了两种害虫在农作物上共寄主发生且相似性高难以快速鉴别的问题。本发明建立了一种特异性强、快速、高效、易于操作的双重PCR检测方法体系，可用于实际生产中对农作物上重要害虫花蓟马和西花蓟马的快速鉴定。

摘要： 本发明公开了预包装饮用水中两种致病菌的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所述试剂盒包含检测铜绿假单胞菌和粪链球菌的引物及探针(SEQ ID NO:1‑6)。本发明试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为预包装饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌两种致病菌检测提供了新的方法。本发明提供的双重荧光定量PCR法可以准确快速地实现饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌的检测，1天内即可完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量、稳定性好、节约试剂成本等优点，适用于饮用水标准中铜绿假单胞菌和粪链球菌两种致病菌指标。