马尔堡,埃博拉双重病毒荧光定量PCR检测新方法及该双重病毒检测PCR体系

摘要

本发明公布了一种马尔堡，埃博拉双重病毒荧光定量PCR检测新方法及该双重病毒检测PCR体系，由引物和探针、Premix Ex Taq反应液、灭菌Tris水组成，两对引物和探针的特异性良好，灵敏度颇高，非常适用于马尔堡、埃博拉病毒同时检测，与其它几种虫媒出血热病毒如黄热，登革，裂谷热无交叉反应。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及马尔堡、埃博拉双重病毒的快速定性和定量检测方法，各提供一对特异性引物和探针。

背景技术

马尔堡病毒(Marburg virus，MbV)，也称为绿猴病病毒、绿猴因子，是人类发现的第1种丝状病毒属病毒，能在人和其他灵长类动物中引发高死亡率的出血热，马尔堡出血热起病突然，常伴有严重头痛和不舒服，肌肉酸痛是一个常见特征，潜伏期一般为3～9日，较长者可超过2周，可被用作潜在的生物恐怖武器或生物战剂使用，为需要实行最高级生物安全防护(P4级)的烈性病毒。WTO发出警报称，“马尔堡病毒是迄今为止最具有致命性的病毒之一。”

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)能够引起一种人畜共患传染病，即埃博拉出血热(Ebola hemorrhagil fever，EBHF)，1976年在苏丹南部和扎伊尔即现在的刚果(金)的埃博拉河地区首次爆发，患者死亡率高达90％，引起医学界的广泛关注，埃博拉病毒由此得名。埃博拉病毒感染性极强，可通过直接接触感染者的体液或其他感染组织、皮肤溃破伤口和飞沫等多种途径传播。感染者会出现严重的出血现象并导致休克综合征。世界卫生组织已经将EBOV列为对人类危害最严重的病毒之一，即第4级病毒，与其相关的试验操作必须在P4级实验室中进行。

埃博拉病毒和马尔堡病毒共同组成了丝状病毒属。两种病毒在基因排序和复制机理方面有广泛的同源性，但从基因水平上却代表两种截然不同的病毒，二者不存在血清学交叉反应，在结构蛋白图谱和病毒毒粒形态上具有明显的不同。同时检测马尔堡、埃博拉两种丝状病毒将为疫情监测节约更多时间，节省更多成本。目前用于马尔堡及埃博拉病毒的检测方法已经有ELISA抗原检测、间接免疫荧光血清学检测、病毒分离、RT-PCR核酸检测，但荧光定量PCR核酸检测的方法不失为公认的一种更直观、更快速的一种适合早期诊断的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马尔堡，埃博拉双重病毒荧光定量PCR检测新方法及该双重病毒检测PCR体系，该方法能够快速定性和定量检测马尔堡病毒，埃博拉病毒，包括2对特异性更高、灵敏度高、重复性好的引物和探针。

为实现上述目的，本发明马尔堡，埃博拉双重病毒荧光定量PCR检测新方法，该方法中：

1)设计检测马尔堡病毒的第一对引物探针为：

  Name   Sequence   Position   Tm℃   Modification

  FP   AAATCATCAGGTTAGTATCTGTAATCAG  187-214   57.7    RP   TTATAGTAATGCTCAACACACAACG  276-300   57.5    Probe   TGCAATAAACTCAGGGATTGATCTTGGA  223-250   68.4   FAM/BHQ-1

2)设计检测埃博拉病毒的第二对引物探针为：

  Name   Sequence   Position   Tm℃   Modification   query_L1   CAAGGACTGATACAATATCCAACAG  1025-1049   58    query_R1   GAATTTGAAATCACAGCATCGT  1164-1185   57.1    query_P1   TGGCAATCAGTAGGACACATGATGGTG  1052-1078   69   Texas Red/BHQ-2

进一步，所述的马尔堡，埃博拉双重病毒荧光定量PCR检测新方法，具体为：

1)设计引物探针；

2)根据仪器选择荧光素；

3)合成引物和探针；

4)制备阳性质粒标准品；

5)运行PCR；

6)数据分析；

7)提取病毒RNA进行体系验证。

进一步，所述步骤2)中荧光素的供选择的荧光发射基团有6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red，荧光淬灭基团有BHQ-1、BHQ-2、Lowa Black^TMRQ、Lowa Black^TMFQ、Dabcyl。

进一步，所述步骤4)中采取基因合成方式制作阳性质粒CBG232-3、CBG233-4作为阳性样品：将引物设计过程中筛选出的高保守区域bp187-bp300，bp1025-bp1185前后分别延长5～50bp进行基因合成，然后将其克隆至pMD19-T载体中，即为所述阳性质粒样品，编号CBG232-3，CBG233-4。

进一步，所述步骤5)中荧光定量PCR反应适用于所有荧光定量PCR反应仪；

进一步，所述荧光定量PCR反应仪包括SmartCyclerII、ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。

进一步，所述步骤5)中最佳扩增条件为：

一种马尔堡，埃博拉双重病毒检测PCR体系，该体系包括引物或者其他能与马尔堡全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过90％，引物序列如下：

一种马尔堡，埃博拉双重病毒检测PCR体系，该体系包括引物及能与马尔堡全长序列特异性探针，探针序列如下：

能与马尔堡全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。

一种马尔堡，埃博拉双重病毒检测PCR体系，该体系包括引物或者其他能与埃博拉全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过90％，引物序列如下：

一种马尔堡，埃博拉双重病毒检测PCR体系，该体系包括引物及能与埃博拉全长序列特异性探针，探针序列如下：

能与埃博拉全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。

本发明设计2对新的引物探针，结合运用SmartCyclerII建立一种快速、敏感、特异的荧光定量PCR方法同时检测马尔堡及埃博拉两种丝状病毒。通过序列比对的方式挑选出两种病毒基因组中高度保守的序列， 在此序列上分别设计一对引物及一条Taqman探针，建立实时荧光定量PCR反应体系，并进行优化，检测该方法的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为双重检测中马尔堡病毒的扩增曲线图；

图2为双重检测中埃博拉病毒的扩增曲线图；

图3为双重检测中两种病毒扩增曲线综观图；

图4为双重检测中马尔堡的标准曲线图；

图5为双重检测中埃博拉的标准曲线图。

具体实施方式

本发明马尔堡，埃博拉双重病毒荧光定量PCR检测新方法的工作原理即是利用荧光信号的变化定性分析，实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。本发明还涉及上述检测体系所包含的所有内容。

该方法包括以下步骤：

1)设计引物探针；

2)根据仪器选择荧光素；

3)合成引物和探针；

4)制备阳性质粒标准品；

5)运行PCR；

6)数据分析；

7)提取病毒RNA进行体系验证。

1、引物探针的设计

根据拟研究基因名称马尔堡病毒(Marburg virus，MbV)，埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)，在genebank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用DNASTAR软件进行同源性分析和blast序列分析，筛出高度保守区域5’端187-300(MbV)；bp1025-bp1185(EBOV)作为目标序列，采用引物设计软件Primer Premier 5进行引物探针的设计，序列见表1.表2.

表1荧光定量PCR检测马尔堡病毒的引物和探针

表2荧光定量PCR检测埃博拉病毒的引物和探针

2、荧光素的选择

使用仪器为美国Cepheid公司的SmartCyclerII，MbV荧光发射基团采用特性最为稳定的FAM基团，荧光淬灭基团采用BHQ-1；EBOV荧光发射基团采用Texas Red，荧光淬灭基团采用BHQ-2。二者使用不同荧光信号以示区别。

3、引物及探针的合成交予宝生物工程(大连)有限公司完成。

4、本发明采取基因合成方式制作阳性质粒作为阳性样品。将引物设计过程中筛选出的高保守区域5’端187-300/bp1025-bp1185前后分别延长30～50bp进行基因合成，然后将其克隆至pMD19-T载体中，即为我们的阳性质粒样品，编号CBG232-3，CBG233-4。

5、质粒标准品的制备

由委托公司合成并提取的阳性质粒样品原液，通过超微量紫外分光光度计测得浓度分别为300ng/μl(MbV)、360ng/μl(EBOV)，根据单链DNA的拷贝数计算公式“拷贝数浓度(copies/μl)＝DNA浓度(ng/μl)×6.02×1023(copies/mol)/324×2×(载体碱基数+目的基因碱基数)”计算得知马尔堡病毒质粒原液的DNA拷贝数浓度约为1×10¹¹copies/μl；埃博拉质粒原液的DNA拷贝数浓度约为1.13×10¹¹copies/μl。使用EASYDilution(一种专门用于标准品稀释使用的液体，由大连宝生物公司生产)分别进行梯度稀释最终得到1×10⁰～1×10¹⁰copies/μl的质粒标准品。

6、引物和探针溶解稀释至所需浓度并避光保存。

引物一般稀释到10μm/L，探针稀释到5μm/L，密封并避光保存到-20℃冰箱。稀释所用水为灭菌Tris水(Ph7.0～8.0)。

7、Real-Time PCR扩增

选用的扩增试剂盒为Premix Ex Taq试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司。反应体系组分及其体积见表3。

表3.(M表示马尔堡；E表示埃博拉)

扩增条件如下

8、数据分析

9、提取病毒RNA，进行反转录，所得cDNA使用灭菌水梯度稀释，取代阳性样品进行检测验证。

引物探针浓度的优化

1.首先稀释各引物探针至低浓度备用，引物稀释到10μm/L，探针到5μm/L；

2.首先向25μL体系中分别加入0.5μL两种病毒的上下游引物(10μm/L)和0.5μL Taqman探针(5μm/L)，模板各加1μL，Premix Ex Taq反应液仍旧加入12.5μL，剩余体积用灭菌水补足。运行PCR。结果显示Texas Red荧光值非常小，明显低于FAM荧光，表明两种荧光基团同时存在的情况下，Texas Red发光效率颇低，为不影响阳性判断，预提高Texas Red探针引物的加入量，以提高其发光效率便于数据读取。

3.将埃博拉的引物探针加入量提高一倍，即1μL，同时马尔堡的引物探针量不变，其它如上，运行PCR。效果有所提高，但仍有0.5倍的荧光值差异。

4.继续提高埃博拉引物探针的加入量，增至1.5μL，也就是马尔堡加入量的3倍，再次运行PCR。结果两种荧光的发光值趋近1∶1。因此，确定25μL双重荧光定量PCR反应体系中，马尔堡引物探针浓度为200×100nm/L，埃博拉引物探针浓度则为600×300nm/L。

退火温度的选择

理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时要足够高，以减少非特异性结合。在设置退火温度时如下进行：以低于设计引物时估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。初步设定5组温度：52℃，54℃，56℃，58℃，60℃。五组退火温度下均可检测出目的片段，证明该引物和探针性能较好，可适应的温度范围较宽。但荧光信号最强同时Ct值最小的温度为58℃，最终确定最佳退火温度为58℃。

灵敏度的测定

按照已优化的反应体系和反应程序检测梯度模板，图1.为马尔堡病毒1e⁴～1e⁰copies/μl模板检测结果图，前三个梯度模板均出现扩增曲线，后面两个梯度没有明显曲线；图2.为埃博拉病毒1e⁴～1e⁰copies/μ1模板检测结果图，结果同马尔堡。那么认为二者最低检测限都为百位数级，即1e²copies/μl稀释度的DNA。

重复性检测

通过图1.2.五个浓度梯度的DNA模板荧光定量PCR来看，每个梯度2到3个平行实验中各模板所产生的扩增曲线都产生了较为一致的Ct值，重复性较好。

特异性检验

用所建立的方法检测与马尔堡、埃博拉病毒同为虫媒出血热病原的黄热、登革、裂谷热病毒，结果均为阴性。表明本次所设计的引物探针特异性很高。

标准曲线的建立

体系的优劣可通过扩增效率e来反映，e值越趋近于1，说明扩增效率越接近100％，反应体系越佳；e＜1，说明体系扩增效率较低，体系需要优化；e＞1，说明体系中含有抑制物，需要降低甚至排除抑制物的干扰。该领域内公认的扩增效率适宜范围在0.8-1.2之间。分别采用1e⁴～1e²copies/μl模板进行扩增，所得标准曲线为图4.图5.，扩增函数

MbV：Y＝-0.325X+13.467，e＝10^-k-1＝1.11＝111％。(k＝-0.325)

EBOV：Y＝-0.296X+12.144，e＝10^-k-1＝0.977＝97.7％。(k＝-0.296)

本发明的目的就是设计2对新的引物探针，结合运用SmartCyclerII建立一种快速、敏感、特异的荧光定量PCR方法同时检测马尔堡及埃博拉两种丝状病毒。通过序列比对的方式挑选出两种病毒基因组中高度保守的序列，在此序列上分别设计一对引物及一条Taqman探针，建立实时荧光定量PCR反应体系，并进行优化，检测该方法的灵敏度和特异性。本发明检测方法非常适用于马尔堡、埃博拉病毒同时检测，与其它几种虫媒出血热病毒如黄热，登革，裂谷热无交叉反应。