特异性引物

摘要： 植物内生菌能够帮助植物生长,增强其抗逆性与抗病性,研究植物内生菌对了解植物入侵机制、保护生态环境与农业的健康发展具有重要意义。通过阅读相关文献,总结归纳了降低植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序(16S-seq)中宿主基因污染的4种方法,即:①寻找特异性错配引物用来扩增细菌16S rRNA基因;②添加特异性阻断物用来抑制宿主16S rRNA基因扩增,如PNA-PCR和LNA-RCR钳位技术;③在文库构建过程中剪切宿主细胞器的16S rRNA基因,如Cas-16S-seq方法;④改变PCR扩增流程,如巢式PCR技术。了解上述各种方法的特点,有助于在植物内生菌16S-seq中选择合适的方法,避免或者减少宿主基因的污染,更准确地进行植物内生细菌群落的研究。

摘要： 研究根据罗湖病毒(Tilapia lake virus,TiLV)编码RNA聚合酶的基因片段1设计1对特异性引物和探针,建立一种检测TiLV的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法,并对该检测方法进行了反应体系和条件优化。结果表明,优化的20μL反应体系:2×Probe RT-PCR Master Mix 10μL,QN Probe RT-Mix 0.2μL,5μmol/L的引物TiLV-qF、TiLV-qR、探针TiLV-qP各1μL,模板1μL,补充RNase-free water至20μL。优化的反应条件:反转录45°C20 min;预变性95°C5 min;扩增95°C15 s,60°C1 min,40个循环。荧光收集设置在60°C退火延伸时进行。本文建立的RT-qPCR方法检测TiLV的特异性好,重复性好,灵敏度高,灵敏度为2.5×10^(-8) ng/μL,可为TiLV的监测和预防提供技术支撑。

摘要： 【目的】明确甘肃省渭源县党参Codonopsis pilosula病样中的茎线虫种类。【方法】采用形态学特征、ITSrDNA与28S-rDNA序列系统发育分析、特异性引物PCR扩增、PCR-ITS-RFLP相结合的方法进行种类鉴定。【结果】甘肃省党参茎线虫群体形态特征与花生茎线虫Ditylenchus arachis相似,形态测量均值虽存在差异,但是范围值基本一致;系统发育分析显示,该线虫与花生茎线虫聚为一支,特异性引物PCR扩增片段、PCR-ITSRFLP图谱均与花生茎线虫相同。【结论】结合形态特征与分子特征分析,将甘肃党参茎线虫群体鉴定为花生茎线虫,表明该线虫已在甘肃发生分布。

摘要： 为明确中国玉米穗腐病致病禾谷镰孢复合种的菌群遗传结构、致病力、毒素化学型及其相互关系,研究人员分析了7个地理区域禾谷镰孢复合种的遗传多样性,并采用花丝通道注射接种法测定了各镰孢菌的致病力,利用产毒基因特异性引物进行了毒素化学型的检测。研究结果表明,在禾谷镰孢复合种中共检测到等位的位点数48个。

摘要： 为了特异性地鉴别桔梗药材Platycodon grandiflorum及其易混品,通过优化DNA提取方法,并基于ITS(internal transcribed spacer)序列上的特异性位点,设计特异性引物,进行特异性PCR扩增,以扩增成功率为判定指标快速鉴别桔梗药材真伪.研究结果表明,改良CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)法提取DNA较纯且100％扩增成功;基于桔梗293位和538位的特异性位点,设计特异性引物Ul/Dl,且特异性PCR鉴别中,仅桔梗能扩增得到约264 bp的特异性条带,其他药材均为阴性扩增.ITS序列以及特异性引物可准确鉴别桔梗及其常见易混品,为桔梗药材的基原鉴定提供科学依据.

摘要： 基于环介导等温扩增技术(LAMP),建立掺假牛羊肉微流控快速检测方法.使用Takara核酸提取试剂盒分别提取14种肉类DNA,根据特异性基因16SrRNA,分别设计牛、羊、猪、鸡、鸭、狐狸、马3～5组特异性引物.在LAMP反应管优化实验中,进行最佳引物筛选实验、特异性实验;芯片验证实验中进行蝶式芯片点样、芯片特异性实验.最佳引物序列:牛为N3、羊为Y4、猪为Z2、鸡为J3、鸭为ya2、狐狸为H1,马为M2.特异性实验中,每种肉类的核酸,只有在与之对应的引物作用下,才能发生扩增反应.芯片验证实验结果显示,无论是单一肉类品种的DNA,还是几种肉类混合的DNA,微流控芯片都能准确无误的检测到相应的肉类基因的存在,特异性良好.

摘要： [目的]建立基于实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的金山醋酸乳杆菌特异性检测方法,并将其应用于食醋和白酒发酵过程样品的快速检测.[方法]筛选金山醋酸乳杆菌基因组中特异性强的基因序列作为模板设计特异性引物,通过标准菌株、醋醅样品进行PCR验证引物的特异性和准确性,建立RT-qPCR方法分析金山醋酸乳杆菌在不同地区酒醅、醋醅和食醋样品中的含量.[结果]以金山醋酸乳杆菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基(编码pheS基因)为参考序列,设计了一对GC含量55％、Tm值59°C、可扩增199 bp片段的引物.建立的RT-qPCR方法特异性强、灵敏度高且重复性好,检测浓度范围为2.24-10.24 lg(copies/ μL),成功应用于4个地区的酒醅、醋醅和食醋样品检测.对镇江香醋醋酸发酵过程的研究表明,醋醅中的金山醋酸乳杆菌数量先迅速增加,随后稳定在108 copies/g干醅.[结论]本研究建立的RT-qPCR方法可对食醋和白酒发酵过程中金山醋酸乳杆菌进行特异性鉴定和快速定量.

摘要： 甜菜黄萎病是由变黑轮枝菌(Gibellulopsis nigrescens)引起的一种土传真菌病害.快速、准确地检测出变黑轮枝菌(G.nigrescens),对该病害的监测以及防治十分必要.根据变黑轮枝菌(G.nigrescens)的内转录间隔区,设计了一对引物GNS-F/GNS-R并验证该对引物的特异性和灵敏度.结果表明,该对引物仅能从变黑轮枝菌(G.nigrescens)的DNA中扩增出唯一条带,而其他供试菌株的DNA及阴性对照中未扩增出任何条带,片段长度为502 bp;引物的检测灵敏度为1×10-3ng/μL.该病原菌也可在人工接种的发病组织及土壤中被检测到,且土壤中分生孢子的检测阈值为1×104cfu/g.基于该引物建立的常规PCR检测体系适用于甜菜黄萎病的快速检测,可为该病害早期诊断及药剂防治提供参考依据.

摘要： 研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR),对发酵过程中的大茬、二茬发酵0、7、15、28 d酒醅样品进行总细菌、总真菌、耐酸乳杆菌、芽孢杆菌和酵母菌的定量分析.分析结果表明汾酒发酵过程中耐酸乳杆菌和酵母为酒醅中的主体微生物,占总细菌和总真菌总和的80％以上.大茬、二茬发酵中,功能微生物在发酵前期(0～7d)演替规律相似,二茬发酵中后期菌群呈现显著衰亡趋势,且大茬发酵期间各菌群生物量均高于二茬发酵.大茬发酵期间总细菌、耐酸乳杆菌和芽孢杆菌的生物量整体呈上升趋势,分别于28、15、7 d达到最大值(5.53×1016、1.40×1013、1.21×106 copies/g酒醅DNA).在大茬和二茬发酵中总真菌和酵母的生物量在发酵0～7 d差异不大,呈快速增长趋势,大茬发酵在15 d后至发酵结束逐渐上升至最高值(1.07×1015、1.56×1014 copies/g酒醅DNA).二茬发酵中总真菌和酵母生物量在第7天达到最大值(3.03×1014、1.43×1014 copies/g酒醅DNA).

摘要： 为快速检测罗湖病毒(tilapia lake virus,TiLV),根据TiLV编码RNA聚合酶的片段1,设计了6条特异性引物,通过对反应体系优化,建立了检测TiLV的RT-LAMP方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行了评价.结果显示:该方法特异性好,仅能够对TiLV进行特异性扩增,对真鲷虹彩病毒等10种鱼类常见病毒扩增均呈阴性;灵敏度为2.5×10-7 ng/μL,且30 min即可得到试验结果;两组重复试验显示,该方法重复性良好,且熔解曲线相一致.结果表明,成功建立了快速检测TiLV的RT-LAMP方法.本研究为快速诊断、监测TiLV提供了技术支撑.

摘要： 为建立以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)特异性核酸检测方法,本研究以IAPV polymerase polyprotein基因为靶基因设计合成一对特异性引物,在中国首次建立了IAPV的RT-PCR检测方法.结果表明,对蜜蜂5种不同病毒进行RT-PCR检测,只有IAPV病毒检测为阳性,具有良好的特异性;对IAPV的最低检测限为103copies/μL,具有比较高的灵敏度;利用该检测方法对来自福建省不同养蜂场的8份蜜蜂样品进行检测,有3份样品为阳性,同时通过序列比对分析,同源性达到99％以上,进一步证实为IAPV,显示该方法具有很好的应用性.该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性.

摘要： 为建立猪呼吸道病相关几种的病毒PCR/RT-PCR检测方法,本试验根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒(PRV,gB,AF257079)、猪圆环2型病毒(PCV2,ORF2,NC 005148)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV,ORF6,NC 001961)、猪瘟病毒(CSFV,C,AY805221)、猪细小病毒(PPV,NS1,NC 001718)和猪流感病毒(SIV,M,GU086140)6种常见病毒的相关保守基因序列分别设计一对特异性引物,通过对其条件的优化,建立了检测以上6种病毒的PCR/RT-PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为192 bp(PRV)、255bp(PCV2)、364bp (PRRSV)、530bp (CSFV)、759bp (PPV)和981 bp(SIV).通过实验证明该检测方法具有良好的特异性和敏感性,对该6种病毒的核酸检测最低浓度依次为2.5×10-3ng、2.2×10-4ng、3.2×10-3rng、8.3×10-3ng、3.7× 10-3ng和3.7×10-3ng.该方法的建立为检测以上6种病毒提供了有参考价值的方法.

摘要： 本试验建立了一种猪输血传播病毒Ⅰ型和Ⅱ型(Porcine torque teno virusⅠand Por-cine torque teno virusⅡ,PTTVⅠand PTTVⅡ)的双重PCR检测方法,根据GenBank中PTTVⅠ型和PTTVⅡ型基因序列设计了两对特异性引物,扩增产物大小分别为1677bp和469bp,经试验条件的优化,建立了检测PTTVⅠ和PTTVⅡ双重PCR方法,引物最佳比例为13∶7,最适退火温度为55.7°C.用所建立的方法检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2),猪细小病毒(PPV),猪伪狂犬病病毒(PRV)及大肠杆菌(E.coli)等病原,均无特异性条带,不存在交叉反应,应用此方法对辽宁省14个市354份血样进行检测,结果猪TTVⅠ型总阳性率为34.18％,猪TTVⅡ型总阳性率为60.16％,两者混合总感染率为21.46％.

摘要： 目的:为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒.rn 方法:根据H1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量PCR技术.rn 结果:结果显示,该方法的敏感性可达100copies/μL,除Hl亚型SIV外,对H3亚型、H9亚型SIV以及猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为92.3％.rn 结论:结果提示,该方法特异性强、重复性好,有望成为H1亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法.

摘要： 目的:根据GenBank中副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列,利用生物学软件Primer Express2.0设计1对特异性引物和Taqman-MGB探针,建立Taqman-MGB荧光定量PCR方法.rn 方法:对引物浓度、退火温度等反应条件进行优化,建立了Taqman-MGB探针荧光PCR标准曲线,进行灵敏度、特异性、重复性及临床应用试验.rn 结果:该检测方法最低检出限为10copies/μL;与普通PCR相比,该荧光实时定量PCR方法灵敏度更高;该方法可以扩增出猪嗜血杆菌目的基因,而扩增不出大肠杆菌0157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌基因,表明该检测方法特异性强;不同浓度的pGEM-T/HPS重组质粒分别进行了组间和组内验试验结果显示,重复性稳定性良好.rn 结论:该荧光实时定量PCR方法能够很好地用于副猪嗜血杆菌的临床检测.

摘要： 根据GenBank发表的序列，对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52株、H120株和M4l株全基因组序列进行比较，设计并合成了两对特异性引物，其中A引物能以M41株模板，特异性扩增出1791bp的目的片断，从而特异鉴定IBV M41株;另一对B引物能以H52株和H120株为模板，特异性扩增1700bp的目的片断，再用限制性内切酶Nae I对PCR产物进行酶切，H120株能够被切成1000bp和700bp两个片段，而H52株的PCR产物不存在该酶切位点，从而能区分H52株和H120株。本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异等优点，进一步完善了种毒特异性检验方法，为IBV活疫苗的分子鉴别检验奠定基础。

摘要： 本研究根据CDV核蛋白(N)基因和CPV、MEV结构蛋白VP2基因的相对保守区设计了两对特异性引物，经试验条件的优化，建立了同时检测CDV和CPV／MEV的双重PCR方法。通过检测36份临床样品，对双重PCR方法和胶体金试纸条方法进行了对比试验。结果表明，建立的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可扩增出5.63 ng的总核酸量;与试纸条方法相比，双重PCR方法对CDV检出率提高了5.56％，对CPV／MEV检出率提高了2.78％。说明该方法可用于检测宠物犬和毛皮动物中CDV和CPV／MEV的混合感染。

摘要： 建立小麦根部常见土传真菌Rhizoctonia cerealis,Bipolaris sorokiniana,Gaeumannomyces graminis var.tritici,Fusarium.pseudograminearum和F.graminearum的多重PCR检测方法,为这些病原真菌的快速检测提供依据.结果表明,5对引物只能扩增出目标DNA,其他参考病原物株系均未扩增出条带,5对引物只能扩增出目标DNA,其他参考病原物株系均未扩增出条带,说明各引物具有很强的特异性,可以作为鉴定5种病原菌的特异性引物.Multi-PCR灵敏度检测结果表明,可以检测到的DNA下限为0.39ng,同时,利用本检测体系分别对来自封丘、沁阳、周口、原阳田间病株进行检测.本研究建立的Muhi-PCR检测体系,具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,为土传真菌病原真菌提供新的检测技术.

摘要： 本文研发了一种实时荧光定量PCR方法，用于从血样中诊断猪附红细胞体，并调查日本商品猪场该病的流行情况。首先根据16s rRNA序列设计4条通用引物和两条特异性引物。运用先前检测感染阳性的样本建立基于SYBR染料的实时荧光定量PCR检侧方法，然后进行溶解曲线分析。随后使用6个阳性样本利用终点PCR方法评价2中引物配比的PCR检测方法，包括特异性引物对和通用引物对。并进一步运用日本11个猪场的119个健康猪的血样进行监测，以确定其流行率。通过对11个猪场的检测发现了猪嗜血支原体和解脲支原体，而且在日本猪场具有较高的感染率。

摘要： 本实验选择马身猪和大白猪作为试验对象，两品种同一时间开始组建群体，采用相同的营养水平和饲喂方式，长到一定阶段后屠宰，提取总组织RNA并反转录为DNA。根据课题组克隆获得的马身猪ApoA5基因cDNA序列(HM991258设计特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，定量分析mRNA在两个品种猪的不同组织、不同发育阶段的表达变化规律。结果表明却oASmRNA表达量受到组织、品种和发育阶段的调控。

摘要： 本发明提供包含阻断剂和第一引物寡核苷酸的寡核苷酸组合物。所述阻断剂寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻断剂可变子序列的第一序列。非靶特异子序列在其3’和5’端被所述靶中性子序列侧接，并且与该靶中性子序列连续。所述第一引物寡核苷酸足以诱导酶促延伸；本文中，第一引物寡核苷酸包含第二序列。所述第二序列与该靶中性子序列的5’端重叠至少5个核苷酸；本文中，第二序列包含重叠子序列和非重叠子序列。所述第二序列不包含该非靶特异子序列。

摘要： 本发明公开了一种特异性PCR引物及利用其鉴定鬣羚(Capricornis sumatraensis)的方法，该所述方法包括：1)提取待测样品的总DNA；2)采用特异性PCR引物对所述总DNA进行PCR扩增；3)取步骤2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；在步骤3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若泳道中出现1条特定长度的条带，则判断所述待测样品为来自鬣羚的样品，若泳道中不出现1条条带，则判断所述待测样品不是来自鬣羚的样品。该方法中的DNA模板可从动物的毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便中提取，大大降低了取样的难度，且该方法可简便快捷地鉴定鬣羚，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定鬣羚的目的。

摘要： 本发明提供包含阻断剂和第一引物寡核苷酸的寡核苷酸组合物。所述阻断剂寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻断剂可变子序列的第一序列。非靶特异子序列在其3’和5’端被所述靶中性子序列侧接，并且与该靶中性子序列连续。所述第一引物寡核苷酸足以诱导酶促延伸；本文中，第一引物寡核苷酸包含第二序列。所述第二序列与该靶中性子序列的5’端重叠至少5个核苷酸；本文中，第二序列包含重叠子序列和非重叠子序列。所述第二序列不包含该非靶特异子序列。

摘要： 本发明提供包含阻断剂和第一引物寡核苷酸的寡核苷酸组合物。所述阻断剂寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻断剂可变子序列的第一序列。非靶特异子序列在其3’和5’端被所述靶中性子序列侧接，并且与该靶中性子序列连续。所述第一引物寡核苷酸足以诱导酶促延伸；本文中，第一引物寡核苷酸包含第二序列。所述第二序列与该靶中性子序列的5’端重叠至少5个核苷酸；本文中，第二序列包含重叠子序列和非重叠子序列。所述第二序列不包含该非靶特异子序列。

摘要： 本发明公开了一种特异性PCR引物及利用其鉴定鬣羚(Capricornis sumatraensis)的方法，该所述方法包括：1)提取待测样品的总DNA；2)采用特异性PCR引物对所述总DNA进行PCR扩增；3)取步骤2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；在步骤3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若泳道中出现1条特定长度的条带，则判断所述待测样品为来自鬣羚的样品，若泳道中不出现1条条带，则判断所述待测样品不是来自鬣羚的样品。该方法中的DNA模板可从动物的毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便中提取，大大降低了取样的难度，且该方法可简便快捷地鉴定鬣羚，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定鬣羚的目的。

摘要： 本发明涉及帕利亚姆血清群病毒群特异性与血清型特异性RT‑PCR检测引物及试剂盒，该试剂盒包括4对引物，分别为PALV‑S7‑F和PALV‑S7‑R、CHUV‑S2‑F和CHUV‑S2‑R、BCV‑S2‑F和BCV‑S2‑R、DAV‑S2‑F和DAV‑S2‑R；还包括空白对照模板、阳性对照模板和PCR扩增试剂。采用本发明试剂盒可以进行PALV群特异性RT‑PCR检测，能够准确检测出样品中的PALV病毒；之后通过本发明试剂盒，进行PALV血清型特异性RT‑PCR检测，可对CHUV、BCV与DAV毒株的血清型进行判断；检测结果准确、可靠，为我国PALV的流行病学调查提高了强有力的技术支持。

摘要： 本发明公开了一种人参特异性RAPD标记的DNA片段、鉴别人参的SCAR标记特异性引物对及方法。本发明通过随机扩增多态性DNA方法筛选人参特异的DNA片段，再经回收，克隆及测序得到特异序列；根据特异性序列设计特异性引物1和2，将RAPD标记转化为稳定的SCAR标记，在SCAR标记快速分子检测人参的方法中，可扩增并获得特异带型，为约300bp、130bp大小的2个DNA片段。但在西洋参、三七、景天三七、栌兰、珠子参、水田七、姜黄、竹节参、商陆以及所研究的58种其他中药材中则无该特异性带型，均为阴性扩增。使用此方法鉴别人参的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。可用于人参药材的快速鉴定。

摘要： 本发明提供一种鉴定褐大头蚁的特异性引物对、含有所述特异性引物对的试剂盒及其使用方法和应用，涉及昆虫鉴别技术领域，本发明所述特异性引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的特异性引物对特异性强，以至于可以将褐大头蚁与其他大头蚁属的昆虫进行区分。本发明所述的特异性引物对的检测灵敏度可达到22.00pg/μL，对于卵或蚂蚁残体等只能提取到微量DNA的样品也可以实现检测，灵敏度高。在此基础上，本发明构建了含有上述特异性引物对的试剂盒，利用该试剂盒可快速有效的鉴别褐大头蚁，特异性强、灵敏度高，可满足口岸检验检疫快速通关的要求。

摘要： 本发明涉及微生物学技术和分子生物学技术交叉领域，具体的说一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法及其专用引物。具体为，将待测样品悬液涂布含链霉素的LB培养基固体平板，挑取黄色菌落反复划线分纯，经液体培养后，提取纯菌株基因组DNA，采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCR扩增16SrDNA片段，存在阳性扩增且扩增得到504bpPCR产物的片段即为鞘氨醇单胞菌。采用本发明提供的属特异性引物扩增结合链霉素抗性平板法能够特异性的从土壤中直接分离可培养的鞘氨醇单胞菌，针对这一特殊种属进行计数，同时获得可培养的鞘氨醇单胞菌菌株资源。

摘要： 公开了用于包含复杂靶基因库的样品的单一步骤PCR的组合物和方法，其可以同时扩增样品中常见的各种各样的变体靶基因序列，同时保持基因变体的原始比率。本文描述的组合物和方法利用(1)基因特异性引物库以及(2)非特异性PCR引物，所述基因特异性引物库包含含有靶序列的复杂混合物的样品中存在的多种变体，这些都是混合物中变体扩增所需的，其可能引入扩增偏倚，所述非特异性PCR引物被设计为靶向多种基因特异性引物变体，并且消除扩增偏倚。