羊口疮病毒

摘要： 羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus, ORFV)引起的一种接触性传染病,绵羊与山羊是主要宿主。该病属于自限性疾病,当不发生继发性感染时,机体调节就可以控制疾病发展,逐渐恢复痊愈。该特性可能与病毒的基因组结构有关,因此,重点阐述了羊口疮病毒基因组编码的蛋白及其功能。此外,还对羊口疮病毒的流行病学、病原学、临床诊断与防控进行了概述,为羊口疮病毒的进一步研究提供了信息与参考。

摘要： 羊口疮病毒(ORFV)是重要的人兽共患病病原,不仅严重危害养羊业,而且威胁人类健康。干扰素刺激基因(stimulator of interferon genes,STING)作为细胞的DNA感受器,在机体天然免疫中起重要作用。为探索STING在ORFV感染中的作用及其对病毒复制的影响,本研究构建了ORFV感染羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)的模型,分析了ORFV感染细胞后对STING及其相关基因的动态表达,探索了STING基因在干扰表达和过表达状态下对ORFV在细胞上增殖的影响。结果表明,ORFV感染OFTu细胞后,STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IFN-β、IL-1β和TNF-α的转录明显升高。OFTu细胞过表达STING可导致RIG-1、DDX41、IFI16、IRF3、IRF7、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β等基因转录上调。OFTu细胞在STING过表达状态下感染ORFV可介导TBK-1、IRF3、IFN-β和TNF-α的转录升高,抑制ORFV的复制;在STING表达干扰的状态下,ORFV感染OFTu细胞降低了TBK-1、IRF3、IFN-β和TNF-α的转录,增加了ORFV的复制。这表明STING蛋白能够增强抗病毒细胞因子的表达,抑制ORFV在OFTu细胞中的增殖,研究结果为深入理解STING在羊口疮病毒感染和复制中的作用提供了科学的理论依据,也为深入探索ORFV感染和致病的分子机制提供了基础数据。

摘要： 以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板,用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列,并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析;优化合成059基因编码序列,连接载体pET42a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌,采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白,并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度;将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层,分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育,利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0 h的细胞黏附GTPV的量,研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明:成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列,其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域,显示出肝素结合活性;该蛋白羧基端有2个跨膜区,不利于蛋白质的表达,但优化DNA序列构建的重组质粒菌,经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达;免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性;Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06 mg/mL;荧光定量PCR检测数据显示,不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同,表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用,能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。

摘要： 为研究羊口疮病毒(ORFV)VIR蛋白的生物活性,扩增了绿色荧光蛋白基因EGFP和ORFV的VIR基因,构建了真核表达载体pVAX1-EGFP和pVAX1-VIR-EGFP,转染至BHK-21细胞,在荧光显微镜下进行了EGFP和VIR与EGFP融合蛋白的绿色荧光检测,用ORFV的全病毒血清作一抗,进行了Western blot检测,应用生物信息学方法,构建了VIR蛋白和VIR与EGFP融合蛋白的三级结构并进行了比较,进行了细胞表位预测。结果显示,pVAX1-EGFP和pVAX1-VIR-EGFP载体在BHK-21细胞中均表达出了绿色荧光,但VIR与EGFP融合蛋白表达的荧光弱于EGFP表达的荧光,Western blot检测出了53 ku左右的融合蛋白条带,说明VIR与EGFP融合蛋白具有较高的特异性。VIR蛋白和VIR与EGFP融合蛋白的三级结构直观地反映了VIR蛋白和VIR与EGFP融合蛋白的差异,预测出VIR蛋白的优势B细胞抗原表位4个,HLA-A*0201限制性CTL优势表位3个,为VIR蛋白的生物学功能研究奠定了基础。

摘要： [目的]确定内蒙古地区规模化养殖场发生的疑似羊口疮的病原。[方法]无菌采集疑似羊口疮病料7份,经剪碎、研磨、离心等处理后接种山羊皮肤成纤维细胞(goat skin fibroblasts,GSFs)培养;对分离到的病毒毒株进行电镜观察;利用B2L基因引物进行特异性PCR鉴定,对获得的B2L基因序列测序,构建系统发育树,并进行同源性分析。[结果]3份病料经GSFs培养48 h后出现明显病变,分离的病毒经负染后在电镜下观察呈卵圆形,病毒粒子长220~250 nm,宽125~200 nm,符合羊口疮病毒(orf virus,ORFV)粒子的形态特征,并将其命名为NM-ORFV-1株、NM-ORFV-2株、NM-ORFV-3株。分离株经B2L基因PCR鉴定获得1137 bp的扩增产物,与预期一致;系统发育树及同源性分析显示,NMORFV-2株与NM-ORFV-3株遗传关系密切,处于同一分支,且与ORFV KP336704(中国)分离株的亲缘关系最近,同源性达到99.4%;NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株及NM-ORFV-3株处于不同分支,NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株的同源性为99.1%,与NM-ORFV-3株的同源性为99.0%,且与ORFV JQ904789(中国)疫苗株亲缘关系最近,同源性为99.6%。[结论]内蒙古地区规模化养殖场疑似羊口疮病例的病原是ORFV。

摘要： 旨在探究羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡以及诱导机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)表达水平的影响。在ORFV118基因克隆基础上,成功构建真核表达载体pEGFP-ORFV118;将pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞,Western Blot鉴定ORFV118蛋白表达的正确性;流式细胞仪检测ORFV118基因对细胞周期及凋亡的影响;RT-qPCR检测细胞周期相关基因CDK2和P21、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7、P53和BCL2L11的mRNA的表达水平,并利用RT-qPCR和ELISA方法检测免疫相关的细胞因子表达的变化。结果显示,成功扩增ORFV118基因,全长为309 bp。ORFV118蛋白的表达阻滞了细胞的DNA合成期(S期),促进了DNA合成后期(G2/M期)且下调基因CDK2的mRNA表达水平;可抑制细胞的凋亡作用,且下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表达水平;对细胞因子IL-1β和IFN-γ呈不同程度的抑制作用,而对IL-6和TNF-α呈促进作用。

摘要： 为筛选与羊口疮病毒(OrfV)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,构建了羔羊睾丸(LT)细胞酵母双杂交cDNA文库.采用Trizol法提取LT细胞总RNA,运用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,再经同源重组法将pGADT7-Rec载体与cDNA共转化至Y187酵母菌株,利用营养缺陷型选择性培养基(SD/-Leu)筛选阳性克隆,并鉴定文库质量.结果显示:LT细胞酵母双杂交cDNA文库构建成功,其文库滴度为2.33×10^(8) CFU?mL^(-1),文库容量达3.5×10^(9) CFU;随机挑选34个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为250~2000 bp,平均大小约为1000 bp,文库重组率达100%.由此表明,本文库达到高质量文库条件,可作为研究OrfV与宿主细胞间互作机制的生物材料.

摘要： 青海祁连地区某规模化养殖场羊群疑似感染羊口疮,为准确鉴定此地羊口疮病原并对流行毒株进行遗传变异研究,采集疑似羊口疮病毒感染的羊唇部结痂组织并进行PCR鉴定,对鉴定的3株ORFV毒株的抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR和GIF分别进行克隆、测序及遗传进化分析。从病料中鉴定出3株ORFV,并分别命名为ORFV1/Ovis/QL/Qinghai/2021/China、ORFV2/Ovis/QL/Qinghai/2021/China和ORFV3/Ovis/QL/Qinghai/2021/China。经分析显示,ORFV1、ORFV2和ORFV3的B2L、F1L、VIR和GIF与数据库中ORFV参考株的相应的基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为99.21%~97.27%和99.74%~97.35%、99.12%~95.41%和99.12%~92.69%、98.19%~95.29%和96.72%~91.26%、99.62%~95.21%和100.00%~93.96%。基于ORFV的4个基因遗传进化树分析表明,中国青海祁连ORFV毒株分别聚在中国株的进化分支上(B2L基因),印度毒株和中国毒株的进化分支上(F1L基因),印度毒株、中国毒株和阿根廷毒株的进化分支上(VIR基因),中国毒株德国株、美国株、日本株、新西兰株、英国株、法国株、芬兰株的进化分支上(GIF基因);青海祁连ORFV流行株具有多样性,与疫苗株之间有一定的差异,流行株间也有差异。结果表明,该养殖场确实发生了羊口疮疫病,病原为ORFV,且ORFV来源可能不同,4种基因发生了较大的变异,有必要开展更为深入的流行病学调查,为防控青海地区的羊口疮疫病提供科学依据。

摘要： [目的]获得羊口疮病毒(ORFV)115基因表达蛋白。[方法]利用Oligo 7软件设计并筛选出115基因特异性扩增引物,以ORFV FJ-ND株基因组为模板,通过PCR技术扩增获得其基因序列,再将115基因克隆至pGEX-6p-1上,重组质粒pGEX-6p-115,并对其进行测序鉴定,鉴定正确后转化RosettaganmiB(DE3)感受态细胞,通过优化IPTG浓度和诱导时间获得重组融合蛋白最佳表达条件,用SDS-PAGE对表达的目的蛋白进行分析。[结果]115基因全长450 bp,编码149个氨基酸;115基因可以在RosettaganmiB中表达,重组蛋白分子大小约42 kDa,主要以包涵体形式表达。[结论]成功克隆了ORFV 115基因,构建了pGEX-6P-115原核表达质粒,优化了重组蛋白表达条件并进行纯化,为进一步探索ORFV 115蛋白在感染宿主过程中的机制和作用奠定基础。

摘要： 目的:调查安徽临泉地区羊群中O型口蹄疫病毒(Type O FMDV)、A型口蹄疫病毒(Type A FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)和羊痘病毒(SGPV)的血清抗体水平。方法:从安徽临泉多个养殖场随机采集113份羊血液样品,分离血清后利用商品化酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒分别对上述几种病毒的抗体水平进行检测。结果:Type O和Type A FMDV抗体总体阳性率分别为66.4%和60.2%,PPRV抗体总体阳性率为69.9%,ORFV抗体总体阳性率为69%,SGPV抗体总体阳性率为37.2%。结论:几种病毒血清抗体总体阳性率均低于70%,未达到国家规定的免疫防控要求,需要加强免疫。

摘要： 为构建羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒,同时验证其在MDBK细胞中的表达,本试验以pVAX1为真核表达载体,在前期构建的克隆质粒pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L基础上,构建真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L,对其分别进行双酶切和测序鉴定,将鉴定正确的真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L转染至MDBK细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测目的基因表达.结果显示,双酶切鉴定和序列测定表明真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L构建成功,RT-PCR和IFA同时验证目的基因在MDBK细胞浆中能瞬时表达.本试验构建成功的真核表达质粒为下一步羊口疮病毒核酸疫苗研究奠定基础.

摘要： 为了分析羊口疮病毒湖北株(ORFV-HB-YX株)F1L基因遗传变化规律,参照GenBank公布的ORFV-F1L基因序列设计特异性引物,对ORFV-HB株F1L基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析.结果显示,F1L基因PCR扩增产物大小为999bp,编码333个氨基酸,系统进化树显示HB-YX株与GenBank参考毒林的核苷酸序列同源性为95.0％～98.0％,与福建FJ-GO株同源性高达98％亲缘关系最近,属于同一分支.

摘要： 目的：克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性. 方法：根据Gen-Bank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上,获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单克隆进行扩大培养,经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析. 结果：成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L,读码框正确.获得了43ku的表达产物,与预期目的蛋白大小相符;纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应. 结论：成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达,且纯化后蛋白具有良好的反应原性.

摘要： 本研究从我省闽侯地区养羊场发病羊组织中分离到1株羊口疮病毒ORFV-MH株.对ORFV-MH株B2L基因片段进行扩增和序列分析,结果显示,ORFV-MH株与国内福建、新疆、广西等毒株的同源性在99％以上,与FJ-YX株的同源性为99.8％,表明ORFV-MH株可能与FJ-YX株有着共同的来源.

摘要： 为了研究羊口疮病毒(ORFv)新疆野毒株的遗传进化情况,参照GenBank公布的ORFv B2L和F1L基因序列,设计特异性引物,对ORFv SHZ1新疆野毒株B2L和F1L基因进行PCR扩增,克隆、测序后进行遗传进化分析。结果:新疆野毒株SHZ1与GenBank公布的其他17个毒株相比,B2L基因核苷酸同源性为97.28％～98.86％,推导氨基酸同源性为88.65％～90.50％;F1L基因核苷酸同源性为94.56～97.07％,推导氨基酸同源性为93.82％～95.88％。基于B2L基因的遗传进化树分析发现,SHZ1株B2L基因与我国现用疫苗株B2L基因亲缘关系较近;而基于F1L基因的遗传进化树显示,SHZ1株与意大利分离株的亲缘关系最近,推测ORFv SHZ1株可能是国外流行株与疫苗株重组后产生的一个变异株。

摘要： 羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的一种羊属动物接触性皮肤传染病,也是人畜共患传染病之一.根据0RFv与宿主细胞相互作用的特点，本研究选定ORFV胞内复制的关键基因DNA poiymerase为靶向基因，运用RNAi技术进行靶向基因沉默的体外试验研究。通过GenBank中注册的标准株ORFV-NZ2的mRNA序列，采用网络自动筛选平台将靶序列通过基因BLAST分析以排除siRNA非特异性抑制其它基因的可能性。在594bp~984bp的靶序列上，遴选出分值较高的3个shRNA候选片段，起始点分别为596,875和947，分别命名为D-875、D-947和D-596。按照shRNA一般构成模式为:正义链TG sen TTCAAGAGA anti CTTTTTTC (Hpa I);反义链TCGAGAAAAAAG sen TCTCTTGAA anti CA(Xho I)。其中TTCAAGAGA为发夹结构;每个片段设置Xho I和Hpa I位点。靶序列引物设计:上游引物TAAGCGATCGCGCGGCGATTCACGCTTAC(SgfI);下游弓肋TAAGCGGCCGCGATGGTCCCGTTGTTGTTG(NotI)。将合成的shRNA候选片段插入慢病毒表达载体pLL3.7,构建的重组质粒分别命名为pLL3.7-D947,pLL3.7-D875,pLL3.7-D596和pLL3.7-D。PCR鉴定结果表明，重组表达载体pLL3.7-D596为阳性重组子，可用于将siRNA转染293T细胞，其它重组子仍需进一步优化。本研究结果为进行ORFV-DNA Polymeras基因沉默的体外试验奠定了基础。

摘要： 本发明通过同源重组，创新性的利用蚀斑与反向蚀斑筛选技术，最终获得无筛选标记重组病毒，尤其是rGTPV‑F1L重组羊痘病毒，该方法简单有效，易于操作，提供了可用于重组病毒疫苗开发的无筛选标记基因重组病毒，为新型ORF疫苗研究提供了新思路和措施，具有广阔的应用前景。

摘要： 本发明公开了一种用于鉴别羊口疮病毒和羊痘病毒的二重PCR检测引物、试剂盒和检测方法。该方法为羊口疮病毒和羊痘病毒的诊断提供了一种快速检测方法，尤其是检测羊痘病毒的PCR引物涉及了羊痘病毒属所有成员，包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒，使得该检测方法凸显集成性、高通量性等特点，为羊口疮病毒和羊痘病毒的诊断、流行病毒调查、防控及治疗提供技术支持与帮助。本发明方法具有特异性强、敏感性高、省时省力的优点。

摘要： 本发明涉及羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法。传统的羊口疮病毒都是从结痂和患病羊的口唇皮屑中分离的，分离周期长，需要盲传5代后才会有病变，同时，病料来源范围小，限制的羊口疮病毒的研究工作。本发明使用特有的Virus holder溶液对唾液、乳汁、内脏等样品进行离心过滤处理后，接种于牛睾丸原代细胞中培养后弃去毒液；加细胞维持液培养后收毒；反复冻融收集细胞培养物，从第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。本发明使用特有的Virus holder溶液处理样品，能够从病毒含量极低的样品中分离羊口疮病毒，取材范围大，病毒分离周期短，稳定性高，能够很好的保持病毒的完整性和活性。

摘要： 本发明属于生物免疫学检测领域，具体涉及一种基于羊口疮病毒B2L、F1L截短融合蛋白的羊口疮病毒抗体捕捉剂及其试剂盒和检测方法与应用。编码所述羊口疮病毒抗体捕捉剂的核酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列，其0.25μg/mL浓度包被的固相载体的ELISA试剂盒检测羊口疮病毒的方法还包括：将待检测血清按照1:200倍数稀释作为一抗孵育1h，洗涤；然后加入稀释倍数1:8000±50的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG作为二抗孵育1h，洗涤。该羊口疮病毒抗体捕捉剂及其试剂盒和检测方法对羊口疮病毒特异性强，检测灵敏度高。

摘要： 本发明还公开了一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用，该检测方法中涉及一种试剂盒，所述试剂盒以ORFV‑B2Ls表达蛋白为包被抗原。本发明表达并纯化了可性的B2L蛋白表达,使其具有良好的生物学活性；本发明可用于羊口疮病毒抗体的检测。

摘要： 本发明提供一种用于重组山羊痘病毒构建的重组转移载体。所述的转移载体主要包含：TK基因的左臂和右臂、两个逆向的p7.5K启动子及其分别调控的羊口疮病毒B2L基因和F1L基因、p11K启动子、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因、两个顺向Loxp序列。所述的转移载体与山羊痘病毒在羊睾丸细胞内发生同源重组，获得表达eGFP的重组山羊痘病毒，在Cre酶作用下，eGFP基因及p11K启动子被特异性敲除，获得潜在共表达羊口疮病毒B2L和F1L蛋白的重组山羊痘病毒。

摘要： 本发明涉及生物工程领域，具体讲，涉及一种表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒，其制备方法及应用。本发明的重组羊口疮病毒采用ORF121基因缺失的羊口疮病毒表达猪圆环病毒2型CAP蛋白，具有免疫率高和安全的技术效果。

摘要： 本发明涉及一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重PCR检测引物，所述引物的序列如SEQ ID No.1‑4所示。利用本发明提供的2对引物对相应靶基因进行PCR扩增，建立多重PCR检测方法，不但能够在1个反应体系中快速鉴定山羊痘病毒和羊口疮病毒，而且可以同时确定是否为这两种病毒混合感染，在临床样品快速筛检和疾病快速确诊等方面有重要的应用价值。

摘要： 本发明公开了一种用于鉴别羊口疮病毒和羊痘病毒的二重PCR检测引物、试剂盒和检测方法。该方法为羊口疮病毒和羊痘病毒的诊断提供了一种快速检测方法，尤其是检测羊痘病毒的PCR引物涉及了羊痘病毒属所有成员，包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒，使得该检测方法凸显集成性、高通量性等特点，为羊口疮病毒和羊痘病毒的诊断、流行病毒调查、防控及治疗提供技术支持与帮助。本发明方法具有特异性强、敏感性高、省时省力的优点。

摘要： 本发明涉及羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法。传统的羊口疮病毒都是从结痂和患病羊的口唇皮屑中分离的，分离周期长，需要盲传5代后才会有病变，同时，病料来源范围小，限制的羊口疮病毒的研究工作。本发明使用特有的Virus holder 溶液对唾液、乳汁、内脏等样品进行离心过滤处理后，接种于牛睾丸原代细胞中培养后弃去毒液；加细胞维持液培养后收毒；反复冻融收集细胞培养物，从第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变。本发明使用特有的Virus holder溶液处理样品，能够从病毒含量极低的样品中分离羊口疮病毒，取材范围大，病毒分离周期短，稳定性高，能够很好的保持病毒的完整性和活性。