环介导等温扩增

摘要： 阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)是一类食源性致病菌,可引起新生儿脑膜炎、败血症等疾病。环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术是一类新型的恒温核酸扩增技术,具有灵敏度高、耗时短、特异性强、对设备需求低等特点,可与多种检测方法结合应用于食源性致病微生物的检测。作者旨在阐明LAMP的基本原理并归纳结合不同检测方法的LAMP技术在阪崎克罗诺杆菌快速检测中的研究进展。

摘要： 为解决当前乙型肝炎病毒(HBV)基因检测技术在一定程度上存在成本高、操作繁琐、误诊率高等问题,在此提出了一种便携式生物传感平台用于HBV基因的超灵敏检测,可检出低至2 copies/μL的HBV基因。首次通过设计针对HBV检测序列的环介导等温扩增(LAMP)反应,实现了在40 min之内对HBV基因型单拷贝基因的检测。然后,通过在磁球上固定LAMP产物的捕获探针FP(F-Probe),同时在与FP部分互补的FPc(Complementary probe of F-Probe)链上修饰耐热蔗糖转化酶(Inv)构成Inv-FPc信号探针,Inv-FPc与FP杂交后组成信号转导探针。HBV基因的LAMP扩增产物与信号转导探针发生核酸链置换反应,使Inv-FPc信号探针脱离信号转导探针,磁性分离后溶液中的Inv-FPc信号探针可催化蔗糖转化为葡萄糖,最后通过血糖仪进行信号输出,即可间接实现对HBV基因的超灵敏检测。结果表明,所构建的生物传感平台在10~500 nmol/L浓度范围内对HBV基因片段具有良好的信号响应。选用诺如病毒基因对传感器的检测特异性进行验证,其信号与背景信号几乎一致。最后,通过对含10%体积分数人血清中的HBV基因进行检测,传感器依然展现了良好的“是/否”的特异性信号响应。为HBV的分子诊断提出一种新思路,所提出的新式传感器有望应用于HBV的现场即时(point-of-care,POC)诊断。

摘要： 稻瘟病菌Magnaporthe oryzae可通过种子带菌实现远距离传播,导致病害发生并造成严重经济损失。建立灵敏高效且便于操作的水稻种子携带稻瘟病菌的检测方法,是确保种子健康和控制病害发生的先决条件。本研究选取稻瘟病菌的3-磷酸甘油酰基转移酶基因MoSPC3设计合成3对特异性引物,并对反应体系进行优化,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法可特异性地检测稻瘟病菌,对稻瘟病菌DNA样品的检测灵敏度可达到0.24拷贝/μL,远高于普通PCR的检测灵敏度。将该方法用于从中国和马来西亚不同水稻种植区收集的92份水稻种子样品携带稻瘟病菌的检测,结果显示,LAMP方法共检测到89份阳性样品,而普通PCR仅显示有2份样品为阳性。综上,本研究建立了一种适用于水稻种子携带稻瘟病菌的LAMP检测方法,具有简便快捷、灵敏度高等特点,丰富了稻瘟病菌的检测体系,可用于大批量水稻种子样品的健康检测。

摘要： 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)已被广泛应用于鱼类真伪鉴定。LAMP扩增成功的重要前提是获得高质量的核酸。目前为止,DNA提取方法种类繁多,但对适用于LAMP的提取方法缺乏全面的研究。该研究采用十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate,SDS)、Tagliavia、Heating以及2种常用市售试剂盒(Takara,Tiangen),对4种前处理的大西洋鲑鱼组织进行DNA提取,并对DNA得率、纯度、LAMP等方面进行比较分析。结果表明,这5种提取方法从不同前处理的样品中获得的DNA均可用于LAMP反应,采用琼脂糖凝胶电泳及荧光可视化检测都可观测到阳性结果。但在实时LAMP检测中,不同提取方法和不同样品前处理方式的Ct值均存在着极显著差异(P<0.01)。SDS和Tiangen这2种提取方法虽然DNA得率较低,但可获得高纯度的DNA,并在LAMP反应中有着更低的检测限。该研究结果为大西洋鲑鱼组DNA的提取和检测以及适用于LAMP技术的不同提取方法的研究提供了参考依据。

摘要： 该研究建立了金枪鱼制品中的鲣鱼成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。针对线粒体Cyt b基因设计了鲣鱼的特异性引物,着重对内引物FIP/BIP、dNTP Mix、缓冲液和Mg^(2+)浓度等反应参数进行了优化,扩增产物采用恒温实时荧光仪和可视化核酸染料SYBR Green I进行检测,对方法的特异性和灵敏度进行了评价。结果表明,在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、1.6 mmol/L dNTP Mix、3.5μL 10×ThermoPol缓冲液、6 mmol/L Mg^(2+)等参数的优化条件下扩增效果最佳。该方法特异性强,灵敏度高。其检测限为50 pg/μL。采用此LAMP方法对59份市售样品进行检测,检出6份为阳性样品,与DNA条形码检测结果一致。该研究建立的LAMP检测方法可应用于金枪鱼制品中鲣鱼成分的快速特异检测,为监管机构提供技术支持。

摘要： 采用微流控技术可以将食源性致病菌样品的制备、分离、检测等基本单元集成到仅有几平方厘米的芯片上,与分子检测技术相结合,能够满足对食源性致病菌快速现场检测的需要。基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),设计制作出一种用于食源性致病菌快速检测的离心式微流控芯片。通过离心式微流控核酸等温扩增装置实现微流控芯片上的流体控制、等温扩增及可视化检测,可1次进行5种样品的3种食源性致病菌的检测。结果显示,基于LAMP的离心式微流控方法用于检测大肠杆菌、沙门氏菌和单增李斯特氏菌,能够在60 min内完成芯片的可视化检测,并且检测结果具有良好的特异性及敏感性,检测限为10^(3)copies/μL。将微流控技术用于食源性致病菌的核酸提取、等温扩增及检测,具有集成化、易于携带和快速分析等优势,在食品安全快速检测中具有应用的潜力。

摘要： 微流控技术将样本制备、核酸提取纯化和核酸检测等操作步骤集成到微型芯片,经过自动化检测得出实验结果。近年来,特异性强、灵敏度高、检测耗时短的环介导等温扩增技术与微流控技术的结合优化了耗时费力的病原体检测,具有操作简单、对设备和人员要求不高、可实现快速检测自动化等特点。但目前建立的病原体微流控检测体系在兼容样本的核酸提取和多重扩增条件的一体化方面尚存在不足,未来还需要开展更多的研究,解决核酸检测过程中的各项技术难点,建立反应基质载体更好、检测体系更优、用时更短、操作简便且准确性更高的方法,以提高病原体快速检测的效率。

摘要： 建立了免疫磁珠分离(IMS)结合环介导等温扩增(LAMP)检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因tetL的方法。结果表明:经优化后,每微克链霉亲和素纳米磁珠与375 ng生物素标记的芽孢杆菌抗体偶联,在含有1×103 CFU/mL耐四环素蜡样芽孢杆菌的巴氏杀菌乳中,25μL免疫磁珠孵育1 h后,对蜡样芽孢杆菌BA117的捕获率为68.1%。该IMS-LAMP方法特异性高,2 h内对巴氏杀菌乳中耐四环素蜡样芽孢杆菌的检测灵敏度为24 CFU/mL。IMS-LAMP方法具有用时短,灵敏度高,操作简单等优点,可以有效检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因。

摘要： 为建立一种简单、快捷,适用于基层检测猪丁型冠状病毒(PDCo V)的方法,根据Gen Bank上登录的PDCo V N基因的保守序列设计了1组环介导等温扩增(LAMP)引物,以重组质粒p MD19-T-N为模板、羟基萘酚蓝为显色剂,优化反应条件及体系,并检测该方法的特异性及灵敏度。结果显示,该方法与猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应,且最低检测量为5.1×10^(1)copies/μL。进一步对本实验室2016年至2019年在河北保定收集的95份临床样品进行检测,LAMP检测结果与普通RT-PCR检测结果的符合度高,检测时间为1 h。结果表明,本研究中建立的LAMP检测方法简便、特异、灵敏、快速,有望在PDCo V的临床检测中发挥重要作用。

摘要： 环介导等温扩增(LAMP)技术是一种能在恒温设备下对靶基因进行扩增的技术,具有精确、快速、简单及低成本的优点,已广泛应用于食品安全、医疗卫生及农业现场检测等多个领域。本文主要从环介导等温技术的原理、反应体系改进、产物检测方法的改进、LAMP与其他技术的联用,以及目前LAMP在动物病原检测方面的应用进行了分析,并展望了LAMP技术的应用前景,以期为同仁提供参考。

摘要： 本研究建立布鲁氏杆菌LAMP-LFD检测方法，旨在将该方法应用于食品中布鲁氏杆菌的检测。将环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)联合应用,建立了一种快速、便捷的布鲁氏杆菌检测方法.针对布鲁氏杆菌OMP25基因设计4条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针.生物素标记LAMP扩增产物能够特异性地与FITC标记的探针杂交,杂交产物经LFD检测.优化后的扩增温度和时间为63°C反应50min,加上样品的前处理,完成检测仅需80min.LAMP-LFD方法可特异性地检出布鲁氏杆菌,其最低检测限为5.4×100CFU/mL,是利用外引物建立的PCR方法的100倍.试验结果表明,本研究建立的LAMP-LFD方法能够快速、特异地检测布鲁氏杆菌;简单经济,不需要其他辅助仪器,结果即可直观判断;适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用,具有较高的推广价值.

摘要： 本研究根据猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增引物,经过各种条件的优化,建立了PCV2的可视化LAMP检测方法.所建立的方法敏感性高达1fg;无需昂贵仪器,只要在常规水浴锅63°C50min就可以通过肉眼观察颜色直接判定;特异性强,与其他病原无交叉反应.结果表明本研究建立的PCV2LAMP方法简便、特异、快速、灵敏,适合养殖场或县级及以下基层兽医用于猪圆环病毒Ⅱ型感染的快速检测与诊断.

摘要： 致病疫霉(Phytophthora infestans)侵染马铃薯引起的晚疫病是马铃薯生产上能造成巨大经济损失的毁灭性病害之一,每年在世界范围内造成的损失超过60亿美元,也是中国的一类对外检疫对象.选育和使用抗病品种防治农作物病害是防治晚疫病最经济有效的措施,但是由于病原物的变异进化快,抗病品种会迅速的丧失抗病性,其使用年限也越来越短.

摘要： 目的：建立灵敏、特异、快速的LAMP检测布鲁氏菌的方法. 方法：基于布鲁氏菌保守的omp25序列设计了4套引物,同时合成了国内已发表的基于此序列设计的3套引物,将这些引物一起用于检测方法的建立;应用浊度法和电泳法对4种布鲁氏菌进行检测,确定最佳引物;通过对4种布鲁氏菌和其它17种常见菌同时进行检测评价方法的特异性;通过对不同稀释浓度的4种布鲁氏菌的DNA进行LAMP检测以确定方法的灵敏度. 结果：本研究新设计的一套引物被确定为最佳引物;用建立的LAMP法对17种常见菌株进行扩增,结果均为阴性,本方法具有很高的特异性;LAMP法检测猪种S2、羊种M5、牛种104M和布鲁氏菌犬种55226四种布鲁氏菌DNA的灵敏度分别为5×10-4ng、5×10-5ng、5×10-3ng和5×10-4ng;检测反应在30分钟以内完成. 结论：本方法具有快速、灵敏、特异的特点,有望发展成为现场和欠发达地区快速检测布鲁氏菌的有效手段.

摘要： 目的:建立可视化检测猪伪狂犬病毒的环介导等温扩增技术,为临床检测PRV提供技术支撑.方法:本研究根据GenBank中PRVgB基因的保守序列,设计一套特异性引物,并对反应条件进行优化,建立了PRV的LAMP可视化检测方法.结果:该方法能在常规水浴锅65°C30min内实现对目的片段的大量扩增,检测结果可通过肉眼观察颜色直接判定,该方法具有很高的特异性,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;该方法的敏感性高达1fg.应用于临床检测,检测结果与普通PCR一致.结论:建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合基层兽医用于PRV感染的快速检测.

摘要： 本研究根据猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增引物,经过各种条件的优化,建立了PCV2的可视化LAMP检测方法.所建立的方法敏感性高达1fg;无需昂贵仪器,只要在常规水浴锅63°C50min就可以通过肉眼观察颜色直接判定;特异性强,与其他病原无交叉反应.结果表明本研究建立的PCV2LAMP方法简便、特异、快速、灵敏,适合养殖场或县级及以下基层兽医用于猪圆环病毒Ⅱ型感染的快速检测与诊断.

摘要： 环介导恒温扩增技术(LAMP)因扩增效率高设备简单极具应用价值,但其产物易污染环境致假阳性限制了其推广应用.LAMP产物分析技术经历了开放式凝胶电泳,封闭式显色,到免疫薄膜层析显色发展历程,染污问题逐步得到解决.

摘要： 致病性大肠杆菌是一种常见的肠道致病菌,严重威胁人体健康和畜牧生产.本研究根据GenBank中的大肠杆菌O157∶H7的rfbe基因序列,利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4软件设计一套LAMP引物,设计反应程序与体系,建立检测致病性大肠杆菌的LAMP检测方法.结果显示,所建立的大肠杆菌O157∶H7的rfbe基因LAMP方法可检测的细菌最低浓度为1.12×10-4ng/μL,比普通PCR方法要灵敏104倍,具有简便快速、灵敏性好、特异性强、便于观察等优点.结论:本研究建立的大肠杆菌O157LAMP方法因具有操作简便、特异性强等优点,可用于临床样品中致病性大肠杆菌O157∶H7的检测.

摘要： 致病性大肠杆菌是一种常见的肠道致病菌,严重威胁人体健康和畜牧生产.本研究根据GenBank中的大肠杆菌O157∶H7的rfbe基因序列,利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4软件设计一套LAMP引物,设计反应程序与体系,建立检测致病性大肠杆菌的LAMP检测方法.结果显示,所建立的大肠杆菌O157∶H7的rfbe基因LAMP方法可检测的细菌最低浓度为1.12×10-4ng/μL,比普通PCR方法要灵敏104倍,具有简便快速、灵敏性好、特异性强、便于观察等优点.结论:本研究建立的大肠杆菌O157LAMP方法因具有操作简便、特异性强等优点,可用于临床样品中致病性大肠杆菌O157∶H7的检测.

摘要： 致病性大肠杆菌是一种常见的肠道致病菌,严重威胁人体健康和畜牧生产.本研究根据GenBank中的大肠杆菌O157∶H7的rfbe基因序列,利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4软件设计一套LAMP引物,设计反应程序与体系,建立检测致病性大肠杆菌的LAMP检测方法.结果显示,所建立的大肠杆菌O157∶H7的rfbe基因LAMP方法可检测的细菌最低浓度为1.12×10-4ng/μL,比普通PCR方法要灵敏104倍,具有简便快速、灵敏性好、特异性强、便于观察等优点.结论:本研究建立的大肠杆菌O157LAMP方法因具有操作简便、特异性强等优点,可用于临床样品中致病性大肠杆菌O157∶H7的检测.

摘要： 本发明公开了一种快速检测检疫性杂草长芒苋

摘要： 本发明公开一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细环病毒2型DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB。其应用包括使用该试剂盒检测猪细环病毒2型病变组织样品和猪细环病毒2型病原定性研究。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出猪细环病毒2型的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪细环病毒2型带来便利。

摘要： 本发明提供一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系，所述等温扩增体系包括引物、Bst DNA聚合酶和金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒与引物、Bst DNA聚合酶之间通过吸附结合。本发明还提供了上述等温扩增体系的扩增方法。本发明的高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法，能够在常温下将LAMP体系中高浓度的引物吸附在金纳米颗粒表面，同时也能够吸附Bst DNA聚合酶从而抑制其活性，阻止引物之间的错配及延伸，显著提高LAMP的特异性和检测的可靠性。

摘要： 本发明公开了一种快速检测检疫性杂草长芒苋Amaranthus？palmeri的环介导等温扩增的引物及其扩增方法和用途，涉及四条引物，即外引物P-F3，外引物P-B3，内引物P-FIP和内引物P-BIP。四条引物的组合可实现链置换反应，实现针对长芒苋的特异性扩增。反应产物加入显色液，通过颜色变化，肉眼即可判定反应结果。长芒苋环介导等温扩增的特异性引物及其扩增方法可用于检疫性杂草长芒苋基因组DNA的特异快速检测。

摘要： 本发明提供一种免疫磁分离‑环介导等温扩增快速检测芽孢杆菌四环素耐药基因tetL的方法。所述方法包括将羧基磁珠与芽孢杆菌多克隆抗体偶联制备免疫磁珠，然后将免疫磁珠添加到待测样品，得到免疫磁珠‑芽孢杆菌复合物(磁细菌)；通过煮沸法提取芽孢杆菌核酸；针对四环素耐药基因tetL设计特异性LAMP引物，将上述核酸加入LAMP反应体系，于实时荧光定量PCR仪扩增并检测荧光信号。本方法可以快速检测巴氏杀菌乳中芽孢杆菌的四环素耐药基因tetL，降低耐药基因水平转移带来的危害。该方法特异性强，灵敏度高，检测时间短，实现对耐药芽孢杆菌的快速检测。

摘要： 本发明公开一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细环病毒2型DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB。其应用包括使用该试剂盒检测猪细环病毒2型病变组织样品和猪细环病毒2型病原定性研究。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出猪细环病毒2型的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪细环病毒2型带来便利。

摘要： 本发明公开一种猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细环病毒1型DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB。其应用包括使用该试剂盒检测猪细环病毒1型病变组织样品和猪细环病毒1型病原定性研究。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出猪细环病毒1型的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪细环病毒1型带来便利。

摘要： 本发明公开了一种检测猪捷申病毒(porcine tescho virus，PTV)环介导等温扩增引物组及试剂盒。本发明根据PTV保守基因组序列设计了1对外引物F3和B3，1对内引物FIP和BIP，所述的引物组中各引物序列如SEQ ID NO.1‑4所示。此外，根据所设计的引物建立了一种PTV的环介导等温扩增(PTV‑LAMP)方法。该PTV‑LAMP检测方法的放大产物可以直接可视化，以颜色变化观察。本发明建立的PTV‑LAMP方法的检测下限为2.86copy/μL，与除猪捷申病毒之外的其它病毒没有交叉反应，特异性强，灵敏性高，无需昂贵仪器设备，便于在资源有限的农村诊所和野外情况下使用。

摘要： 本发明公开了一种猪盖他病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。本发明根据猪盖他病毒基因组nsP1基因的保守区设计了用于检测猪盖他病毒的环介导等温扩增引物组用于RT‑LAMP分析。使用本发明设计的引物建立了一种检测猪盖他病毒的环介导等温扩增方法，该方法特异性高，不与猪其他病毒交叉反应，且最低检测限可达到2.61copies/μL。应用于猪盖他病毒的检测，可以实现该病毒的快速即时检测，使检测灵敏度和特异性得到提高，同时降低人工和器材成本，缩短周期。本发明的引物组及试剂盒可推广应用于猪盖他病毒的流行病学调查和疫情监控，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。

摘要： 本实用新型公开了一种动物组织免提取直接扩增环介导等温扩增现场检测专用箱装置，包括外箱体、提拉把手、移动箱、第一导流管和第二导流管,本实用新型工作时，在滑槽与滑块的作用下可以使移动箱滑动，在试验环境封闭时方便试管的放置，在电机、中心转轴和转盘的作用下带动PCR管匀速转动，使得水浴加热更加均匀，在限位环的作用下可以控制移动箱移动距离保证装置的封闭性，在温度传感器的作用下可以精确控制水浴温度，在电控阀和第二导流管的作用下可以让水浴用水循环利用，在减振凸块的作用下可以防止装置移动时损坏，在耐磨胶钉和防垢层的作用下可以提高装置的使用寿命，保温层可以保证试验结果的准确性，检测装置体积较小方便携带。