一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒及其应用

摘要

本发明公开一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细环病毒2型DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB。其应用包括使用该试剂盒检测猪细环病毒2型病变组织样品和猪细环病毒2型病原定性研究。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出猪细环病毒2型的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪细环病毒2型带来便利。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪细环病毒2型的环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

猪细环病毒(Torquetenosusvirus,TTSuV)是一种无囊膜，单股负链的环形DNA病毒，根据其核苷酸序列差异，可将TTSuV分为两个亚型即TTSuV1和TTSuV2，其中TTSuV1被归为Iota-torquevirus属，TTSuV2则被归为Kappatorque-virus属。细环病毒由日本学者Nishizawa等于1997年首次在输血后的肝炎患者的血清中发现，其宿主范围非常广泛，目前此病毒已广泛感染非人灵长类、家养及野生动物以及人类。细环病毒在人群中感染率较高，根据各国对不同人群TTV感染的流行病学调查，发现人群的TTVDNA阳性率一般在10%以上。猪细环病毒方面，日本、美国、泰国、韩国、法国、西班牙、加拿大等诸多国家的猪群中也广泛存在猪细环病毒（TTSuV），感染率高达24%～100%不等。不同地区间TTSuV毒株之间核酸序列的同源性可达到86～100%。因为TTSuV2广泛存在于猪群体内，其具体的生物学意义尚未明确。迄今为止，人们仍不清楚TTSuV2的致病性，目前研究只了解到TTSuV2与猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)等病毒存在某种协同作用，当发生混合感染时会加重断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎肾病综合症的症状。

有临床资料显示，TTSuV2含量与猪圆环病毒2型（PCV2）等疾病严重程度存在相关性，故测定TTSuV2的病毒载量具有重要意义。由于目前缺乏相关血清学检测商品试剂，故目前主要使用常规PCR、荧光定量PCR方法和套式PCR等技术手段来检测TTSuV2。但这些技术在运用上尚存在着一些不足并且对硬件方面有较高要求，在结果判定上还需进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，用时也较长，不适合基层和现场检测。因此建立一种简单且灵敏的TTSuV2检测方法，具有一定的临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪细环病毒2型的方法，公开一种快速、实时定量的检测猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细环病毒2型DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；

其中引物的序列分别为：

F3AAGTGCGCAGACGAATGG

B3GGGTTTTTACAGCCGCAGAA

FIPACTCCGCTCTCAGGAGCTCCTTTATGCCGCTGGTGGTAG

BIPGCGGTAATCCAGCGGAACCGTAATCCGTGCGCGCAGTA

LFACACTCAGCTCTGTTCGTGT

LBCCCCCCCTCCATGGAAGAA

所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

所述的猪细环病毒2型DNA模板，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒从疑似猪细环病毒2型病变组织或猪细环病毒2型培养物中提取的猪细环病毒2型基因组DNA。

所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL10-30mM、MgSO₄15-28mM、(NH₄)₂SO₄18-28mM、Tween200.5-1.5℅、Betaine1.3-3.5M和dNTPs2.4-4.8mM，其配制方法在pH为8.6左右条件下，将上述溶剂混合均匀获得。

一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测疑似感染猪细环病毒2型的临床病变组织或培养物中的基因组DNA，是否含有猪细环病毒2型，具体检测步骤包括：

（1）LAMP引物的设计与合成

（2）猪细环病毒2型DNA模板的提取

（3）LAMP反应体系建立

（4）LAMP检测方法。

所述的LAMP反应体系建立以25μL计，

2×反应缓冲液12.5μL

BstDNA聚合酶1μL

FIP40pmol

BIP40pmol

F35pmol

B35pmol

LF20pmol

LP20pmol

猪细环病毒2型DNA2μL

超纯水补足25μL。

所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。

所述的LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在18-25分钟间出现扩增。

本发明的实质性特点和显著的进步是：

1）特异性强

本发明的LAMP方法特异性检测出猪细环病毒2型，所检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。

2）灵敏度高

普通PCR检测方法的灵敏度为1.40×10^-7ng/μL，而使用本发明的LAMP检测方法，检测限约为1.40×10^-8ng/μL，是普通PCR的10倍。

3）迅速获得结果

普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析来判读结果，从基因组DNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在18分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像或者开盖加入荧光染料进行来判读结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。

4）不造成污染

目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖。此外，本发明的LAMP检测方法在结果判读上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。

5）可实时定量

本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪细环病毒2型拷贝数，达到定量检测产物的目的。

附图说明

图1是本发明LAMP方法特异性检测结果；其中1：猪细环病毒2型；2：猪细环病毒1型；3：猪圆环病毒Ⅱ型；4：猪瘟病毒；5：蓝耳病病毒；6：猪细小病毒；7：猪伪狂犬病毒；8：流行性腹泻病毒；9：空白对照（水）。猪细环病毒2型反应管出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增，为阴性结果。

图2和图3是分别使用本发明LAMP方法和普通PCR方法进行的猪细环病毒2型敏感性检测的结果，其中1：1.40×10²ng/μL；2：1.40×10ng/μL；3：1.40ng/μL；4：1.40×10^-1ng/μL；5：1.40×10^-2ng/μL；6：1.40×10^-3ng/μL；7：1.40×10^-4ng/μL；8：1.40×10^-5ng/μL；9：1.40×10^-6ng/μL；10：1.40×10^-7ng/μL；11：1.40×10^-8ng/μL；12：water。猪细环病毒2型原始DNA的起始浓度为1.40×10²ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的LAMP法检测限约为1.40×10^-8ng/μL，而普通PCR方法检测限约为1.40×10^-7ng/μL。

图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪细环病毒2型基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。

图5是本发明猪细环病毒2型定量标准曲线；利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪细环病毒2型拷贝数。

具体实施方式

1、材料的准备

猪细环病毒2型、猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和流行性腹泻病毒；为市售疫苗毒或广西兽医研究所分离鉴定和保存。LAMPDNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0552。

2、LAMP引物的设计与合成

根据GenBank中的猪细环病毒2型ORF1基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，LF和LB为环引物；其中F3、B3为猪细环病毒2型PCR检测引物，其中

F3AAGTGCGCAGACGAATGG

B3GGGTTTTTACAGCCGCAGAA

FIPACTCCGCTCTCAGGAGCTCCTTTATGCCGCTGGTGGTAG

BIPGCGGTAATCCAGCGGAACCGTAATCCGTGCGCGCAGTA

LFACACTCAGCTCTGTTCGTGT

LBCCCCCCCTCCATGGAAGAA。

3、病毒基因组DNA提取

使用康为世纪生物科技有限公司生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，提取猪细环病毒2型DNA或者疑似猪细环病毒2型感染的病变组织的基因组DNA，以及对照病毒的基因组DNA。

4、LAMP反应体系建立

按照试剂盒说明书，按25μL体系配置：

2×反应缓冲液12.5μL

BstDNA聚合酶1μL

FIP40pmol

BIP40pmol

F35pmol

B35pmol

LF20pmol

LP20pmol

猪细环病毒2型DNA2μL

超纯水补足25μL。

LAMP反应在以实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63℃做为反应温度。

5、LAMP检测方法

1）特异性检测

使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪细环病毒2型、猪细环病毒1型、猪圆环病毒Ⅱ型、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和流行性腹泻病毒的基因组DNA，作为LAMP反应的模板，进行各LAMP扩增，同时以水作为空白对照，检验LAMP方法的特异性。

2）敏感性检测

提取的猪细环病毒2型基因组DNA，测定其浓度，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释成11个稀释度，以各DNA稀释度作为模板，进行本发明的LAMP方法扩增和常规PCR扩增，对比本发明的LAMP方法和普通PCR对检测猪细环病毒2型的敏感性。

3）荧光可视化检测

根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应60分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。

实施例1LAMP检测方法的特异性结果

对1株猪细环病毒2型、7株对照病毒和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，猪细环病毒2型反应管在18分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。

实施例2LAMP检测方法的敏感性结果

猪细环病毒2型原始DNA的起始浓度为1.40×10²ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的LAMP法检测限约为1.40×10^-8ng/μL，而常规PCR法检测限为1.40×10^-7ng/μL。

实施例3LAMP检测方法的荧光可视化检测结果

根据浊度仪监控优化的条件，反应器加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以猪细环病毒2型基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，建立的LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。

实施例4猪细环病毒2型定量标准曲线的绘制

以猪细环病毒2型DNA为模板，以本LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，测定重组质粒pMD18-T-ORF1的起始浓度，作为标准样品，用RNA-FreeWater进行连续10倍倍比稀释11个稀释度，取各稀释度2μL作为模板进行LAMP扩增。

设置对照：浓度为1.4×10²ng/μL、1.4×10¹ng/μL、1.4ng/μL、1.4×10^-1ng/μL、1.4×10^-2ng/μL、1.4×10^-3ng/μL、1.4×10^-4ng/μL、1.4×10^-5ng/μL、1.4×10^-6ng/μL、1.4×10^-7ng/μL和1.4×10^-8ng/μL的重组质粒pMD18-T-ORF1标准样品各一个，因为样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.3113x-7.2366，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R²=0.9951，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10^-y，再乘以基数1.4，即为1.4×10^-yng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL=（6.02×10²³×(ng/ul×10^-9)）/(DNAlength×660)，DNAlength为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+219=2912bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02×10²³×（1.4×10^-y×10^-9）/(2912×660)，简化之后为：4.38×10⁸×10^-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为35分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于3.689，则浓度为10^-3.689，再乘以基数1.4，即为该试验样品的浓度1.4×10^-3.689ng/μL，则其拷贝数为：4.38×10⁸×10^-3.689=4.38×10^4.3411copies/μL，从而达到定量的效果。

表1样品浓度负对数值与TTSuV2-LAMP浊度值时间线性关系表

时间（分）17.520232630323640浓度负对数-2-1012345

序列表

<110>广西壮族自治区兽医研究所

<120>一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒及其应用

<160>6

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

AAGTGCGCAGACGAATGG

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GGGTTTTTACAGCCGCAGAA

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ACTCCGCTCTCAGGAGCTCCTTTATGCCGCTGGTGGTAG

<210>4

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

GCGGTAATCCAGCGGAACCGTAATCCGTGCGCGCAGTA

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ACACTCAGCTCTGTTCGTGT

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

CCCCCCCTCCATGGAAGAA