限制性内切酶

摘要： 由于限制性内切酶在重组表达时具有切割宿主DNA的细胞毒性,生产难度大,其供应一直被国外企业垄断。实验室前期通过广谱甲基化保护,初步实现了部分限制性内切酶的国产化,但工艺仍停留在低密度摇瓶培养水平,产量无法满足市场需求。研究以限制性内切酶Pst Ⅰ为对象,通过单因素试验筛选了诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、补充碳源、pH值与诱导时机等多个发酵条件。结果表明,在37°C下,开始发酵后6 h,添加终浓度1.4 mmol/L IPTG进行诱导发酵8 h,以甘油为补充碳源,控制发酵体系pH为8.0时Pst Ⅰ的表达量最高,Pst Ⅰ蛋白产量为0.0129 g/L,为未优化的2.15倍,同时酶产率为1.926×10^(6)U/L,为未优化的3.74倍。

摘要： 物种的学名属名、种名(包括亚种、变种)用拉丁文斜体,首字母大写,其余小写;属以上用拉丁文正体,首字母大写。限制性内切酶前3个字母用斜体,后面的字母和编码正体平排,例如:Bam HⅠ、Eco RⅠ、MspⅠ、Sau 3AⅠ等。氨基酸和碱基的缩写氨基酸缩写用3个字母表示时,仅第一个字母大写,其余小写,正体。碱基缩写为大写正体。

摘要： 采用拮抗反应和基因间隔区2(intergenic spacer 2,IGS2)分析方法对河南省32个白灵侧耳(Pleurotus tuoliensis)菌株的遗传多样性进行分析。结果:除菌株Pt1、Pt5和Pt22外,绝大多数菌株间存在拮抗反应;应用Hpa Ⅱ、Rsa Ⅰ和Hae Ⅲ等3个限制性内切酶,对IGS2扩增产物进行酶切和电泳分析,不同菌株电泳后产生多样性丰富的图谱。根据聚类分析结果将所有菌株分为3个大类,3个大类遗传关系相对较远,最终将32个菌株鉴定为3组,可为今后白灵侧耳新品种杂交选育亲本的选择提供参考。

摘要： 噬菌体作为地球上数量最丰富的生物,能特异地拮抗宿主菌,在保护人类和动物免受耐药菌感染等方面具有潜在优势[1-2]。但体内外抗菌试验结果表明,噬菌体并不能完全杀灭宿主菌[3-4],说明细菌具有一定的防御噬菌体的能力。事实上,数十亿年来,细菌已进化出复杂的防御体系,其中的限制性内切酶、CRISPR/Cas系统等已应用于生物技术领域。近年来,揭示细菌防御噬菌体机制的进程加快,本文对此进行综述,希望为其在工农业生产中的应用提供参考。

摘要： 物种的学名属名、种名(包括亚种、变种)用拉丁文斜体,首字母大写,其余小写;属以上用拉丁文正体,首字母大写。限制性内切酶前3个用斜体,后面的字母和编码正体平排,例如:Bam H I、Eco R I、Msp I、Sau 3A I等。氨基酸和碱基的缩写氨基酸缩写用3个字母表示时,仅第一个字母大写,其余小写,正体。碱基缩写为大写正体。

摘要： 以江西九连山国家级自然保护区毛红椿天然林为研究材料,对毛红椿AFLP反应体系中的DNA提取方法、酶切与连接步骤、连接产物稀释倍数、预扩增产物稀释倍数等影响因子进行优化,并筛选AFLP多态性高的引物。结果表明:不同提取方法对DNA质量有很大影响,试剂盒法提取的DNA杂质少,质量高;酶切与连接采用一步法完成;连接产物最适稀释倍数为3倍,预扩增产物最适稀释为10倍;利用4个天然居群的毛红椿基因组DNA从64对引物组合中筛选出4对具有多态性扩增条带的引物,总扩增出147个位点,其中多态性位点122个,平均多态位点百分率84.36%,多态性较高,适用于毛红椿AFLP分析的4对引物组合分别是:E1/M6、E4/M7、E5/M3、E5/M8,为毛红椿遗传多样性和种质资源研究奠定了基础。

摘要： 一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

摘要： 来源于肺炎双球菌Diplococcus pneumoniae的Ⅱ型限制性内切酶DpnⅡ是分子生物学领域中常用的一种工具酶,它在基因工程等领域发挥着重要作用,目前其三维结构尚未被解析.为了解析DpnⅡ的蛋白结构,进一步阐明DpnⅡ的分子机制,构建了pET28b-DpnⅡ重组表达载体,并采用大肠杆菌表达系统,利用BL21 (DE3) pLysS菌株高效表达了DpnⅡ及其硒代衍生物,经Ni亲和层析、阴离子交换、凝胶过滤层析、肝素亲和层析等4步纯化获得了纯度在95％以上的重组蛋白和硒代蛋白,质量浓度均为10 mg/mL,产量分别为6.5 mg/L和5.5 mg/L.酶活研究发现,硒代蛋白和重组蛋白对底物pUC19质粒切割产生了大小一致的条带,表明硒代蛋白的活性未受到明显影响.

摘要： [背景]限制性内切酶Mlu I是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析.[目的]在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu I蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究.[方法]构建重组表达载体pET28b-Mlu I,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组MluI蛋白和硒代Mlu I蛋白.对蛋白进行质谱检测、圆二色谱检测以及酶活检测,利用坐滴法进行结晶条件的筛选.[结果]构建了重组表达载体pET28b-Mlu I并纯化获得达到结晶纯度的蛋白,通过质谱检测确定硒代Mlu I蛋白中的8个甲硫氨酸全部被取代,结合酶活测试及圆二色谱检测确定了硒代对Mlu I蛋白的活性、结构无明显影响.采用坐滴法进行初步的晶体生长研究,重组蛋白目前已在1种条件下获得针状晶体并进行初步衍射,获得分辨率在0.32 nm左右的衍射数据.[结论]Mlu I蛋白及硒代Mlu I蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究,可为下一步解析Mlu I三维结构、作用机制的探讨及定向改造奠定基础.

摘要： 载体与外源片段具有概念抽象、不易表现的特点,成为基因工程教学中的重点和难点.为帮助学生更好地理解载体与外源片段酶切和连接这一知识点,可利用A4纸、剪刀、曲别针等材料制作载体与外源片段酶切和连接反应教具.从教学效果上看,该教具可直观展示限制性内切酶识别序列的结构特点,配合完成限制性内切酶的酶切反应及DNA连接酶的连接反应,有助于学生在动手过程中掌握相关学习要点.

摘要： 在本工作中，我们构建了用于限制性内切酶传感的比色探针。探针由两种 DNA 修饰的金纳米组成，限制性内切酶识别并水解位于其中一个纳米粒子上的 特定双链DNA，使残留单链DNA 片段，该DNA 片段可与位于另一纳米金表面的单链DNA 杂交，从而导致纳米金的聚集。由于纳米粒子尺寸的变化导致吸收 光谱的红移从而产生明显的颜色变化，可通过肉眼观察即可对限制性内切酶进行 半定量测定。通过对紫外-可见吸收光谱的考察可获得定量的信息。

摘要： 通过PCR扩增赣南地区不同县区柑橘黄龙病病原菌的核糖体蛋白基因,采用两种不同限制性内切酶对PCR产物进行限制性长度多态性(RFLP)分析.结果表明:各分离物核糖体蛋白基因RFLP指纹图谱结果相一致,未表现出多态性.

摘要： 研究了稀土硝酸镧对限制性内切酶HindⅢ活性的影响.结果表明,在不同离子浓度下,抑制作用不同,随着浓度的增大,抑制作用增强.

摘要： 水霉菌是淡水养殖中危害极大的病原菌,水霉属种分类众多,但据报道对养殖鱼类危害较大的常见种类不多,主要有S.ferax、S.monoica、S.diclina、S.parasitica等。本文作者在全国各地从鱼体和鱼卵病灶处分离得到十株水霉菌,通过人工感染试验证实水霉菌对草鱼均具致病性。进一步通过ITS序列分析、系统发育关系分析和形态分类方法对水霉菌进行了分类鉴定,之后利用4种限制性内切酶BstUⅠ、HhaⅠ、HinfⅠ、HindⅢ对十株水霉菌进行限制性内切酶谱(RFLP)分析。结果表明,鱼体和鱼卵分离到菌丝均呈透明管状有分支,可在15-22°C形成游动孢子囊,藏卵器呈球形。ITS序列比对分析显示，该菌与Sxprolegniaparasitica和Saprolegnia ferax序列相似性为99%。以最大简约法构建的系统发育树分析显示十株水霉均与S.ferax自然聚类，4种限制性内切酶酶切ITS-PCR产物后共产生8个酶切片段，10株菌种的PCR-RFLP谱型一致。综合形态学、ITS区序列及系统发育分析以及RFLP分析，表明中国致病性水霉菌种主要是多子水霉(S.ferax)。

摘要： 本实验模拟限制性内切酶EcoR Ⅰ切割人的基因组，提出了测序一次，效率最高，最省钱的方案。通过本实验可以估计人的基因组用EcoR Ⅰ切割后，各个长度片段的数目，从而就能有目的性的进行测序，另外用不同的限制性内切酶切割同一物种不同个体基因组，我们可以根据片段两端的酶切位点序列的不同来区分不同个体，而不是对每个个体都进行一次测序，这样我们测序一次就能获得相应的snp信息。

摘要： 根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin(MSTN)基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊MSTN基因的5'同源臂和3'同源臂,其长度分别为5.2kb、1.1kb.在ploxPneo载体的neo基因上游和下游分别插入上述两个同源臂,经PCR、限制性内切酶鉴定及DNA序列测定,成功构建了山羊MSTN基因打靶载体.

摘要： 伴脊髓、脑干受累，脑白质乳酸升高的脑白质病是一种罕见的常染色体隐性遗传白质脑病.本研究拟通过DARS2基因突变及遗传特征分析，了解一例临床诊断伴脊髓、脑干受累，脑白质乳酸升高的脑白质病（LBSL）患儿的临床表型以及DARS2基因型特征。收集并分析先证者的临床资料，应用PCR方法对DARS2基因的所有17个外显子及其内含子连接区域进行扩增，采用DNA直接测序与DNA限制性内切酶酶切、100条正常染色体对照验证的方法进行DAR52基因突变检测，确定基因突变的位点，分析基因型一与表型的关系。

摘要： 本研究对16个鲍鱼菇菌株进行ITS PCR,其长度没有多态性。用Sau3AI、AluI和Hae Ⅲ三种限制性内切酶来测定16个鲍鱼菇菌株的ITS-RFLP,可以把它们分为3类,第1类是PL a 0004,第2类是PLa 0017,其余菌株归入第3类。对上述3类的6个菌株进行ITS测序,结果表明,PL a 0004和PL a 0017不是鲍鱼菇,分别是平菇Pleurotus ostreatus和金顶侧耳Pleurotuscitrinopileatus。

摘要： Morganella morganii J-8能够转化前体物质生成d-伪麻黄碱,但其本身具有致病性且转化效率较低,应用受到很大限制.本研究利用限制性内切酶HindⅢ将基因组DNA部分酶切,与用同种限制性内切酶酶切的cosmid质粒pHC79为载体连接重组,电转化构建基因小库,同时通过体外包装,感染Escherichia coli S17构建大片段基因组文库.为Morganella morganii J-8未知羰基还原酶的克隆及其它研究打下基础.

摘要： 本研究的目标是借助三引物搭桥PCR和分子内同源重组，建立酶切-连接非依赖型(restriction-andligase-independent)的无缝基因克隆技术。

摘要： 本发明公开一种基于限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶Ⅲ的DNA甲基化及甲基化转移酶活性的检测方法。制备了无标记的DNA探针，该探针序列包含了限制性内切酶的切割位点和甲基化的CpG位点,通过该无标记的DNA探针与目标DNA杂交，用甲基化转移酶进行甲基化处理，再用限制性内切酶HpaⅡ的特异性切割以及作用于双链DNA的3ˊ→5ˊ外切酶活性的核酸外切酶Ⅲ作用，然后利用荧光信号分子噻唑橙对单双链DNA不同信号实现检测甲基化及甲基转移酶活性的目的。本发明无需制备复杂材料和标记DNA探针，可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。

摘要： 本发明是一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：所述的甲基化酶是M.Sss I；所述限制性内切酶D选自：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。本发明方法重组工程菌的构建过程中直接使用广谱保护型甲基化酶M.Sss I，无需针对单个限制性内切酶进行繁琐的甲基化酶基因筛选，应用范围广泛，大大简化了重组表达过程。

摘要： 本发明提供了一种可识别切割AGCT位点的耐高温限制性内切酶DFh2，该酶的氨基酸序列如SEQ NO：2所示，其编码基因序列如SEQ NO：1所示；DFh2酶可识别5’…AGCT…3’核酸片段中的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端。酶DFh2具有良好的酶活，1.5μg限制酶DFh2在1×CutSmart Buffer缓冲体系和75°C或72°C温度下，在1h内可以将1nmol的含AGCT回文结构区的双链DNA片段在G和C之间完全酶切形成平末端。此外，限制酶DFh2具有良好的热稳定性，在95°C热育30min，酶活力仍保留90%以上；置于室温下30min，酶活力仍保留99%以上。本发明提供的特定全新II型限制酶DFh2，可以作为基因工程和基因检测的工具酶，并在低丰度特定基因片段的富集和检测中具有独特的应用。

摘要： 本发明公开了一种外源基因DNA片段克隆到质粒载体相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点的方法。质粒载体用限制性内切酶AB、AC分别酶切，得到AB、BA及AC、CA四个DNA片段。(B、C为质粒载体上相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点)。外源基因DNA片段用限制性内切酶B、C酶切，得到BC片段。AB、BC、CA与AC、BC、BA这三个DNA片段分别进行连接、转化，涂布在筛选平板上培养，再挑取单菌落进行筛选，可以得到外源基因连入质粒载体正反两个方向的重组质粒。本发明的优点是：使用本发明构建的质粒载体，无法进行双酶切的相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点也可作为克隆外源基因DNA片段的选择；另外，外源基因DNA片段连入载体的两个方向也可实现。

摘要： 本发明公开一种基于限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶Ⅲ的DNA甲基化及甲基化转移酶活性的检测方法。制备了无标记的DNA探针，该探针序列包含了限制性内切酶的切割位点和甲基化的CpG位点,通过该无标记的DNA探针与目标DNA杂交，用甲基化转移酶进行甲基化处理，再用限制性内切酶HpaⅡ的特异性切割以及作用于双链DNA的3'→5'外切酶活性的核酸外切酶Ⅲ作用，然后利用荧光信号分子噻唑橙对单双链DNA不同信号实现检测甲基化及甲基转移酶活性的目的。本发明无需制备复杂材料和标记DNA探针，可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。

摘要： 本发明是一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：所述的甲基化酶是M.CviPI；所述的限制性内切酶C选自：AatI，AscI，BanII，BglI，BmtI，BspQI，BsrDI，BssHII，BtsI，EagI，HindIII，KasI，MluI，NheI，NotI，NruI，NsiI，PstI，PvuII，SacI，SapI，SbfI，SfiI，SphI。本发明方法重组工程菌的构建过程中直接使用广谱保护型甲基化酶M.CviPI，无需针对单个限制性内切酶进行繁琐的甲基化酶基因筛选，应用范围广泛，大大简化了重组表达过程。

摘要： 本发明是一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：所述的甲基化酶是M.Sss I；所述限制性内切酶D选自：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。本发明方法重组工程菌的构建过程中直接使用广谱保护型甲基化酶M.Sss I，无需针对单个限制性内切酶进行繁琐的甲基化酶基因筛选，应用范围广泛，大大简化了重组表达过程。

摘要： 本发明公开了一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，通过重组方式将NT.BstNBI切刻酶以及GST标签克隆到含His标签的pACYCDuet‑1表达载体中，其甲基化酶克隆到含阿拉伯糖诱导元件的pBAD‑HisA中利用阿拉伯糖先进行甲基化酶表达保护菌体自身DNA，在低温条件下表达量达到35％。通过组合型标签蛋白表达、Ni柱亲和层析、Superdex 200凝胶过滤层析得到高活力的重组NT.BstNBI切刻酶，用Superdex 200分子筛层析对蛋白进行提纯，经纯化工艺摸索及条件优化，整个纯化过程仅需6h，加上酶切时间也不过20小时,极大简化了纯化过程及时间。

摘要： 本发明提供了一种可识别切割AGCT位点的耐高温限制性内切酶DFh2，该酶的氨基酸序列如SEQ NO：2所示，其编码基因序列如SEQ NO：1所示；DFh2酶可识别5’...AGCT...3’核酸片段中的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端。酶DFh2具有良好的酶活，1.5μg限制酶DFh2在1×CutSmart Buffer缓冲体系和75°C或72°C温度下，在1h内可以将1nmol的含AGCT回文结构区的双链DNA片段在G和C之间完全酶切形成平末端。此外，限制酶DFh2具有良好的热稳定性，在95°C热育30min，酶活力仍保留90%以上；置于室温下30min，酶活力仍保留99%以上。本发明提供的特定全新II型限制酶DFh2，可以作为基因工程和基因检测的工具酶，并在低丰度特定基因片段的富集和检测中具有独特的应用。

摘要： 本发明公开了一种外源基因DNA片段克隆到质粒载体相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点的方法。质粒载体用限制性内切酶AB、AC分别酶切，得到AB、BA及AC、CA四个DNA片段。(B、C为质粒载体上相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点)。外源基因DNA片段用限制性内切酶B、C酶切，得到BC片段。AB、BC、CA与AC、BC、BA这三个DNA片段分别进行连接、转化，涂布在筛选平板上培养，再挑取单菌落进行筛选，可以得到外源基因连入质粒载体正反两个方向的重组质粒。本发明的优点是：使用本发明构建的质粒载体，无法进行双酶切的相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点也可作为克隆外源基因DNA片段的选择；另外，外源基因DNA片段连入载体的两个方向也可实现。