DNA聚合酶

摘要： 目的将Taq DNA聚合酶(Taq酶)不同的突变体与其野生型进行对比,分析二者扩增性能及聚合性能的差异,探讨突变型Taq酶在乙型、丙型肝炎病毒患者临床检测中的性能优势。方法提取DNA构建突变库,逐步筛选出热稳定性提高且扩增效率较高的突变体;选取威海市立医院2020年1月至2021年8月收治的乙型肝炎病毒表面抗原阳性样本30例、丙型肝炎HCV RNA阳性样本30例,通过PCR-荧光探针法应用Taq酶突变体与野生型进行性能检测。结果在同等PCR循环次数下,Taq酶突变体CT值均低于野生型,即突变体的扩增效率高于野生型;对临床样本进行3次重复检测,突变体标准曲线的相关系数为0.99;将Taq酶突变体进行重复检测,批内及批间的检测浓度对数值的变异系数(CV%)均小于5%。结论不同DNA聚合酶的突变体与野生型相比具有较高的扩增活性及扩增效率,灵敏度及特异性的优势也较为显著。这一特性为进一步研究开发扩增效率更高的DNA聚合酶,推动现代分子生物检测技术、辅助乙肝及丙肝病毒临床检测的发展打下基础。

摘要： Kod DNA聚合酶作为常见的高保真DNA聚合酶,具有较强的DNA延伸能力以及3'-5'外切核酸酶校正活性。本研究通过对重组Kod DNA聚合酶分离纯化条件的优化,以期提高其表达和纯化效率以及片段扩增能力。利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)对pET-30a-Kod进行诱导表达后,利用酶溶法和超声波破碎法对细胞破碎并提取粗酶液,然后利用Ni-NTA柱洗脱纯化获得较纯Kod DNA酶,再经透析得到高纯度Kod DNA酶,利用PCR反应和Sanger测序手段来检测自提纯化的Kod DNA聚合酶活性及保真性。同时,本研究对IPTG浓度和洗脱液中咪唑浓度等重要参数进行优化。结果表明,在28°C条件下0.1 mmol/L IPTG诱导16-18 h后,Kod DNA聚合酶高效表达;当咪唑浓度为200 mmol/L时蛋白洗脱效果最佳。PCR反应体系中Mg^(2+)浓度为1.5 mmol/L,Kod DNA聚合酶浓度为0.06125μg/μL时,Kod DNA聚合酶效率较高,能有效地扩增3194 bp的目的条带;通过序列比对,PCR产物序列中未引入任何突变。经优化制备后的Kod DNA聚合酶在酶活性和扩增保真性上均能达到商用高保真DNA聚合酶水平。本研究为节省实验室PCR成本,进一步开发和利用Kod DNA聚合酶奠定一定的基础。

摘要： 本发明公开了一种用于水体中汞离子浓度检测的比色传感器,反应组分包括:自延伸DNA模板、Bst3.0 DNA聚合酶、dNTPs底物及纳米金胶体。本发明利用特定的错配碱基对实现汞离子的高特异性识别,以启动后续的DNA自延伸反应。同时,利用结构极其简单的自延伸DNA模板实现快速的信号放大。由于dNTPs底物与双链的扩增产物在稳定纳米金胶体上存在显著差异,纳米金胶体颜色的显著差异可以直观地指示样品中的汞离子浓度,方便了检测结果的观察。该发明具有检测灵敏度高、检测特异性和抗干扰能力强以及结果可直接观测的优点,是检测水体中重金属汞污染的有效方法。

摘要： 一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

摘要： 实验室进化是遗传育种、提高微生物性能的重要方式.近几十年来,实验室进化的方法快速发展,应用也越来越广泛,但是常见的菌株进化策略以及针对特定蛋白的进化存在突变过程不连续,需要多轮操作、工作量大等缺点.微生物突变和筛选技术的进步促进了体内连续进化的发展,大大提高了实验室进化的效率.体内连续进化技术实现了体内突变,完美地把突变与筛选相结合,以最少的人工干预进化出特定表型.文中总结了近年来在微生物底盘中开发的基因组范围的体内连续进化技术,以及独立于基因组的针对特定蛋白的体内连续进化技术,主要对这些技术实现体内连续突变的原理及其相关应用进行了介绍.在此基础上,分析了现有技术的优缺点,并对体内连续进化技术的发展进行了展望.

摘要： 利用G-四链体与荧光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(N MM)结合发出的强荧光做检测信号,提出了一种DNA聚合酶荧光检测新方法.包含富G序列的DNA发夹引物(HP)在DNA聚合酶作用下发生聚合延伸生成双链DNA,无法形成G-四链体.无DNA聚合酶时,HP上自由的富G序列形成G-四链体,然后特异性的结合NMM产生强荧光信号,信号强度与DNA聚合酶的浓度成反比.该方法具有简单、低成本和高信噪比等优点,在DNA聚合酶活性的实时检测和抑制剂筛选中具有一定的应用潜力.

摘要： 催化特异性反应的工具酶在基因工程中发挥着重要的作用,根据其催化反应特性可分为限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和末端修饰酶4种类型.对这四种工具酶的发现和作用机制进行概述,并展望工具酶的应用前景.

摘要： 单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)UL42作为病毒编码的DNA聚合酶辅助亚基之一,是一种多功能蛋白,其在催化和调节病毒在细胞核内的有效复制发挥了重要的作用。已知UL42能提高DNA聚合酶催化亚基UL30的持续合成能力,激活病毒DNA聚合酶活性;介导DNA聚合酶的入核;与DNA模板链结合,提高病毒复制的保真度,以及含有抑制DNA聚合酶活性的肽段,提示其在病毒复制过程中也可能具有负调控作用。近期亦有报道显示,UL42能够阻断肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)激活的核转录因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路以及干扰素调控因子3(interferon regulatory factor 3,IRF-3)的功能,提示其在病毒逃逸宿主天然免疫反应中发挥了一定的功能,但具体的作用机制尚不明确。本文对目前国内外HSV-1 UL42的结构特点、主要功能、作用机制及其在抗病毒药物研发中的研究进展进行综述,为后续揭示病毒致病机制和抗病毒药物的研发提供参考。

摘要： 近年来,食品安全问题层出不穷,这些问题不仅影响了食品生产企业的品质,而且对于人们身体健康和生活质量具有较大影响。因此越来越大的人们开始关注食品安全管理。微生物检测是食品安全管理的重要内容,就目前来说,在食品微生物检测中,PCR技术的应用较为广泛,这种技术具有较高的检测效率,而且检测结果的准确性较高,其能有效满足食品微生物检测需要。1、什么是PCR技术所谓PCR技术技术就是将单链DNA作为模板,然后通过DNA聚合酶发生作用,从而产生特异性扩增。从本质上讲,PCR技术是一种DNA片段技术,其包含了变性、退火、延伸三个基本环节。采用PCR技术进行食品微生物检测时,首先对双链DNA进行变性处理,使得其变为但链DNA,然后DNA聚合酶这一引物,使得单链DNA向3’末端合成延伸,最终形成一个全新的双链合成DNA。重复上述操作,在经历35个循环拷贝后,这些多重的PCR可以扩增为某个物质的单个片或对个片段,最终实现物质具体成分检测。

摘要： 1例24岁男性患者因病毒性脑膜脑炎给予阿昔洛韦(0.5g静脉滴注、3次/d)、醒脑静注射液(20ml静脉滴注、1次/d),甘露醇注射液(250ml快速静脉滴注、3次/d)、磷酸肌酸钠(1g静脉滴注、1次/d)、胰岛素注射液(6U+5％葡萄糖注射液500ml+氯化钾注射液10ml静脉滴注、1次/d)、血栓通注射液(500mg静脉滴注、1次/d)、甲钴胺注射液(2ml静脉滴注、1次/d)、枸橼酸铋雷尼替丁胶囊(0.2g口服、2次/d)和丁苯酞软胶囊(0.2g口服、3次/d)等治疗.第7天,患者出现视朦,视远物不清,瞳孔扩大,直径约5.0mm,结膜充血.停用阿昔洛韦,其他药物继续使用.5d后,患者结膜充血有所改善,瞳孔稍有缩小,视力有所好转.随访2个月,患者未再出现视物模糊,考虑视物模糊为阿昔洛韦引起.A静脉滴注阿昔洛韦导致视物模糊的机制目前尚不清楚。有研究认为，注射用阿昔洛韦引起意识障碍可能与其代谢物（9-羟基甲氧甲基鸟嘌呤）在脑脊液中的浓度增加有关。另外，阿昔洛韦主要经肾排泄，肾功能不全时，脑脊液中药物含量达到血浆浓度的50%，可导致药物对脑细胞DNA聚合酶产生抑制作用，易引起中枢神经系统不良反应。本例患者肾功能正常，可排除由肾功能不全引起药物在体内蓄积而导致的精神神经系统障碍。推测本例出现视物模糊的原因可能与阿昔洛韦抑制细胞DNA聚合酶的作用，干扰视神经的正常活动有关。

摘要： 1例24岁男性患者因病毒性脑膜脑炎给予阿昔洛韦(0.5g静脉滴注、3次/d)、醒脑静注射液(20ml静脉滴注、1次/d),甘露醇注射液(250ml快速静脉滴注、3次/d)、磷酸肌酸钠(1g静脉滴注、1次/d)、胰岛素注射液(6U+5％葡萄糖注射液500ml+氯化钾注射液10ml静脉滴注、1次/d)、血栓通注射液(500mg静脉滴注、1次/d)、甲钴胺注射液(2ml静脉滴注、1次/d)、枸橼酸铋雷尼替丁胶囊(0.2g口服、2次/d)和丁苯酞软胶囊(0.2g口服、3次/d)等治疗.第7天,患者出现视朦,视远物不清,瞳孔扩大,直径约5.0mm,结膜充血.停用阿昔洛韦,其他药物继续使用.5d后,患者结膜充血有所改善,瞳孔稍有缩小,视力有所好转.随访2个月,患者未再出现视物模糊,考虑视物模糊为阿昔洛韦引起.A静脉滴注阿昔洛韦导致视物模糊的机制目前尚不清楚。有研究认为，注射用阿昔洛韦引起意识障碍可能与其代谢物（9-羟基甲氧甲基鸟嘌呤）在脑脊液中的浓度增加有关。另外，阿昔洛韦主要经肾排泄，肾功能不全时，脑脊液中药物含量达到血浆浓度的50%，可导致药物对脑细胞DNA聚合酶产生抑制作用，易引起中枢神经系统不良反应。本例患者肾功能正常，可排除由肾功能不全引起药物在体内蓄积而导致的精神神经系统障碍。推测本例出现视物模糊的原因可能与阿昔洛韦抑制细胞DNA聚合酶的作用，干扰视神经的正常活动有关。

摘要： 1例24岁男性患者因病毒性脑膜脑炎给予阿昔洛韦(0.5g静脉滴注、3次/d)、醒脑静注射液(20ml静脉滴注、1次/d),甘露醇注射液(250ml快速静脉滴注、3次/d)、磷酸肌酸钠(1g静脉滴注、1次/d)、胰岛素注射液(6U+5％葡萄糖注射液500ml+氯化钾注射液10ml静脉滴注、1次/d)、血栓通注射液(500mg静脉滴注、1次/d)、甲钴胺注射液(2ml静脉滴注、1次/d)、枸橼酸铋雷尼替丁胶囊(0.2g口服、2次/d)和丁苯酞软胶囊(0.2g口服、3次/d)等治疗.第7天,患者出现视朦,视远物不清,瞳孔扩大,直径约5.0mm,结膜充血.停用阿昔洛韦,其他药物继续使用.5d后,患者结膜充血有所改善,瞳孔稍有缩小,视力有所好转.随访2个月,患者未再出现视物模糊,考虑视物模糊为阿昔洛韦引起.A静脉滴注阿昔洛韦导致视物模糊的机制目前尚不清楚。有研究认为，注射用阿昔洛韦引起意识障碍可能与其代谢物（9-羟基甲氧甲基鸟嘌呤）在脑脊液中的浓度增加有关。另外，阿昔洛韦主要经肾排泄，肾功能不全时，脑脊液中药物含量达到血浆浓度的50%，可导致药物对脑细胞DNA聚合酶产生抑制作用，易引起中枢神经系统不良反应。本例患者肾功能正常，可排除由肾功能不全引起药物在体内蓄积而导致的精神神经系统障碍。推测本例出现视物模糊的原因可能与阿昔洛韦抑制细胞DNA聚合酶的作用，干扰视神经的正常活动有关。

摘要： 1例24岁男性患者因病毒性脑膜脑炎给予阿昔洛韦(0.5g静脉滴注、3次/d)、醒脑静注射液(20ml静脉滴注、1次/d),甘露醇注射液(250ml快速静脉滴注、3次/d)、磷酸肌酸钠(1g静脉滴注、1次/d)、胰岛素注射液(6U+5％葡萄糖注射液500ml+氯化钾注射液10ml静脉滴注、1次/d)、血栓通注射液(500mg静脉滴注、1次/d)、甲钴胺注射液(2ml静脉滴注、1次/d)、枸橼酸铋雷尼替丁胶囊(0.2g口服、2次/d)和丁苯酞软胶囊(0.2g口服、3次/d)等治疗.第7天,患者出现视朦,视远物不清,瞳孔扩大,直径约5.0mm,结膜充血.停用阿昔洛韦,其他药物继续使用.5d后,患者结膜充血有所改善,瞳孔稍有缩小,视力有所好转.随访2个月,患者未再出现视物模糊,考虑视物模糊为阿昔洛韦引起.A静脉滴注阿昔洛韦导致视物模糊的机制目前尚不清楚。有研究认为，注射用阿昔洛韦引起意识障碍可能与其代谢物（9-羟基甲氧甲基鸟嘌呤）在脑脊液中的浓度增加有关。另外，阿昔洛韦主要经肾排泄，肾功能不全时，脑脊液中药物含量达到血浆浓度的50%，可导致药物对脑细胞DNA聚合酶产生抑制作用，易引起中枢神经系统不良反应。本例患者肾功能正常，可排除由肾功能不全引起药物在体内蓄积而导致的精神神经系统障碍。推测本例出现视物模糊的原因可能与阿昔洛韦抑制细胞DNA聚合酶的作用，干扰视神经的正常活动有关。

摘要： 本研究中进一步探讨Pol(l)对食管癌细胞侵袭性的影响及其可能机制.结果表明跨损伤DNA合成聚合酶Pol(l)在人食管癌组织的过表达可增加食管癌组织增殖侵袭能力;CyclinD1上调可能是Pol(l)促进食管癌侵袭转移的机制之一。

摘要： 本研究中进一步探讨Pol(l)对食管癌细胞侵袭性的影响及其可能机制.结果表明跨损伤DNA合成聚合酶Pol(l)在人食管癌组织的过表达可增加食管癌组织增殖侵袭能力;CyclinD1上调可能是Pol(l)促进食管癌侵袭转移的机制之一。

摘要： 本研究中进一步探讨Pol(l)对食管癌细胞侵袭性的影响及其可能机制.结果表明跨损伤DNA合成聚合酶Pol(l)在人食管癌组织的过表达可增加食管癌组织增殖侵袭能力;CyclinD1上调可能是Pol(l)促进食管癌侵袭转移的机制之一。

摘要： 本研究中进一步探讨Pol(l)对食管癌细胞侵袭性的影响及其可能机制.结果表明跨损伤DNA合成聚合酶Pol(l)在人食管癌组织的过表达可增加食管癌组织增殖侵袭能力;CyclinD1上调可能是Pol(l)促进食管癌侵袭转移的机制之一。

摘要： Pfu DNA聚合酶从生活于海底火山口附近的超嗜热古生菌Pyrococcus furiosus 中分离得到.最初的聚合酶直接从菌体中直接分离,但由于古细菌需要厌氧培养,生长温度在100°C左右很难培养从而难以获得大量的酶.Pfu DNA聚合酶具有3′-5′外切酶活性,出错的机率仅为Taq DNA聚合酶的1/10,是保真性最好的DNA聚合酶之一,被广泛应用于分子生物学的各种研究中。IPTG是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂，但其价格较为昂贵，为了减少IPTG用量，采用多次少量的添加策略进行诱导表达。

摘要： Pfu DNA聚合酶从生活于海底火山口附近的超嗜热古生菌Pyrococcus furiosus 中分离得到.最初的聚合酶直接从菌体中直接分离,但由于古细菌需要厌氧培养,生长温度在100°C左右很难培养从而难以获得大量的酶.Pfu DNA聚合酶具有3′-5′外切酶活性,出错的机率仅为Taq DNA聚合酶的1/10,是保真性最好的DNA聚合酶之一,被广泛应用于分子生物学的各种研究中。IPTG是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂，但其价格较为昂贵，为了减少IPTG用量，采用多次少量的添加策略进行诱导表达。

摘要： 本发明提供了一种融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌，涉及生物技术领域。本发明提供的融合Bsu DNA聚合酶，含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段，能够在大肠杆菌中高效表达，表达纯度可达到95％以上。本发明提供的Bsu DNA聚合酶突变体，将融合Bsu DNA聚合酶中Bsu DNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala，缺失了3′→5′核酸外切酶活性，能够在大肠杆菌中高效表达，表达纯度可达到97％以上，能够和其他相关蛋白相互作用实现恒温扩增。

摘要： 本发明提供人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的体外活性试验，其包括利用已掺入了SP6病毒启动子的寡核苷酸作为5’寡核苷酸从样品中经PCR扩增HBV DNA聚合酶，在有放射性标记试剂存在的情况下直接转录和翻译所述PCR产物，并测定HBV DNA聚合酶的引发。本发明还提供这样一种试验在各种血清样品的活性测试中的应用，在HBV DNA聚合酶抑制剂的筛选中的应用，以及在检测和/或筛选潜在的抗HBV药物对人类HBV DNA聚合酶的DNA引发活性的抑制能力方面的应用。

摘要： 本发明涉及一种热启动DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：获得单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶；将所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述TaqDNA聚合酶组分按照比例混合；所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶的含量分别都为20～40%，本发明还涉及由以上方法制备的热启动DNA聚合酶及其使用方法。本发明制备的热启动DNA聚合酶还可以解决热启动PCR技术中容易出现的DNA损伤、产物污染、封闭不完全导致热启动效果不好的问题。

摘要： 本发明提供了一种融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌，涉及生物技术领域。本发明提供的融合Bsu DNA聚合酶，含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段，能够在大肠杆菌中高效表达，表达纯度可达到95％以上。本发明提供的Bsu DNA聚合酶突变体，将融合Bsu DNA聚合酶中Bsu DNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala，缺失了3′→5′核酸外切酶活性，能够在大肠杆菌中高效表达，表达纯度可达到97％以上，能够和其他相关蛋白相互作用实现恒温扩增。

摘要： 本发明公开了一种修饰的DNA聚合酶、用于调控DNA聚合酶活性的核酸适配体和热启动DNA聚合酶，修饰的DNA聚合酶包括DNA聚合酶片段和修饰在DNA聚合酶片段N端的G‑四链体结合肽；核酸适配体的序列的二级结构包含一个G‑四链体；热启动DNA聚合酶包括修饰的DNA聚合酶和核酸适配体，核酸适配体用于在第一预设温度时结合于DNA聚合酶的G‑四链体结合肽，以抑制DNA聚合酶的活性，并用于在第二预设温度时脱离于DNA聚合酶的G‑四链体结合肽，以恢复DNA聚合酶的活性；其中，第二预设温度高于第一预设温度。将本发明构建的热启动DNA聚合酶应用于等温扩增时，不会产生非特异性扩增，这在分子诊断中具有很大的应用价值。

摘要： 本发明涉及具有DNA聚合酶和3'‑5'外切核酸酶活性的酶。具体而言，本发明涉及具有海洋来源的DNA聚合酶II活性和3'‑5'外切核酸酶活性的热不稳定酶。此外，本发明涉及主要发挥3'‑5'活性，即不存在聚合酶活性的DNA聚合酶。本发明还涉及外切核酸酶活性用于降解双链DNA的3'‑5'链从而例如在重组克隆过程中或在去除污染核酸分子的过程中进行单链悬突的用途。

摘要： 本发明的主题是融合单链DNA聚合酶Bst及其制备方法，该融合单链DNA聚合酶Bst在该聚合酶的N端使用由氨基酸序列Gly‑Ser‑Gly‑Gly‑Val‑Asp的六个氨基酸组成的接头与NeqSSB蛋白连接，其中给定的聚合酶以三种不同的变体存在。此外，本发明的主题是编码融合DNA聚合酶NeqSSB‑Bst全长、大片段、短片段的核酸分及它们的用途。

摘要： 本发明提供人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的体外活性试验,其包括利用已掺入了SP6病毒启动子的寡核苷酸作为5’寡核苷酸从样品中经PCR扩增HBV DNA聚合酶,在有放射性标记试剂存在的情况下直接转录和翻译所述PCR产物,并测定HBV DNA聚合酶的引发。本发明还提供这样一种试验在各种血清样品的活性测试中的应用,在HBVDNA聚合酶抑制剂的筛选中的应用,以及在检测和/或筛选潜在的抗HBV药物对人类HBV DNA聚合酶的DNA引发活性的抑制能力方面的应用。

摘要： 本发明公开了Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用。本发明首先公开了Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，该组合包括单克隆抗体4A8和单克隆抗体5H6。本发明进一步公开了上述抗体组合在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用及包含上述组合的反应体系及试剂盒。本发明上述抗体组合及优化的反应液在低温度条件下能够充分封闭Taq DNA聚合酶的活性区域，有效降低非特异性扩增并保证酶的热稳定性，在扩增的循环数更高的条件下仍可有效维持酶活性的持久性。

摘要： 本发明涉及在PCR产物的末端上互补结合探针的情况下，利用抑制DNA聚合酶的5'‑瓣状内切核酸酶(FEN)活性的特性来检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。更具体地涉及将实时聚合酶链反应(real‑time PCR)中使用的探针与PCR产物末端进行互补结合的情况下，确认抑制针对探针的耐热性DNA聚合酶的5'‑瓣状内切核酸酶活性的特性，并利用其特性来使待检测的单核苷酸多态性(SNP)部位位于探针的5'‑末端部位时，根据等位基因(allele)来诱导5'‑瓣状的形成，从而可有效地检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。