酶切

摘要： 在功能基因组学时代,对基因的功能研究将涉及到大量的载体构建,为建立一种链霉菌外源基因多拷贝表达的载体构建方法,本研究采用重叠延伸PCR与双酶切结合的连接方法,构建链霉菌表达载体,以红霉素工业生产菌红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)基因组DNA为模板,扩增红霉素合成相关的甲基化酶基因(erythromycin O-methyltransferase,eryG)和羟基化酶基因(erythromycin C-12 hydroxylase,eryK),以及启动子permE基因,采用重叠延伸PCR及EcoRⅤ、NotⅠ和XbaⅠ酶切位点相结合的连接方法构建含有多个基因片段的链霉菌重组表达载体.成功构建了携带外源基因的表达载体pSET001、pSET002和pSET003,最终获得含有多个基因的重组质粒.双酶切载体构建时载体或DNA片段上可用的限制性酶切位点受到限制,通过结合重叠延伸PCR技术,可以利用较少的内切酶快速构建含有多个基因片段的重组载体,为红霉素生产菌的改造提供了重组载体.

摘要： 比较和优化血液样本蛋白质组学样品制备和质谱分析技术,为深度研究和挖掘血液样本蛋白质组学信息创造条件.采用Q-Exactive Plus质谱仪,对比分析血浆、血清和去除高丰度蛋白血清预处理方法制备的大鼠血样蛋白质组构成;比较血清样本的常规酶切、45°C孵育、热辅助酶切、二次热辅助酶切、尿素辅助酶切和变温酶切的效率;比较数据依赖性采集(data-dependent acquisition,DDA)、数据非依赖性采集(data independent acquisition,DIA)和平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)质谱数据采集的定性定量特征;采用优化的方法进行大鼠血液样本蛋白质组分析.血清样本去除高丰度蛋白后蛋白鉴定数更高、定量重复性更好;热辅助酶切和变温酶切血清样品的蛋白和肽段鉴定数以及质谱谱图匹配率相对较高,蛋白酶切效率和定性定量重复性较好;DDA操作简便,DIA重复性高,PRM定量精确;血清样本去除高丰度蛋白,采用热辅助结合变温酶切和DDA数据采集模式,3次重复试验分别鉴定到490、490、504个蛋白,鉴定总蛋白数590个,共有蛋白占比69.8％.优化的方法操作简单,蛋白鉴定率较高,重复性好,适用于血液样本的蛋白质组学分析.

摘要： 本实验旨在获得带有增强型绿色荧光蛋白及表达猪ACRBP基因的pIRES2-EGFP-ACRBP真核表达载体和CHO细胞株,并且检测猪睾丸、附睾、前列腺、尿道球腺、精子、精清、性成熟母猪卵巢和输卵管中ACRBP蛋白的表达情况.本实验通过基因克隆的方法获得猪源ACRBP基因,并构建了pIRES2-EGFP-ACRBP真核表达载体,经过双酶切、测序鉴定后,转染CHO细胞,通过绿色荧光观察、RT-PCR和Western-blot检验ACRBP表达载体在CHO癌细胞株中的表达情况.结果 显示:ACRBP蛋白在睾丸、附睾、前列腺、尿道球腺、卵巢、输卵管、精子中有条带,而在猪的精清中没有条带,转入CHO细胞后可观察到带荧光的阳性质粒,通过RT-PCR和Western-blot检测到ACRBP在CHO中得到了表达.

摘要： 目的 比较不同方法鉴定db/db小鼠基因型的特点.方法 采用酶切法、测序法和高分辨率溶解曲线(HRM)对db/db小鼠基因型进行鉴定,并对不同方法的特点进行比较研究.结果 3种方法都能稳定、可靠地鉴定db/db小鼠基因型,其中测序法准确性高,操作简单,但费用相对偏高.酶切法操作烦琐,耗时长,存在一定假阳性.HRM节约成本,更简便、快速,尤其适用于大批量鉴定.结论 酶切法、测序法和HRM各有特点,可结合现有条件选择适当方法进行鉴定.

摘要： 目的 探讨微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)检测含有目的基因的PUC57质粒过程中出现的问题及解决方法.方法 用ECORⅠ酶37°C孵育含有目的基因的PUC57质粒2 h和4 h,然后65°C孵育20 min,灭活ECORⅠ酶.用伯乐QX200TM微滴式数字PCR分别检测PUC57质粒和经ECORⅠ酶酶切后的PUC57质粒,同时对酶切后的PUC57质粒分多天进行检测,对检测结果进行比较.结果 含有目的基因的PUC57质粒经ECORⅠ酶酶切2 h和4 h后的检测值与质粒理论值之间差异无统计学意义(t=-0.192、-0.403,P>0.05),同时酶切与没有酶切的PUC57质粒检测值之间差异有统计学意义(Z=-4.194,P<0.05).酶切后的检测值与PUC57质粒理论值相符合.酶切后的PUC57质粒随着放置时间的延长,检测值逐渐降低.结论 用伯乐QX200TM微滴式数字PCR检测含有目的基因的PUC57质粒时要先酶切再检测,酶切时间只需2 h即可将质粒酶切完全,同时酶切的PUC57质粒要尽快检测.

摘要： 本文以高中生物酶切质粒连接实验为主来进行分析,在整体的分析过程中,需要坚持以酶切质粒连接为标准,通过生物的基础知识来拓展思路设计,把酶切和在连接的实验完善的更加合理,验证高中生物教学中关于酶切质粒后再连接的关键问题。在整体验证方法上,要以生物学科中的基础知识为主,以常见的多聚体和聚合物及其空间结构来实现粒连接的发展变化,通过实验和再实验来完善结构的最终意义,为学习和延伸实验知识调整奠定基础。

摘要： 以本课题组自行培育的芦笋品种A10为试材,通过对反应体系中的几个关键因素进行优化,建立了适宜芦笋的AFLP体系.结果表明:酶切基因组适宜用量为400～500 ng;酶切-连接采用一步法;预扩增时退火温度降低5°C;预扩增产物适宜稀释倍数为20倍.

摘要： 利用不对称PCR-SSCP技术,在鲁西黄牛和荷斯坦奶牛SMAD4基因的3'端非翻译区找到了1个碱基T插入突变位点和1个G→A突变位点,其中G→A突变产生了一个HhaⅠ酶的酶切位点.利用不对称PCR-SSCP和酶切分析在116头鲁西黄牛和75头荷斯坦奶牛群体中对该G→A突变位点的频率进行了分析,两种方法得到的结果完全一致,说明不对称PCR-SSCP不仅可以用于基因突变的检测,而且具有较高的准确性.通过对不对称PCR-SSCP和传统的PCR-SSCP的比较,发现不对称PCR-SSCP条带少且带型清晰、稳定性较高.

摘要： 本发明涉及一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用。该方法通过在样品预处理过程中使用与胰蛋白酶不同的多种限制性内切酶处理胶原蛋白的方式，从胶原蛋白中获得专属性肽段，用来鉴别不同物种来源的皮类、胶类中药及其产品的真伪，并判断未知胶类样品的种属来源。并且本发明从高保守的胶原蛋白中获得专属性肽段的方法有利于中药皮类、胶类动物药的质量控制，可大大提高皮类、胶类动物药产品及行业的检测效率和准确度，特别是阿胶类中药及其中成药的鉴别，具有重要的科学意义与应用价值。

摘要： 本发明公开了一种检测核酸内切酶酶切位点的方法。本发明利用芯片上数以十亿计的核酸序列来高通量系统性的检测核酸内切酶对DNA的识别切割位点及核心序列特征，采用两次测序分别获取碱基序列及正常的双链DNA，同时根据酶切前后荧光信号的改变，运用生物信息分析方法得到内切酶的识别切割位点。通过对内切酶识别切割位点的研究，可检测内切酶的识别切割位点的倾向性，并且可以提前预测内切酶的星号活性及基因组编辑技术中内切酶的脱靶效应，同时，也可用于大规模筛选新型基因组编辑系统中使用的内切酶所需要识别的PAM序列。与现有技术中的测序方法相比，本发明的检测方法具有速度快且通量高的优势。

摘要： 本发明公开了一种外源基因DNA片段克隆到质粒载体相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点的方法。质粒载体用限制性内切酶AB、AC分别酶切，得到AB、BA及AC、CA四个DNA片段。(B、C为质粒载体上相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点)。外源基因DNA片段用限制性内切酶B、C酶切，得到BC片段。AB、BC、CA与AC、BC、BA这三个DNA片段分别进行连接、转化，涂布在筛选平板上培养，再挑取单菌落进行筛选，可以得到外源基因连入质粒载体正反两个方向的重组质粒。本发明的优点是：使用本发明构建的质粒载体，无法进行双酶切的相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点也可作为克隆外源基因DNA片段的选择；另外，外源基因DNA片段连入载体的两个方向也可实现。

摘要： 本发明属于分子生物学及荧光检测技术领域，涉及一种基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，该方法利用核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针杂交形成双链复合物，该复合物能够与OTA发生特异性链置换反应并释放出荧光标记探针和OTA‑核酸适配体复合物，从而引发ExoI对单链荧光标记寡核苷酸探针以及OTA‑核酸适配体复合物的酶切反应释放出OTA；释放出的OTA能够引发下一个链置换反应和酶切反应，依次循环，实现信号放大。本发明解决现有依赖抗体的OTA快检方法中易出现交叉反应、灵敏度不高、成本过高等缺点，具有操作简单，方便快捷的优点。

摘要： 一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，且所述二硫键横跨所述精氨酸。本发明对多肽中需进行保护的精氨酸的两侧，选择适当的位点插入半胱氨酸或者将不重要的氨基酸突变为半胱氨酸，使两个半胱氨酸横跨拟保护的精氨酸形成二硫键。通过二硫键带来的构象变化，在酶切处形成空间位阻，降低胰蛋白酶和精氨酸羧基端的亲和力，大幅减弱甚至消除酶切效应。

摘要： 本发明公开了一种基于ccdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法。将ccdB基因插入载体pUC18的EcoRI和HindIII位点之间，得到pUC18‑ccdB质粒，然后将pUC18‑ccdB质粒、DNA片段、限制性内切酶SmaI、T4连接酶、T4连接酶buffer和水混合形成反应体系进行反应，由此得到连接产物。本发明以常见的pUC18载体为骨架载体，结合ccdB致死基因的筛选机制以及ccdB致死基因内部含有的SmaI酶切位点，构建出一套快速、高效、低背景的克隆方法，无需对ccdB重组载体及PCR产物进行双酶切及胶回收等步骤，可以直接将PCR产物连接到克隆载体，效率高，整个时间控制在20分钟以内，极大地减少了实验成本，加快了实验进度，该克隆体系具有极为广阔的应用前景。

摘要： 本发明公开一种快速获得未知核酸内切酶切割模式的方法，先将未知核酸内切酶切割得到的DNA片段经过处理后连入T载体，测序引物分别向连接产物的连接位点方向进行测序，使得测序结果覆盖底物DNA的断裂位置，然后根据外源DNA片段(即原始DNA片段)序列与紧邻的T载体边界的序列信息，经过序列比对分析，即可准确推断出底物DNA片段的断裂位置以及断裂方式，因而可用于未知核酸酶的识别位点测定，具有操作简单快速、结果准确、成本低、耗时短等优点。

摘要： 本发明公开一种在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切的方法。该方法包括：将非离子表面活性剂溶液喷洒到生物组织切片表面，孵育；然后，将蛋白酶溶液喷洒到生物组织切片表面，进行原位酶切。本发明通过非离子表面活性剂的使用，可以使蛋白质更容易被蛋白酶切断，从而大大提高酶切效率。该方法适用于生物组织切片表面蛋白质原位质谱成像的样本制备。

摘要： 本发明涉及一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用。该方法通过在样品预处理过程中使用与胰蛋白酶不同的多种限制性内切酶处理胶原蛋白的方式，从胶原蛋白中获得专属性肽段，用来鉴别不同物种来源的皮类、胶类中药及其产品的真伪，并判断未知胶类样品的种属来源。并且本发明从高保守的胶原蛋白中获得专属性肽段的方法有利于中药皮类、胶类动物药的质量控制，可大大提高皮类、胶类动物药产品及行业的检测效率和准确度，特别是阿胶类中药及其中成药的鉴别，具有重要的科学意义与应用价值。

摘要： 本发明公开了一种检测核酸内切酶酶切位点的方法。本发明利用芯片上数以十亿计的核酸序列来高通量系统性的检测核酸内切酶对DNA的识别切割位点及核心序列特征，采用两次测序分别获取碱基序列及正常的双链DNA，同时根据酶切前后荧光信号的改变，运用生物信息分析方法得到内切酶的识别切割位点。通过对内切酶识别切割位点的研究，可检测内切酶的识别切割位点的倾向性，并且可以提前预测内切酶的星号活性及基因组编辑技术中内切酶的脱靶效应，同时，也可用于大规模筛选新型基因组编辑系统中使用的内切酶所需要识别的PAM序列。与现有技术中的测序方法相比，本发明的检测方法具有速度快且通量高的优势。