巴斯德毕赤酵母

摘要： 利用基因工程技术将人源Cu,Zn-SOD与EC-SOD的C末端肝素结合结构域(HBD)的编码序列进行密码子优化并人工合成,然后电转化至毕赤酵母进行表达.单因素实验表明,与现有研究的一些重组EC-SOD相比,其比活力提高了1.30~3.78倍.正交分析得最佳摇瓶条件为诱导时间为5 d,初始pH值为5.2,诱导剂量的体积分数为1.0%,酶活可达1120.2 U·mL^(-1),是初始酶活的2.94倍;这些结果表明,SOD-HBD融合蛋白在一定程度上解决了重组EC-SOD表达量低的问题,为重组EC-SOD蛋白的推广与应用提供重要的物质基础条件.

摘要： 毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优势,已被广泛应用于表达外源蛋白。但是另一方面,由于该系统受包括外源基因的特性、菌种、表达环境和发酵技术等多种因素的影响,,其在不同外源蛋白的表达上也表现出很大差异。该文着眼于分子水平上的基因转录、蛋白质加工、蛋白质降解以及转运分泌4个模块,介绍了利用毕赤酵母表达系统通过优化密码子、高拷贝数外源基因、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因、共表达促折叠因子等途径提高外源蛋白表达效率的相关策略,并简要展望了该系统的发展前景,以期为构建高效毕赤酵母细胞工厂提供指导。

摘要： 为了开展体外互作实验,以pXMJ19质粒为载体构建pXMJ19-gt1-His重组质粒,通过单因素优化实验获得毕赤酵母甘油转运体GT1的最优表达宿主为C41(DE3);最优表达条件为OD600达到0.7时加入终浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),于30°C、110 r/min诱导10 h.通过超速离心验证了部分GT1蛋白在大肠杆菌中位于细胞质膜上,并筛选得到针对GT1重溶解率最高的去垢剂NP-40.在去垢剂环境下通过镍离子亲和层析纯化得到GT1蛋白,然后利用等温滴定量热法体外检测其与甘油的结合能力,结果表明:GT1与甘油在体外相互作用产生放热反应,且测得其与甘油的平衡解离常数KD值为6.58μmol/L.实验说明原核表达的GT1蛋白具有活性,且与甘油的体外相互作用明显,为GT1以甘油为配体进行结晶以及解析其三维结构提供了研究基础.

摘要： 为寻找巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)中甲醇代谢潜在调控因子,通过转录组数据分析,发现受甲醇显著诱导而被甘油所抑制的SUT2(Sterol up take 2,固醇摄取基因2).固醇是过氧化物酶体膜重要组成部分,过氧化物酶体是甲醇代谢重要场所.为探究SUT2参与甲醇代谢功能机制,通过敲除及过表达SUT2基因,检测K.phaffii在不同碳源、时间点、氧含量条件下胞内麦角固醇含量及AOX1(Alcohol oxidase 1)酶活性变化;发现在甲醇培养基中SUT2通过促进胞内麦角固醇合成及过氧化物酶体膜形成,参与甲醇代谢.与之相反,ATG26(Autophagy-related gene 26,自噬相关基因26)通过促进麦角固醇合成甾醇葡萄糖苷,减少过氧化物酶体膜形成.最后,建立K.phaffii中SUT2及ATG26调控过氧化物酶体膜麦角固醇含量,响应甲醇代谢初步模型.

摘要： 由可再生原料微生物生产 α-法尼烯是一种有前途的替代传统石油基工艺的方法.尽管已经报道 α-法尼烯可以通过常规模型菌株如大肠杆菌和酿酒酵母异源产生,但是其发酵规模不易扩大.巴斯德毕赤酵母是生产类异戊二烯的良好平台且可高密度培养,具有大规模生产 α-法尼烯的潜力.在该项研究中,首先确定tHmg1,IDI1,ERG19,AFSLERG20是甲羟戊酸途径和 α-法尼烯合成途径的限速酶基因.然后对限速酶基因进行组合过表达并优化基因拷贝数以平衡代谢路径增大流向 α-法尼烯合成的代谢通量,最终获得菌株F16,其 α-法尼烯产量为(1.09±0.02)g/L.最后,通过外源添加不饱和脂肪酸促进 α-法尼烯分泌到细胞外,当培养基添加20 mmol/L的油酸,在摇瓶中获得最高的α-法尼烯产量约1.40 g/L[0.32 g/g细胞干重(dry cell weight,DCW)].这是出发菌株F1产量的3.1倍.该研究是首次以巴斯德毕赤酵母作为底盘微生物细胞来生产 α-法尼烯,并为其他倍半萜的异源生物合成提供了新的思路.

摘要： 据欧盟官方公报消息,2020年11月30日,欧盟委员会发布法规(EU)2020/1799号条例,根据欧洲议会和理事会法规(EC)No.1831/2003,批准一种6-植酸酶制剂(6-phytase)作为蛋鸡和其他产蛋禽类的饲料添加剂。据条例,该制剂是由一种转基因巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)产生。根据附件中规定的条件,该添加剂所属类别为“动物技术添加剂”。功能组别为“消化增强剂”。授权结束日期为2030年12月21日。本条例自发布之日起第20天生效。

摘要： TAT-SOD是TAT蛋白转导结构域与SOD的融合蛋白质.作者以2007年构建的产TAT-SOD重组毕赤酵母菌为出发菌株,通过摇瓶实验研究不同温度、初始pH、诱导剂浓度等因素对蛋白质表达的影响.通过比色分析法测定菌体浓度、超氧阴离子自由基清除法测定酶活、SDS-PAGE分析目的蛋白质TAT-SOD的浓度;并采用定量PCR法分析表达菌株的目的基因的mRNA变化规律,从而研究长期保藏重组毕赤酵母菌株表达TAT-SOD的适合性及其条件优化.研究结果表明,摇瓶发酵的最佳条件下(YPDM培养基,体积分数1.0％诱导剂浓度,诱导温度30.0°C,初始pH值7.0),发酵液上清酶活水平为753 U/mL,是未优化初始酶活水平的5.1倍,其中pH值优化使TAT-SOD表达水平提高到原始值的3.4倍.7.0的初始诱导pH值的mRNA水平是对照组pH 4.0的3.5倍.这些结果说明,长期保藏的重组毕赤酵母菌株仍然适合表达TAT-SOD,发酵条件会对毕赤酵母的TAT-SOD表达造成显著影响,影响表达水平的最主要因素是目的蛋白质的mRNA水平变化.

摘要： 黄曲霉毒素是由真菌黄曲霉、寄生曲霉、集蜂曲霉和溜曲霉产生的一类强致癌诱变剂,其毒性大,稳定性高,对人类和动物的危害较大,其中黄曲霉毒素B1是毒性最强的一种.该毒素的转化、去毒一直是受到关注的问题.本实验室长期从事黄曲霉毒素生物去毒转化的研究,筛选到一株产黄曲霉毒素解毒酶的菌株.具有黄曲霉毒素解毒酶活性的相关蛋白ADTZ是一种未见报道的新活性蛋白,其中起始菌中的产量较低,通过基因工程技术获得此基因,并用重组技术构建表达ADTZ的基因工程巴斯德毕赤酵母.

摘要： 根据GenBank公布的伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)编码gE的基因序列特点,利用DNAStar及PrimerPremer专业软件分析并设计了一对引物,扩增出PRV-SHgE主要抗原表位基因区段(660bp),构建了分泌表达载体pPICZaC-pgE,经电转化整合入巴斯德毕赤酵母野生型菌株X-33,经筛选、诱导表达,获得重组酵母工程菌X-33/pPICZaC-pgE,使gE主要抗原表位基因在酵母培养液上清中分泌表达,经Western-blotting验证表达产物具有抗原性.将表达产物透析后作为ELISA抗原,通过对其特异性、敏感性及工作条件的优化和对47份PRV阴性血清的检测结果的统计学分析,建立了PRVgE-ELISA鉴别诊断方法.通过对146份临床血清样品的检测分析,结果表明与IDEXXgE-ELISA试剂盒的符合率达91％以上.此方法可用于gE基因缺失PRV疫苗免疫动物和PRV野毒感染动物的鉴别诊断。

摘要： 本文针对玉米芯等生物质资源利用的问题，通过表达载体pGAPZB将来源 于热带假丝酵母的木糖还原酶基因(XYL1)引入巴斯德毕赤酵母X-33，进行成功表 达，总酶活达到1.64U/mg。采用海藻酸钙凝胶包埋法固定该重组菌，研究固定化 条件下玉米芯水解液的发酵特性。结果表明，木糖醇转化率在pH 6.0、30°C、接 种量20%、装液量24%、转速130 rpm时达到最高，为37.5%。本文首次在毕赤酵 母成功表达XYL1，并研究固定化细胞发酵条件，以期为生物转化法大规模生产木 糖醇以及乙醇提供新的选择途径。

摘要： 巴斯德毕赤酵母表达系统是一种优秀的重组蛋白表达系统,近年来被广泛的应用于重组蛋白的表达。该文从诱导时间、pH值、甲醇剂量等方面对重组基因酵母工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。结果表明:摇瓶发酵最佳诱导周期为96h,pH控制在6.5～7.5范围内,诱导期甲醇的最佳加入量为每日1.0％。

摘要： 目的:研究粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中的分泌表达.方法:采用PCR技术以GM-CSF基因为模板定向克隆到PGAPZα-A表达载体中;转化到PpastorisGS115(his4)酵母菌进行表达,表达后的产物用SDS-PAGE蛋白质电泳鉴定,MTT比色法测活.结果:GM-CSF基因克降到表达质粒载体PGAPZα-A并成功地实现了在毕赤酵母中的表达,该目标蛋白不需复性,其活性可达到1.27×108IU/mg.结论:rhGM-CSF基因在酵母中成功地克隆表达,表达后的产物有明显活性而且蛋白含量高,杂蛋白少,对规模化生产十分有利.

摘要： 克隆了菊粉内切酶基因,构建了系列多拷贝高效基因工程菌,摇瓶发酵酶活力达到570U/ml;发酵罐发酵酶活达到2190U/ml,是国内外报导的最高酶活力的4倍以上.该菌生产的菊粉内切酶能水解菊粉生产低聚果糖,纯度达到90％.该株菌具有巨大的工业应用价值.

摘要： 克隆了菊粉内切酶基因,构建了系列多拷贝高效基因工程菌,摇瓶发酵酶活力达到570U/ml;发酵罐发酵酶活达到2190U/ml,是国内外报导的最高酶活力的4倍以上.该菌生产的菊粉内切酶能水解菊粉生产低聚果糖,纯度达到90％.该株菌具有巨大的工业应用价值.

摘要： 克隆了菊粉内切酶基因,构建了系列多拷贝高效基因工程菌,摇瓶发酵酶活力达到570U/ml;发酵罐发酵酶活达到2190U/ml,是国内外报导的最高酶活力的4倍以上.该菌生产的菊粉内切酶能水解菊粉生产低聚果糖,纯度达到90％.该株菌具有巨大的工业应用价值.

摘要： 克隆了菊粉内切酶基因,构建了系列多拷贝高效基因工程菌,摇瓶发酵酶活力达到570U/ml;发酵罐发酵酶活达到2190U/ml,是国内外报导的最高酶活力的4倍以上.该菌生产的菊粉内切酶能水解菊粉生产低聚果糖,纯度达到90％.该株菌具有巨大的工业应用价值.

摘要： 克隆了菊粉内切酶基因,构建了系列多拷贝高效基因工程菌,摇瓶发酵酶活力达到570U/ml;发酵罐发酵酶活达到2190U/ml,是国内外报导的最高酶活力的4倍以上.该菌生产的菊粉内切酶能水解菊粉生产低聚果糖,纯度达到90％.该株菌具有巨大的工业应用价值.

摘要： 根据本发明，描述了用于生产蛋白质的分离核酸、表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，以及使用所述表达方法生产的蛋白质。更特别地，描述了从巴斯德毕赤酵母分离的核酸，其中所述核酸具有启动子活性。本发明还涉及使用巴斯德毕赤酵母启动子生产蛋白质的表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，以及使用所述表达方法生产的蛋白质。

摘要： 描述了通常不能利用半乳糖作为碳源但根据本文的方法已被基因工程化为利用半乳糖作为单一碳源的低等真核细胞例如巴斯德毕赤酵母。细胞被基因工程化为表达包含Leloir途径的酶中的几种。具体地，细胞被基因工程化为表达半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，以及任选地半乳糖通透酶。另外，提供了用于改进在已被基因工程化为产生具有N-聚糖(其具有半乳糖残基)的糖蛋白但通常缺乏包含Leloir途径的酶的细胞中具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的产量的方法，所述方法包括用编码半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的一种或多种核酸分子转化细胞。描述的方法和宿主细胞使得同化半乳糖的能力的存在或缺乏作为用于制备重组细胞的选择方法。所述方法和宿主细胞在本文显示对于制备具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的免疫球蛋白和类似物是特别有用的。

摘要： 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用。是以GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC和ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为特异引物，以毕赤酵母Pichia p astoris GS115的基因组DNA为模板，采用PCR扩增方法获得毕赤酵母转录因子HAC1，并成功构建了巴斯德毕赤酵母工程菌。本发明解决了目前如果重组蛋白不能正确折叠成天然构象，就会影响异源蛋白正常分泌表达的问题，具有将高效重组微生物技术和蛋白质工程技术相结合，提高了青霉来源GOD酶活等优点。

摘要： 本发明提供在甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母中产生含非天然氨基酸的多肽的正交翻译系统。还提供了在甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母中产生含非天然氨基酸的多肽的方法。

摘要： 根据本发明，描述了用于生产蛋白质的分离核酸、表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，以及使用所述表达方法生产的蛋白质。更特别地，描述了从巴斯德毕赤酵母分离的核酸，其中所述核酸具有启动子活性。本发明还涉及使用巴斯德毕赤酵母启动子生产蛋白质的表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，以及使用所述表达方法生产的蛋白质。

摘要： 描述了通常不能利用半乳糖作为碳源但根据本文的方法已被基因工程化为利用半乳糖作为单一碳源的低等真核细胞例如巴斯德毕赤酵母。细胞被基因工程化为表达包含Leloir途径的酶中的几种。具体地，细胞被基因工程化为表达半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，以及任选地半乳糖通透酶。另外，提供了用于改进在已被基因工程化为产生具有N-聚糖(其具有半乳糖残基)的糖蛋白但通常缺乏包含Leloir途径的酶的细胞中具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的产量的方法，所述方法包括用编码半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的一种或多种核酸分子转化细胞。描述的方法和宿主细胞使得同化半乳糖的能力的存在或缺乏作为用于制备重组细胞的选择方法。所述方法和宿主细胞在本文显示对于制备具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的免疫球蛋白和类似物是特别有用的。

摘要： 本发明提供在甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母中产生含非天然氨基酸的多肽的正交翻译系统。还提供了在甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母中产生含非天然氨基酸的多肽的方法。

摘要： 本发明公开了一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明公开的一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，通过敲除巴斯德毕赤酵母GS115中糖酵解关键基因pgi和肌醇生物合成负调节基因PAS_chr‑1_0033，同时过表达肌醇‑3‑磷酸合成酶(ino1)基因，提出了一种利用巴斯德毕赤酵母GS115表达肌醇的新方法。本发明首次以巴斯德毕赤酵母为表达宿主，实现了毕赤酵母表达肌醇的实用技术，采用高密度发酵培养的方法，最终工程菌在5L发酵罐中肌醇产量可达32.3g/L。

摘要： 本发明涉及微生物领域，公开了巴斯德毕赤酵母、发酵剂和它们在降解呕吐毒素或制备发酵饲料中的应用。该巴斯德毕赤酵母的保藏编号为CGMCC No.23705，筛选自玉米浸泡水，该菌能在pH4‑7条件下生长并降解玉米浆中的呕吐毒素。将该菌与乳酸菌和芽孢杆菌复配制备成发酵剂进行饲料发酵时，能够提高发酵饲料的营养价值，其中，活菌数超过1010CFU/g，粗蛋白含量能达35重量％，降低呕吐毒素含量(低于1mg/kg)。

摘要： 本发明公开了一种巴斯德毕赤酵母组成型启动子及其改造方法和应用，所述组成型启动子为P0887‑GAP、P0887‑AOX1和P0887‑GS中的一种；所述启动子P0887‑GAP的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；所述启动子P0887‑AOX1的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；所述启动子P0887‑GS的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示。本发明通过替换启动子P0887的5’非翻译区序列，改造后启动子的转录活性基本不变，荧光强度提高至原始启动子的37倍。