分泌表达

摘要： 为提高大肠杆菌异源表达β-葡萄糖苷酶的底物可及性,本研究以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞,使用信号肽OprI、OsmY、PelB、OmpA将纳豆芽孢杆菌的β-葡萄糖苷酶基因bglH锚定到大肠杆菌BL21(DE3)外膜和周质上。然后使用启动子T7、Trc、LacUV5诱导表达Ⅱ型分泌途径的SecB伴侣蛋白,进而实现全细胞催化糖苷型底物水解。本研究通过表征不同细胞定位的β-葡萄糖苷酶活性,发现信号肽PelB分泌效果明显高于其他信号肽,LacUV5启动子与SecB伴侣蛋白组合表达bglH的重组菌株全细胞催化酶活性最高。此外,添加甘氨酸至质量分数为1.0%时,全细胞催化β-葡萄糖苷酶活性最高。并且通过优化诱导条件确定了β-葡萄糖苷酶的最优发酵条件:初始细胞密度(OD_(600))为1.0,发酵温度为25°C,发酵时间为24 h,发酵pH为6.5,最终全细胞催化β-葡萄糖苷酶活性可达2.55 U/ml。

摘要： 作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外。重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积累在大肠杆菌胞质内的产物有明显的差异,分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的重组酶BsBsP的比酶活为153.7 U/mg,是大肠杆菌胞质内产物的5.5倍。重组酶BsBsP最适pH为6.0,最适温度为45°C。重组酶BsBsP对直链淀粉无降解作用,为I型普鲁兰酶。在以土豆淀粉为原料的粉丝制作工艺中,以重组酶BsBsP水解芡糊淀粉可以有效降低粉丝断条率。枯草芽孢杆菌普鲁兰酶可利用自身结构实现高效分泌表达,重组酶适用于以淀粉为原料的粉丝制作。

摘要： 藤黄节杆菌(Athrobacter luteu)β-1,3-葡聚糖酶(βglⅠ)能够特异性的作用于β-葡聚糖中的β-1,3-糖苷键,在酵母裂解活性上具有突出优势,但是βglⅠ在生产上存在表达低、生产成本高的问题。作者利用无缝克隆技术构建表达载体,实现了βglⅠ在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,并通过比较不同Tat类型和Sec类型信号肽、RBS、5′UTR等表达元件来提高βglⅠ的胞外产量。结果表明,信号肽SPLipA使得βglⅠ表达水平提高了0.4倍,在此信号肽基础上继续比较各RBS和5′UTR序列,其中cry3A 5′UTR使βglⅠ产量高出出发菌株1.2倍。此外,利用Ni2+亲和层析柱纯化βglⅠ并对其酶学性质进行研究,结果表明该酶的最适反应温度为50°C,最适反应pH为6.0,在0~45°C、pH 4.0~9.0的范围内稳定性较好,比活为973 U/mg。

摘要： 【目的】在毕赤酵母中构建猫血清白蛋白(feline serum albumin,FSA)表达系统,并探索其最适的基本表达条件,为FSA的生产提供一种新方法。【方法】在GenBank上获取FSA碱基序列,进行密码子优化并合成,将优化的密码子构建到载体pPIC9K上,经PCR和双酶切验证后通过电击转化将重组质粒FSA-pPIC9K转化毕赤酵母GS115,依次经MD平板和G418筛选后进行菌落PCR获得阳性菌株,随机选取阳性菌株经甲醇诱导表达96 h后,取表达上清液进行Western blotting验证。选取表达量较高的菌株分别在不同温度(24、26、28和30°C)、pH(4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)和甲醇诱导量(其中1组为每24 h添加0.5%,其余4组为每12 h分别添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)的条件下诱导表达96 h,取表达上清液进行Western blotting验证。【结果】菌落PCR结果显示,获得2条大小分别约为2.3和2.2 kb的目的基因条带和毕赤酵母AOX1基因扩增条带,诱导表达96 h后取表达上清液进行Western blotting验证,在70 ku左右出现特异性条带。通过基本条件优化发现该蛋白在28°C,pH为6.0且每12 h添加0.5%的甲醇条件下表达量较高。【结论】毕赤酵母GS115可稳定表达FSA。

摘要： 有机磷水解酶是一种能够有效水解有机磷酸酯类化合物的酯酶,天然含有机磷水解酶的生物体中分离的有机磷水解酶存在水解速率较慢、产量低、提纯复杂等问题。本文通过枯草芽孢杆菌分泌表达有机磷水解酶,提高有机磷水解酶产量。同时对有机磷水解酶基因进行点突变,构建了H254R-H257Y-L303T三位点联合突变的突变体,用联苯胺定量法比较野生型和突变体水解神经性毒剂沙林的能力。结果表明,该枯草芽孢杆菌表达体系能够稳定分泌表达有机磷水解酶,野生型有机磷水解酶水解沙林的活性为0.407 mg/(min·mg),含有突变体的活性为0.790 mg/(min·mg),较野生型有机磷水解酶提升了94.1%,水解能力显著增强。通过BIOVIA软件模拟有机磷水解酶结构,发现突变体稳定性优于野生型有机磷水解酶。本枯草芽孢杆菌表达体系能够稳定分泌表达有机磷水解酶,具有较好的生物活性,突变体比野生型有机磷水解酶结构更加稳定,水解能力得到了提升,是一个比较理想的突变方向。

摘要： 为获得分泌表达的无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白并分析其免疫原性,根据A型产气荚膜梭菌α毒素基因序列,对α毒素的第176位组氨酸突变为天冬酰胺,同时对信号肽序列进行密码子优化,将化学合成的该序列插入到载体pET32a,获得重组质粒pET32a-αH176N,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),通过自诱导的方法分泌表达重组αH176N蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,αH176N蛋白在乳糖1~2 g/L、28°C诱导条件下高效分泌表达。卵磷脂酶试验及小鼠毒力试验显示,αH176N蛋白失去磷脂酶C活性及毒性。免疫保护试验结果显示,αH176N蛋白与氢氧化铝胶配制成的疫苗,以0.25 mL/只免疫试验兔就能达到100%(6/6)的免疫保护效果,优于传统灭活疫苗免疫2 mL/只的保护效果。

摘要： 胶原蛋白独特的三股螺旋结构,使其具有良好的力学性能和生物相容性,在生物医学材料等方面有广泛应用。利用微生物表达重组胶原蛋白,具有发酵周期短、成本低、便于遗传操作等优点,近些年发展迅速,但分泌带有三股螺旋结构的重组胶原蛋白仍是研究的难点。该研究以来源于化脓性链球菌的胶原蛋白V-B为对象,搭建了谷氨酸棒杆菌分泌表达重组胶原蛋白的平台。在重组胶原蛋白V-B前端引入6种不同信号肽(CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052或TorA),构建重组表达载体,并转入食品级表达宿主谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032中,结果显示PorB信号肽介导的分泌效果最好。此外,对PorB信号肽介导的分泌表达进行培养基、起始诱导菌浓度、诱导时长、IPTG浓度、溶氧的优化,最终胶原域B在摇瓶水平产量达到30 mg/L,是优化前的3倍,并通过圆二色谱表征,验证其正确折叠为三股螺旋。该研究为重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的高效分泌表达奠定了基础。

摘要： 为克隆桑天牛纤维素酶编码基因并将其在哺乳动物细胞中进行分泌表达,提取桑天牛肠道组织RNA进行RT-PCR扩增纤维素酶基因,构建真核表达载体并转染PK15细胞,测定细胞培养液的酶活性,用RT-PCR检测纤维素酶基因的表达情况。结果表明,通过RT-PCR成功扩增出纤维素酶基因AgcⅠ(711 bp)、AgcⅡ(720 bp),与目的基因相比,核苷酸序列相似性分别为99.4%、98.3%,氨基酸序列的相似性分别为100.0%、99.6%;构建出纤维素酶基因真核表达载体pCMS-AgcⅠ、pCMS-AgcⅡ,转染PK15细胞后,当pH值为4.5时测得细胞培养液的纤维素酶活性分别为0.07、0.20 U/mL,当pH值为5.5时测得细胞培养液的纤维素酶活性分别为0.09、0.24 U/mL;在细胞培养液中还测到了β-葡聚糖酶活性,pH值为4.5时的酶活性分别为0.05、0.16 U/mL,pH值为5.5时的酶活性分别为0.27、0.43 U/mL;AgcⅡ基因表达的纤维素酶活性及β-葡聚糖酶活性都显著高于AgcⅠ基因;通过PK15细胞的RT-PCR试验也检测到了AgcⅠ、AgcⅡ基因的表达。研究成功克隆出纤维素酶基因AgcⅠ、AgcⅡ,并将其转入到PK15细胞中实现了分泌表达,可为桑天牛纤维素酶基因的应用提供参考。

摘要： 为研究日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用。将日本曲霉来源的酸性蛋白酶基因(Ajpro A1)在毕赤酵母中高效表达,经5 L发酵罐高密度发酵后测得该酸性蛋白酶酶活力为669.6 U·mL^(-1),蛋白质量浓度为6.64 mg·mL^(-1)。氨基酸多重序列比对结果表明:该酸性蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶A1家族,与海枣曲霉来源的酸性蛋白酶同源性最高(73%),是一个新型的酸性蛋白酶。采用强阴离子交换层析柱对该酸性蛋白酶进行纯化得到电泳级纯酶,纯化后分析测得该重组酸性蛋白酶(AjproA1)的最适催化条件为pH值3.0,反应温度为45°C,在pH值为3.0~6.0及温度为40°C以下具有良好的稳定性。该酸性蛋白酶对不同蛋白质水解的分析结果表明,该酶底物水解特异性广泛,对酪蛋白组分中的κ-酪蛋白表现出最高水解活力。利用该酸性蛋白酶对猪肉进行处理,发现该酶能够有效降低猪肉剪切力,起到嫩化效果。研究结果旨在为新型酸性蛋白酶的开发及其在肉类嫩化中的应用提供理论参考。

摘要： 骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量较低,不能满足产业化需求。为提高骆驼凝乳酶原的表达量,采用定点突变的方法,分别在其前导肽的第11、26、34、35、38、39位氨基酸处引入1个N-糖基化位点,构建成6种骆驼凝乳酶原的N-糖基化突变体:chy11、chy26、chy34、chy35、chy38和chy39,并分别导入到毕赤酵母中进行分泌表达。测定和比较了野生型(wild)和各突变体骆驼凝乳酶原的表达量。Chy34、chy35、chy38和chy39的表达量显著提高,其中chy34的表达量最高。6种突变体均保持前导肽自切割活性。在50°C保温8 h,wild酶活完全丧失,而突变体仍有20%~80%的相对酶活,表明6种突变体的热稳定性均显著增强。研究结果为提高骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量和增强热稳定性提供了新的研究思路。

摘要： 目的：本研究克隆了牛α0干扰素(BoIFN-α0)成熟肽基因,使其在真核细胞中表达并研究其表达蛋白的活性.rn 方法：通过PCR方法扩增得到BoIFN-α0成熟肽基因,然后将其连接到含分泌信号肽序列的Pichia pastoris表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-BoIFN-α0,重组质粒经PmeI酶切线性化后电转化宿主菌GS115.转化子经100μg/Ml zeocinTM筛选和PCR鉴定,阳性重组菌经甲醇诱导后实现了BoIFN-α0在毕赤酵母系统中的分泌表达.rn 结果：SDS-PAGE和Western blot结果显示表达产物分子量约为18kDa和21kDa,推测表达产物发生了一定程度的糖基化.细胞病变抑制试验结果表明,重组BoIFN-α0具有较高的抗病毒活性达到5.72×106U/mg.rn 结论：这些研究结果为牛IFN-α的更深层次的应用奠定基础.

摘要： Pfs25蛋白是传播阻断型疟疾疫苗重要的候选抗原,然而,该蛋白的I期临床研究显示该蛋白在人体内只能激发较弱的免疫应答,如何提高Pfs25蛋白质的免疫原性成为研究重点。已有的研究表明:体外通过化学偶联方法获得的Pfs25蛋白聚合物,能显著提高其免疫原性。本文从基因水平,利用同尾酶的特性构建串联的Pfs25基因三拷贝融合基因(pfe25)&,每个单拷贝基因由连接臂(linker)连接,以保证每个单体pfs25蛋白的活性不受影响。构建重组质粒(pfs25)3/pPICZaA(或(pfs25)3/pGAPZaA)电转毕赤酵母菌,获得酵母重组体。ELISA、SDS-PAGE检测表达上清,显示有弱阳性表达。

摘要： 溶菌酶是动物体内十分重要的非特异性免疫因子,参与多种免疫防护反应,具有杀菌、抗病毒、提高免疫力、减轻炎症等多种功效,有着潜在的研究价值和商业前景,本实验室首次对牦牛胃溶菌酶基因进行了真核表达研究.参照GeneBank中牦牛胃溶菌酶基因的序列号(GenBank:EU780011.1),根据实验需要设计并合成引物.利用RT-PCR技术从牦牛胃组织总RNA中扩增获得特异性基因片段,将所获得的目的片段克隆至pMD@19-T Vector.重组子测序结果表明,牦牛胃溶菌酶基因序列大小为441bp,其中前54个密码子翻译成信号肽,成熟肽分子量大小为14.1kD.对具有较高抗性的菌株进行甲醇诱导表达，经SDS-PAGE分析鉴定，并用藤黄微球菌对表达产物进行活性测定。结果表明:重组表达菌株分泌的重组蛋白均与预期大小一致;在72h时表达产物活性最高，为480U/ml;体外抑菌检测显示，毕赤酵母表达产物对金黄色葡萄球菌有很好的抑菌作用.上述结果表明:牦牛胃溶菌酶基因在毕赤酵母X33中得到可溶性表达，构建了相应的工程菌株，并具有一定的抑菌活性:同时表明耗牛胃溶菌酶在消除胃内有害细菌方面发挥重要的免疫作用。

摘要： 脂肪氧合酶(Lipoxygenase,ECl.12.11.12,简称LOX)广泛存在于植物组织中,它是一种含非血红素铁的酶,专一性催化含有顺,顺-1,4-戊二烯单元的多不饱和脂肪酸(如,亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等)的氧合作用,生成脂肪酸的氢过氧化物.这些过氧化合物可对面粉及鱼油等食品中的胡萝卜素进行漂白;对蛋白质、油、淀粉、植物纤维或它们的混合物进行交联;用于绿色香料、植物激素等的合成。因此，LOX具有广泛的市场需求。NCBI基因组数据库的比对结果表明，铜绿假单胞菌含有LOX基因。以铜绿假单胞菌基因组为模板，通过PCR技术扩增得到LOX基因，将该基因插入到大肠杆菌表达载体pET22b的NdeⅠ-HindⅢ位点，并转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)得到LOX重组菌。250 mL摇瓶发酵结果表明，20°C及1 mM IPTG诱导50 h，重组菌胞外最高酶活达32000 U/mL.3L罐发酵结果表明，在相同诱导条件下重组菌胞外最高酶活可达到30000 U/mL。以10%甘油为保护剂，经过硫酸钱沉淀、阴离子交换对蛋白进行纯化，得到电泳纯的脂肪氧合酶。

摘要： 通过观察ZnT8基因干扰和过表达处理对MLTC-1细胞孕酮的分泌(睾酮合成中重要中间产物),探讨ZnT8对睾丸间质细胞锌稳态、睾酮合成相关因子表达的影响找出其影响睾酮分泌的机制。指出，(1)ZnT8表达变化可以影响MLTC-1细胞孕酮的分泌。(2)ZnT8表达变化影响孕酮分泌的机制可能是通过影响MLTC-1细胞内锌稳态进而调节StAR等睾酮合成相关因子活性而实现的。

摘要： 通过观察ZnT8基因干扰和过表达处理对MLTC-1细胞孕酮的分泌(睾酮合成中重要中间产物),探讨ZnT8对睾丸间质细胞锌稳态、睾酮合成相关因子表达的影响找出其影响睾酮分泌的机制。指出，(1)ZnT8表达变化可以影响MLTC-1细胞孕酮的分泌。(2)ZnT8表达变化影响孕酮分泌的机制可能是通过影响MLTC-1细胞内锌稳态进而调节StAR等睾酮合成相关因子活性而实现的。

摘要： 通过观察ZnT8基因干扰和过表达处理对MLTC-1细胞孕酮的分泌(睾酮合成中重要中间产物),探讨ZnT8对睾丸间质细胞锌稳态、睾酮合成相关因子表达的影响找出其影响睾酮分泌的机制。指出，(1)ZnT8表达变化可以影响MLTC-1细胞孕酮的分泌。(2)ZnT8表达变化影响孕酮分泌的机制可能是通过影响MLTC-1细胞内锌稳态进而调节StAR等睾酮合成相关因子活性而实现的。

摘要： 通过观察ZnT8基因干扰和过表达处理对MLTC-1细胞孕酮的分泌(睾酮合成中重要中间产物),探讨ZnT8对睾丸间质细胞锌稳态、睾酮合成相关因子表达的影响找出其影响睾酮分泌的机制。指出，(1)ZnT8表达变化可以影响MLTC-1细胞孕酮的分泌。(2)ZnT8表达变化影响孕酮分泌的机制可能是通过影响MLTC-1细胞内锌稳态进而调节StAR等睾酮合成相关因子活性而实现的。

摘要： 通过观察ZnT8基因干扰和过表达处理对MLTC-1细胞孕酮的分泌(睾酮合成中重要中间产物),探讨ZnT8对睾丸间质细胞锌稳态、睾酮合成相关因子表达的影响找出其影响睾酮分泌的机制。指出，(1)ZnT8表达变化可以影响MLTC-1细胞孕酮的分泌。(2)ZnT8表达变化影响孕酮分泌的机制可能是通过影响MLTC-1细胞内锌稳态进而调节StAR等睾酮合成相关因子活性而实现的。

摘要： 目的:以IgA肾病队列为主要研究对象，探讨尿尿调蛋白水平对慢性肾病进展的影响。方法:主要以IgA肾病队列为研究对象,收集在我院确诊的原发性IgA肾病344例.结果:本研究中我们检测了344例IgA肾病病人尿中尿调蛋白水平。结论：在IgA肾病中，尿调蛋白与肾小管间质损害程度相关。本研究还第一次发现，在IgA肾病随访人群中，尿调蛋白是影响eGFR下降速率的独立危险因素，提示尿调蛋白在以IgA肾病为代表的CKD进展中发挥一定的作用。

摘要： 本发明涉及新型蛋白质分泌因子、包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的载体和载体被引入的转化细胞。本发明还涉及使用包含载体的转化细胞制备靶蛋白的方法。

摘要： 本发明涉及新型蛋白质分泌因子、包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的载体和载体被引入的转化细胞。本发明还涉及使用包含载体的转化细胞制备靶蛋白的方法。

摘要： 本发明公开了莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法，本发明利用来源于莱茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，通过信号肽预测软件预测其信号肽基因序列，对预测获得的信号肽基因进行人工合成，并将其插入到莱茵衣藻表达载体的启动子和克隆位点之间，构建了莱茵衣藻分泌型表达载体。同时，利用外源基因检测构建的莱茵衣藻分泌型表达载体的表达效率，将含有外源基因的莱茵衣藻分泌型表达载体，通过莱茵衣藻遗传转化法，转化到莱茵衣藻，经过筛选，获得能分泌表达外源基因的转基因工程藻株。本发明为利用莱茵衣藻作为生物反应器分泌表达外源基因奠定了基础。

摘要： 本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中以非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用。来源于瘤胃菌Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶RDPE本身不带有任何信号肽或分泌信号，却可以大量分泌到胞外；通过实验证明了RDPE并非通过Sec途径或Tat途径进行分泌，也不是因为细胞自溶和裂解而泄漏到胞外。因此，RDPE在枯草芽孢杆菌中是一种非经典分泌蛋白。将RDPE分别与18种目标蛋白进行融合，尝试以RDPE作为转运信号实现目标蛋白的分泌表达，16种融合蛋白均在胞内有明显的表达，9种融合蛋白被成功分泌到胞外，其中2种融合蛋白的分泌水平占相应融合蛋白总量的比例大于50%。所以，本实验发展了一种实现蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达的新策略。

摘要： 本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中实现外源蛋白质分泌表达的新策略。以非经典分泌蛋白质Eno，YceD和YvgN作为转运信号实现了外源蛋白质BgaB的分泌表达，但在YceD引导下，BgaB的分泌量很低。在PdhA和KatA情况下，虽然在细胞内检测到很高的融合蛋白质的量，在细胞外没有检测到相应的蛋白质和BgaB的活性，说明PdhA和KatA并不能实现BgaB的分泌表达。当GapA作为融合蛋白质时，胞内和胞外均没有检测到融合蛋白质，可能是融合蛋白质在细胞内并没有表达。本实验的方法对于实现外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌表达表达提供了新的可能。

摘要： 本发明公开了细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子提高外源蛋白在毕赤酵母中分泌的用途。将细胞色素结合结构域蛋白编码基因按毕赤酵母密码子偏好进行优化并与外源基因进行融合得到融合基因，将融合基因转化到毕赤酵母中进行分泌表达能显著提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。由此，本发明提供了细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子或其编码基因作为助分泌基因的新用途。此外，融合有细胞色素结合结构域蛋白编码基因的融合基因所表达的融合蛋白在分泌出毕赤酵母细胞外的过程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白质和细胞色素结合结构域蛋白质，使外源蛋白质的N端不增加额外的序列，不影响分泌蛋白质的理化性质。

摘要： 本发明公开了莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法，本发明利用来源于莱茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，通过信号肽预测软件预测其信号肽基因序列，对预测获得的信号肽基因进行人工合成，并将其插入到莱茵衣藻表达载体的启动子和克隆位点之间，构建了莱茵衣藻分泌型表达载体。同时，利用外源基因检测构建的莱茵衣藻分泌型表达载体的表达效率，将含有外源基因的莱茵衣藻分泌型表达载体，通过莱茵衣藻遗传转化法，转化到莱茵衣藻，经过筛选，获得能分泌表达外源基因的转基因工程藻株。本发明为利用莱茵衣藻作为生物反应器分泌表达外源基因奠定了基础。

摘要： 本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中以非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用。来源于瘤胃菌Ruminococcus？sp.？5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE本身不带有任何信号肽或分泌信号，却可以大量分泌到胞外；通过实验证明了RDPE并非通过Sec途径或Tat途径进行分泌，也不是因为细胞自溶和裂解而泄漏到胞外。因此，RDPE在枯草芽孢杆菌中是一种非经典分泌蛋白。将RDPE分别与18种目标蛋白进行融合，尝试以RDPE作为转运信号实现目标蛋白的分泌表达，16种融合蛋白均在胞内有明显的表达，9种融合蛋白被成功分泌到胞外，其中2种融合蛋白的分泌水平占相应融合蛋白总量的比例大于50%。所以，本实验发展了一种实现蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达的新策略。

摘要： 本发明公开了细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子提高外源蛋白在毕赤酵母中分泌的用途。将细胞色素结合结构域蛋白编码基因按毕赤酵母密码子偏好进行优化并与外源基因进行融合得到融合基因，将融合基因转化到毕赤酵母中进行分泌表达能显著提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。由此，本发明提供了细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子或其编码基因作为助分泌基因的新用途。此外，融合有细胞色素结合结构域蛋白编码基因的融合基因所表达的融合蛋白在分泌出毕赤酵母细胞外的过程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白质和细胞色素结合结构域蛋白质，使外源蛋白质的N端不增加额外的序列，不影响分泌蛋白质的理化性质。

摘要： 本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中实现外源蛋白质分泌表达的新策略。以非经典分泌蛋白质Eno，YceD和YvgN作为转运信号实现了外源蛋白质BgaB的分泌表达，但在YceD引导下，BgaB的分泌量很低。在PdhA和KatA情况下，虽然在细胞内检测到很高的融合蛋白质的量，在细胞外没有检测到相应的蛋白质和BgaB的活性，说明PdhA和KatA并不能实现BgaB的分泌表达。当GapA作为融合蛋白质时，胞内和胞外均没有检测到融合蛋白质，可能是融合蛋白质在细胞内并没有表达。本实验的方法对于实现外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌表达提供了新的可能。