定点突变

摘要： 前期研究发现GH43家族近缘物种相同位点存在天然突变。为了探究保守位点区域的基因突变对酶催化性能的影响,对来源于麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)的木聚糖酶XynZT-2利用软件计算、随机突变及天然存在的突变进行分子改造,定点突变第152位丙氨酸为甘氨酸(A152G),将原酶与突变酶基因转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。酶学性质比较发现,突变酶XynZT-2A152G最适温度为55°C,相比原酶XynZT-2提高了10°C;突变酶XynZT-2A152G最适pH为7.0,而原酶XynZT-2最适pH为6.0,突变酶最适pH更偏中性;突变酶XynZT-2A152G在pH 3.0~9.0均保持80%以上相对酶活力,原酶仅在pH 3.0~7.0有80%以上相对酶活力,在碱性环境中,突变酶比原酶pH稳定性更好。定点突变A152G后,对酶的最适温度和pH稳定性均有显著影响。该研究为进一步了解GH43家族木聚糖酶的构效关系奠定了基础。

摘要： 在化学酶法合成肝素过程中,肝素修饰酶6-O-磺基转移酶(6-OST)在肝素分子中N-乙酰基葡糖胺的C6羟基上进行硫酸化,以达到与肝素相似的硫酸化水平。构建的重组蛋白MBP-6-OST-3的纯化结果表明有较多杂蛋白条带,且蛋白浓度较低。利用定点突变原理设计引物,通过PCR扩增得到突变质粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His。将突变质粒转化至大肠杆菌Rosetta-gamiB(DE3),实现了MBP-6-OST-3-His蛋白的表达。利用镍柱亲和层析系统将MBP-6-OST-3-His蛋白纯化,并通过SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。该研究获得了具有高表达、高纯度的MBP-6-OST-3-His蛋白,这为获得高纯度的6-OST-3提供了可靠的方法以及为其应用于化学酶法合成肝素的研究提供了理论基础。

摘要： 将枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因进行了克隆和异源表达,并通过定点突变构建了2个突变体。针对该酶活力检测时存在的检测通量低、周期长和成本高等缺点,旨在建立一种简单高效的酶活力高通量检测方法。采用氯酚红(CPR)指示剂和4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液体系,并对检测条件进行优化,提高检测的准确性和灵敏性,建立了基于比色法的微孔板高通量检测方法,然后以L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其突变体作为模型酶,对高通量检测方法进行了验证。优化后的酶活检测条件为MES缓冲液2 mmol/L,CPR指示剂75 μmol/L,L-天冬氨酸75 mmol/L,pH 6.5,温度37°C,反应时间10 min,检测波长为567 nm。采用3种模型酶对微孔板高通量检测方法进行了验证,结果显示该方法与HPLC法测得的结果一致。高通量检测方法具有操作简便易行、灵敏度高等优点,能够用于L-天冬氨酸-α-脱羧酶的快速检测。该方法的建立将为L-天冬氨酸-α-脱羧酶进行定向进化及突变体的高通量筛选奠定基础。

摘要： 目的:提高几丁质酶降解几丁质生产几丁寡糖产量。方法:利用基因工程方法对淀粉酶链霉菌几丁质酶进行克隆、原核表达、酶学性质探究,并通过同源建模、催化域氨基酸比对、定点突变等方法探究几丁质酶活性位点。结果:克隆和原核表达后,产酶周期由7 d缩短至24 h,酶活可达132 U/L,较原始菌酶活性(100 U/L)提高了32%。决定几丁质酶活性的氨基酸为催化域的128,130位的天冬氨酸和132位的谷氨酸。结论:对几丁质酶基因克隆表达后,其产酶周期缩短、酶活性提高。

摘要： 为了改造黑曲霉(Aspergillus niger)来源的β-甘露聚糖酶ManA,获得耐热性高的突变体。利用易错聚合酶链式反应(PCR)技术对构建的表达质粒pGAPZαA-manA进行随机突变,将突变文库转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,表达筛选耐热性高的突变体,并进一步对突变位点进行定点突变,筛选其他耐热性高的突变体。结果表明,ManA的H283R与H283K突变体相对于野生型在耐热性方面有显著提升,75°C加热30 min其相对酶活由26.66%分别提升至76.95%和83.57%;在pH 3.0~9.0的条件下,50°C保存24 h,H283K突变体与野生型的相对酶活均在90%以上,H283R突变体在pH 3.0时的相对酶活下降到了84.72%,两个突变体的最适温度、pH及比酶活与野生型没有明显差异。说明β-甘露聚糖酶ManA的283位组氨酸(H283)对其耐热性较为关键,将该位点突变为精氨酸(R)和赖氨酸(K)时,ManA的耐热性得到显著提升。

摘要： H3N2犬流感病毒(H3N2 CIV)是流感病毒在进化过程中新形成的一个分支,在我国多地的犬中广泛流行。PB1-F2蛋白是甲型流感病毒的毒力因子,并可能与流感病毒的跨宿主传播相关。为探究PB1-F2长度的改变对H3N2 CIV的影响,本研究分别构建了包含H3N2 CIV各基因节段的重组质粒及携带M1R(PB1-F2的aa1由M突变为R)及S^(11)Stop(PB1-F2 aa11由S突变为终止氨基酸序列)突变的重组质粒pHW-PB1-F2-M1R和pHW-PB1-F2-S^(11)Stop,并均经测序鉴定。通过反向遗传操作技术,分别拯救了如下3株重组病毒:表达90个氨基酸PB1-F2的重组亲本病毒rH3N2;不表达PB1-F2的重组病毒rH3N2-M1R;仅表达11个氨基酸PB1-F2的重组病毒rH3N2-S^(11)Stop。将这3株重组病毒利用MDCK细胞传代后分别对其8个基因节段经PCR扩增及测序以鉴定其遗传稳定性。测序鉴定结果显示,3株重组病毒均正确构建,且不同代次之间各重组病毒的基因序列及各突变位点均相同,表明本研究构建的重组病毒具有较好的遗传稳定性。将表达PB1、PB1-F2-M1R及PB1-F2-S^(11)Stop的重组质粒分别与重组质粒PB2、PA和荧光素酶报告质粒pPolI-Luci-NP及海肾荧光素酶表达质粒共转染293T细胞,48 h后利用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性并比较3株重组病毒的聚合酶活性;测定3株重组病毒感染MDCK细胞后不同时间的TCID50以绘制病毒的生长曲线;将3株重组病毒均以106TCID50/50μL经鼻腔感染小鼠,分析各重组病毒对小鼠的致病性。用以评价PB1-F2长度改变对H3N2 CIV的影响。结果显示,rH3N2-S^(11)Stop的聚合酶活性与rH3N2相比无明显变化,而rH3N2-M1R的聚合酶活性则显著高于rH3N2(P<0.05);rH3N2-M1R和rH3N2-S^(11)Stop在MDCK细胞中的复制效率显著高于rH3N2(P<0.05),且rH3N2-M1R的复制效率要高于rH3N2-S^(11)Stop。小鼠的致病性试验结果显示,感染重组病毒后的小鼠表现被毛粗乱、精神不振、食欲减退等症状;3株重组病毒均对小鼠体质量有轻微影响,并对小鼠肺脏均造成了轻微病理损伤,但三者对小鼠体质量及肺脏的影响差别不明显。本实验结果首次证实,PB1-F2的不表达能够提高H3N2 CIV的转录效果,且PB1-F2长度的改变能够提高H3N2 CIV在细胞中的复制效率,但对病毒在小鼠中致病性的影响较小。本研究初步探究了PB1-F2长度的改变对H3N2 CIV的影响,为该病毒致病机制及其感染防控技术的研究与制定提供了参考依据。

摘要： 目的通过二代基因测序检测乳腺癌人表皮生长因子受体(HER)家族的变异情况,并对检测到ERBB3点突变人群进行分析,寻找具有临床意义的位点。方法收集2017年6月至2019年5月于广东省人民医院就诊的384例乳腺癌患者的原发肿瘤组织,采用二代基因测序技术分析HER家族的变异情况,通过生物信息学软件分析ERBB3突变位点是否为有害位点,Western blot验证ERBB3点突变对细胞功能的影响。结果在384例患者中有13例患者发现ERBB3变异,主要的变异类型为错义突变。通过生物信息学软件的计算显示,D297Y、T355I、E928G、E1261A、L431F、P583S、R667L、D297H、R678W位点突变可能为有害突变。ERBB3基因E928G突变的HER2阳性乳腺癌细胞磷酸化蛋白激酶B(PKB/Akt)水平显著升高。结论ERBB3基因E928G突变的HER2阳性乳腺癌细胞可能存在下游磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信号通路异常激活,可能与抗HER2靶向治疗耐药相关。

摘要： 目的构建小鼠Eya1第298位丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)的慢病毒表达载体,并探讨Eya1的298位点突变对MES23.5多巴胺能细胞凋亡的影响。方法采用PCR法、Golden Gate技术和LR反应构建携带Eya1S298A基因的慢病毒重组表达质粒。嘌呤霉素筛选稳定表达Eya1S298A的MES23.5细胞株。将稳定表达Eya1S298A或Eya1的MES23.5细胞经6-羟多巴胺处理2h,构建细胞损伤模型。CCK8法和Western blot法检测298位点突变对细胞活力和Bcl-2蛋白表达的影响。结果测序结果和PCR结果表明Eya1基因的第298位S被突变为A,Eya1S298A基因成功连接于慢病毒载体。CCK8结果表明,Eya1S298A突变组的细胞活力水平明显低于Eya1野生组(P<0.05)。Western blot结果表明,突变组Bcl-2蛋白表达水平明显低于野生组(P<0.05)。结论成功构建含Eya1S298A基因的慢病毒表达质粒,并建立稳定表达Eya1S298A的细胞株;Eya1的298位点突变降低了Eya1对MES23.5细胞的抗凋亡作用。

摘要： 通过定点随机突变技术,提高天冬氨酸代谢途径中首个关键限速酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)的催化活力,减弱或解除代谢产物对其协同反馈抑制,并通过Discovery Studio等软件对其空间结构进行分析,借助分子动力学模拟对其机制进行分析。首先选择ATP附近关键残基位点,在前期T379N/A380C/G171I突变株的基础上进行突变株构建,然后通过高通量筛选,获得酶活力显著提高的突变株T379N/A380C/G171I/S227D。动力学分析显示,V;值增至242.05 U/(mg·min),较T379N/A380C/G171I突变株(187.88 U/(mg·min))提高到1.28倍,较野生型(wild type,WT)AK(3.01 U/(mg·min))提高到80.41倍;K_(m)值减小为1.35 mmol/L,底物亲和力增大。最后通过Discovery Studio软件和分子动力学模拟分析发现,突变后体系状态稳定,与ATP的氢键占有率增加,与底物的结合稳定性增强,有利于催化反应进行。酶学性质研究表明:该突变株T379N/A380C/G171I/S227D的最适反应温度增至30°C,较WT和T379N/A380C/G171I分别提高5°C和2°C;最适pH值为8.5,较T379N/A380C/G171I(pH 9.0)减小0.5;半衰期为3.9 h,较T379N/A380C/G171I延长0.8 h;且在不同浓度抑制剂Lys、Thr和Met以及Lys+Thr、Lys+Met、Thr+Met和Lys+Thr+Met不同组合存在情况下,该突变株表现出明显的激活作用,抑制效果减弱显著,激活作用最高143.35%。

摘要： 通过蛋白质理性设计和定点突变技术,在近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶wtCpCR的基础上,构建5个突变体酶A98N、S307N、G262N、S216N和S258N,考察了有机溶剂、温度、剪切力、氧气、辅酶NADPH浓度对突变体酶的稳定性影响。研究表明,A98 N在磷酸盐(potassium phosphate,PB)缓冲溶液中比酶活力提高10%,而S307 N没有酶活力,其他3个突变体比酶活力均有降低;A98 N和G262 N在PB/甲基叔丁基醚的双相体系中界面稳定性比原始酶wtCpCR分别提高1.7和1.4倍;4个突变体酶的耐热特性略有下降,T_(50)值介于31~36°C;在100、200 r/min条件下,4个突变体耐剪切力均增强,在300 r/min条件下G262 N突变酶的耐剪切稳定性比wtCpCR增强1.3倍;G262 N突变酶在有氧条件下的稳定性更好,比野生酶提高1.4倍,半衰期(t_(1/2))达到11.87 h;辅酶浓度为0~0.4 mmol/L时,G262 N突变酶更加稳定。该研究为该羰基还原酶wtCpCR的多点突变进一步改善酶稳定性提供重要的科学依据,同时可提高该酶在双相体系生物催化工艺的经济性。

摘要： 绵羊多胎性基础母羊的经济性状有着重要的影响,目前已发现多个绵羊品种由于FecB基因座外显子7上一个A-G突变,明显增加了产羔数.本实验的利用CRISPR-Cas9与Oligo Donor DNA注射技术对绵羊FecB基因进行定点突变,以期获得FecB第7外显子A→G突变的后代,使其谷氨酰胺(Glu)突变为精氨酸(Arg),在不改变绵羊其他性状的条件下使其表现出多胎性.

摘要： 通过分析茶树咖啡碱合成途径中的N-甲基转移酶基因TCS1与ICS1、PCS1的蛋白质空间结构模型,找到了四个可能影响TCS1催化活性的关键位点进行定点突变,构建突变基因重组原核表达质粒pMAL-TMx并在表达菌株BL21(DE3)pLysS中高效表达.茶树咖啡碱合成酶TCS1的四个突变体分别是TM1:225位精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His);TM2:317位缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met);TM3:271位苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp);TM4:272位丙氨酸(Ala)突变为脯氨酸(Pro).基因TCS1 突变后,对表达的融合蛋白进行活性分析,突变体TMx 酶催化活性发生较大变化,其中TM1只具备3-N位甲基化活性,即只能催化7-MX合成可可碱;突变体TM2,TM3,TM4均能催化7-MX合成可可碱和咖啡碱,但催化能力有明显差异.

摘要： 目的：选择可能影响α毒素生物活性的氨基酸相关碱基位点进行定点突变，构建α毒素基因的突变体并在大肠杆菌中表达。方法：利用PCR定点突变技术，进行68位组氨酸→亮氨酸的定点突变，构建了含α毒素突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)。结果：α毒素突变基因287位核苷酸由A→T，经酶切鉴定和序列测定证实，构建的重组质粒pXMCPA02含有α-毒素突变基因，且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)表达产物经SDS—PAGE分析，其表达量占菌体总蛋白相对含量的33．82％。结论：已成功构建了α毒素基因突变体，并实现了在重组大肠杆菌中的表达。

摘要： 抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates,ADC)是由单克隆抗体、强效细胞毒小分子药物和链接部分(Linker)三部分共同构筑而成的一类新颖的靶向治疗药物,该类药物通过链接部分(Linker)将靶向单克隆抗体与强效细胞毒小分子通过共价键连接起来,利用单克隆抗体对肿瘤表面相关抗原或特定受体的特异性结合能力,将强效细胞毒小分子靶向输送到肿瘤细胞,提高药物在肿瘤实体的浓度,降低药物用量和对循环系统及机体其他部位的毒性,实现靶向治疗,从而极大地提高药效并减少毒副作用.

摘要： 硫还原地杆菌能够通过纤毛进行胞外电子传递,电子通过蛋白微丝进行长距离的传递,所以纤毛被称为纳米导线.但纳米导线传递电子的机理还不是很清楚.通过生物信息模拟分析,认为芳香族氨基酸在电子传递中起重要作用.为了验证氨基酸在导电纤毛电子传递中的作用,通过QUICK-CHANGE这种高效的定点突变技术,对GSU1496基因(合成纤毛的基因)末端的首个芳香族氨基酸进行了定点突变,通过突变体和野生型细菌的导电特性观察,研究特定氨基酸的功能.初步获得了该氨基酸缺失的突变体,并且对突变体的铁还原特性进行了表征.结果显示,突变体的铁还原能力较野生型明显降低,说明该氨基酸影响了导电纤毛的电子传递.

摘要： 过去研究表明,Leptin基因在糖尿病相关的血糖和脂肪代谢通路中起到重要作用,leptin突变小鼠模型被广泛用于肥胖疾病相关的药物测试.新的研究发现已有的leptin突变小鼠模型在患者临床糖尿病药物试验中,未能反映出治疗药物诱发心脏病的副作用.小型猪作为模型动物,与人类的脂肪积累方式和药物敏感度更接近.因此为了建立更适合人类肥胖症的疾病模型,本研究以小型猪为模式动物进行leptin基因敲除.本研究基于基因定点修饰的新技术,如锌指酶或TALEN技术,实现leptin基因定点突变.再通过体细胞核移植技术,建立leptin基因敲除的克隆猪,并且借鉴人类和小鼠模型的临床检测手段进行各项生理生化指标的诊断.本研究旨在建立与人类亲缘关系更近的猪肥胖疾病模型,为提供动物模型用于疾病治疗、药物筛选等医学研究奠定基础.

摘要： 杰多霉素生物合成激活子JadR1是一个OmpR家族的非典型应答调控蛋白(ARR).与典型应答调控蛋白(RR)不同,JadR1的REC结构域两个保守的天冬氨酸残基被Glu49和Ser50所取代.前期研究表明JadR1的REC结构域能够与杰多霉素后期产物(特别是JdA和JdB)特异性结合,进而调节自身对靶基因的调控强度,首次揭示ARR具有配体结合活性.为进一步探究Glu49和Ser50在JadR1配体结合以及调控过程中的地位,将Glu49和Ser50分别以及组合突变为保守的天冬氨酸即Glu49D,Ser50D和Glu49DSer50D,进一步研究其体外和体内功能.结果表明将这些点突变后的jadR1互补到jadR1突变株中时,与jadR1/pSET:jadRl比较,jadR1/pSET∷G1u49D和jadR1/pSET∷G1u49DSer50D不需乙醇刺激就可明显产生杰多霉素;而在有乙醇刺激时,jadR1/pSET∷Ser50D仍就不能够产生杰多霉素.体外EMSA实验表明Ser50D与靶基因启动子复合物构型发生了变化，但仍具有配体结合活性。G1u49D和靶基因复合物构型未改变，但是配体结合活性明显减弱。突变为保守夭冬氨酸的JadR1是否能够被磷酸化，恢复典型应答调控蛋白的特性，这些都在研究之中。

摘要： Lactobacillus fermentum CGMCC2921来源的L-阿拉伯糖异构酶(简称L-AI酶)属于嗜热型L-AI酶,具有工业化生产D-塔格糖的应用潜质.通过同源建模分析选取对该酶催化D-半乳糖生产D-塔格糖起重要作用的氨基酸位点进行突变,发现当Q16,M311,K423和Q438位点的氨基酸突变为丙氨酸时,突变酶Km值降低,其中突变酶M311A的Km值降低1倍,对D-半乳糖的转化率提高约20％。当K423位点的氨基酸残基分别突变为丙氨酸、天冬酰胺或精氨酸时,突变酶与底物的亲和力以及D-塔格糖的转化率随着423位点突变氨基酸侧链长度的增加而降低.运用计算机分子模拟技术分析表明:当M311位点氨基酸突变为丙氨酸以后,底物D-半乳糖与催化位点氨基酸残基之间的氢键作用增强,导致与底物亲和力增大,从而提高了酶活力。

摘要： CRISPR/Cas9系统源于细菌获得性免疫系统,是可对很多物种的基因组进行高效率编辑的技术,已被广泛用于定向基因编辑.本文简要介绍了CRISPR/Cas9系统的基本作用原理和技术改进的进展,重点介绍了CRISPR/Cas9系统在家蚕功能基因研究和定向遗传改造研究中的应用及成果,并展望了该技术在家蚕基因组编辑中应用的前景和主要的发展方向.

摘要： CRISPR/Cas9系统源于细菌获得性免疫系统,是可对很多物种的基因组进行高效率编辑的技术,已被广泛用于定向基因编辑.本文简要介绍了CRISPR/Cas9系统的基本作用原理和技术改进的进展,重点介绍了CRISPR/Cas9系统在家蚕功能基因研究和定向遗传改造研究中的应用及成果,并展望了该技术在家蚕基因组编辑中应用的前景和主要的发展方向.

摘要： 本申请涉及一套用于水稻基因组碱基定点替换的人工系统及定点突变方法。该人工系统包括：第I调节元件，其包括能够编码如氨基酸序列I的核苷酸序列；其中所述氨基酸序列I选自SEQ ID Nos.1‑6中的一种；第II调节元件，其包括依次从5’端到3’端的第II‑1核苷酸序列和第II‑2核苷酸序列；所述第II‑1核苷酸序列包括靶核苷酸序列，所述第II‑2核苷酸序列包括来源于化脓链球菌的sgRNA核酸序列，第II‑1核苷酸序列与第II‑2核苷酸序列转录融合，其产物能引导第I调控元件编码的蛋白至目标生物基因组中待突变的靶位点处，并将靶位点处的C诱导突变为T、A和G中的一种；或G突变为A、T和C中的一种。

摘要： 本发明公开了一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体及重组细胞，载体包括Cas9切割表达载体和打靶载体。本发明将Cas9切割表达载体和打靶载体共同转染宿主细胞，构建重组细胞株，可以作为生产转基因克隆胚胎的核移植供体细胞，抑制MSTN的功能发挥，同时实现PPARγ在骨骼肌细胞中特异性表达，进而为快速、高效研制优质转基因肉牛新品种提供支撑。

摘要： 本发明涉及定点突变和定点修饰的腺相关病毒、其制备方法及应用。具体地，本发明利用遗传密码扩展技术，将非天然氨基酸引入腺相关病毒衣壳蛋白VP1，进而得到利用非天然氨基酸定点修饰的腺相关病毒。该定点修饰的腺相关病毒在生产、转染和移动能力等方面与野生型病毒相当，为腺相关病毒的进一步研究奠定了基础。

摘要： 本发明在水泡性口炎病毒的包膜蛋白G（VSV G）基因的特定位点引入琥珀密码子TAG，利用正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA将具有光交联性质的非天然氨基酸DiZPK定点突变到VSV G的特定位点。在病毒与宿主细胞相互作用过程中，用365nm紫外光引发DiZPK的光交联反应，在VSV G与相互作用蛋白间形成共价键，避免了相互作用的解离，为病毒与宿主间蛋白相互作用的研究提供有力的手段。

摘要： 本发明涉及经过定点突变的生长激素、定点修饰的生长激素，所述生长激素可以是人源的，也可以是其它动物的。本发明还涉及定点突变和定点修饰生长激素的方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入生长激素基因中，借助非天然氨基酸与修饰剂，如聚乙二醇与生长激素定点连接。本发明进一步涉及定点突变或修饰的生长激素的应用，如作为稳定、长效生长激素等的用途。

摘要： 本申请涉及一套用于水稻基因组碱基定点替换的人工系统及定点突变方法。该人工系统包括：第I调节元件，其包括能够编码如氨基酸序列I的核苷酸序列；其中所述氨基酸序列I选自SEQ ID Nos.1‑6中的一种；第II调节元件，其包括依次从5’端到3’端的第II‑1核苷酸序列和第II‑2核苷酸序列；所述第II‑1核苷酸序列包括靶核苷酸序列，所述第II‑2核苷酸序列包括来源于化脓链球菌的sgRNA核酸序列，第II‑1核苷酸序列与第II‑2核苷酸序列转录融合，其产物能引导第I调控元件编码的蛋白至目标生物基因组中待突变的靶位点处，并将靶位点处的C诱导突变为T、A和G中的一种；或G突变为A、T和C中的一种。

摘要： 本发明公开了一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体及重组细胞，载体包括Cas9切割表达载体和打靶载体。本发明将Cas9切割表达载体和打靶载体共同转染宿主细胞，构建重组细胞株，可以作为生产转基因克隆胚胎的核移植供体细胞，抑制MSTN的功能发挥，同时实现PPARγ在骨骼肌细胞中特异性表达，进而为快速、高效研制优质转基因肉牛新品种提供支撑。

摘要： 本发明涉及定点突变和定点修饰的腺相关病毒、其制备方法及应用。具体地，本发明利用遗传密码扩展技术，将非天然氨基酸引入腺相关病毒衣壳蛋白VP1，进而得到利用非天然氨基酸定点修饰的腺相关病毒。该定点修饰的腺相关病毒在生产、转染和移动能力等方面与野生型病毒相当，为腺相关病毒的进一步研究奠定了基础。

摘要： 本发明涉及经过定点突变的生长激素、定点修饰的生长激素，所述生长激素可以是人源的，也可以是其它动物的。本发明还涉及定点突变和定点修饰生长激素的方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入生长激素基因中，借助非天然氨基酸与修饰剂，如聚乙二醇与生长激素定点连接。本发明进一步涉及定点突变或修饰的生长激素的应用，如作为稳定、长效生长激素等的用途。

摘要： 本发明在水泡性口炎病毒的包膜蛋白G（VSV G）基因的特定位点引入琥珀密码子TAG，利用正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA将具有光交联性质的非天然氨基酸DiZPK定点突变到VSV G的特定位点。在病毒与宿主细胞相互作用过程中，用365nm紫外光引发DiZPK的光交联反应，在VSV G与相互作用蛋白间形成共价键，避免了相互作用的解离，为病毒与宿主间蛋白相互作用的研究提供有力的手段。