高效表达

摘要： 普鲁兰酶(pullulanase)可催化支链淀粉、普鲁兰糖等多糖大分子中的α-1,6糖苷键水解,是最重要的淀粉酶之一。为提高普鲁兰酶发酵水平,该研究将Bacillus deramificans的普鲁兰酶表达于枯草芽胞杆菌WB600。首先考察了天然组成型、合成组成型、诱导型和自诱导型等强启动子对产酶的影响。结果显示,合成组成型P_(566)获得的普鲁兰酶活力达到58.1 U/mL,较优化前的启动子P_(43)提高96%。然后基于单因素和响应面优化确定了最佳培养基组成为:玉米浆14.8 g/L,蛋白胨7.3 g/L,葡萄糖17.5 g/L,Ca^(2+)1.2 mmol/L。在该条件下,重组普鲁兰酶活力提高至129.4 U/mL。在5 L罐中进行葡萄糖补料控制,重组菌发酵53 h后酶活力达到226.4 U/mL。研究结果为应用枯草芽胞杆菌生产普鲁兰酶提供了方法学参考。

摘要： 研究海栖热袍菌木聚糖酶B(TmXynB)的定向进化、高效表达和应用。构建突变文库后经两轮筛选,获得一个在酸性高温下具有高比活力的突变体(mTmXynB)。突变体mTmXynB的最适pH值和最适温度为5.5和90°C,较野生型的最适pH值和最适温度分别下降了0.5和10°C,对小麦阿拉伯木聚糖的比活力由529 U/mg提高至1565 U/mg。序列比对表明,mTmXynB中3个氨基酸发生突变,分别为Asn91Ser、Trp129Arg和Arg143Glu。经定点突变实验,Arg143Glu通过改变局部蛋白表面的电荷分布提高了其耐酸性,Trp129Arg通过打破疏水平台降低了酶的最适温度,而Asn91Ser可能通过改变底物结合位点Trp89的构象提高该酶的催化活力。进一步将mTmXynB表达至毕赤酵母,经高密度发酵酶活力达18000 U/mL。突变体mTmXynB和野生型TmXynB分别添加至麦芽糖化过程中,结果表明mTmXynB在150 U/g麦芽添加量时效果最好,可降低45%的过滤时间和8.7%的料液黏度。而TmXynB在600 U/g麦芽添加量时效果最好,分别降低39%和8.1%的过滤速度和料液黏度。因此,突变体mTmXynB在啤酒工业中具有很好的应用前景。

摘要： 为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶(RmMan5A)对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体(RmMan5AM2)。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65°C,较野生型甘露聚糖酶提高了10°C。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖(相对峰面积>85%),总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。

摘要： 毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优势,已被广泛应用于表达外源蛋白。但是另一方面,由于该系统受包括外源基因的特性、菌种、表达环境和发酵技术等多种因素的影响,,其在不同外源蛋白的表达上也表现出很大差异。该文着眼于分子水平上的基因转录、蛋白质加工、蛋白质降解以及转运分泌4个模块,介绍了利用毕赤酵母表达系统通过优化密码子、高拷贝数外源基因、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因、共表达促折叠因子等途径提高外源蛋白表达效率的相关策略,并简要展望了该系统的发展前景,以期为构建高效毕赤酵母细胞工厂提供指导。

摘要： 以下场景,你一定不会陌生:准备已久的方案或计划,一通宣讲后,领导不置可否,只让你再回去想想;跟同事交接工作,再三梳理流程,做的时候却出了差错;当面讲好的事情,过了几天顾客又到店里来追问,这才发现双方理解有误……这些,都是沟通出现了问题。在工作中,沟通能力非常重要。在一个企业或部门内部,团队能否发挥出高效的战斗力,很大一部分取决于“协作成本”,协作成本里,占比最大,提升空间也最大的,就是沟通效率。

摘要： 定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶(AoBgal35A),以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体(mAoBgal35A),经高密度发酵酶活力达4760 U/mL。纯化后,mAoBgal35A的最适pH和温度分别为5.0和55°C,比野生型AoBgal35A分别提高了0.5和降低了5°C。mAoBgal35A在室温下能高效水解牛奶中的乳糖,加酶量为2 U/mL时,水解72 h后牛奶中的乳糖质量浓度为0.38 g/dL,达到无乳糖牛奶标准。而野生型AoBgal35A的加酶量为20 U/mL时,在相同条件下水解后,乳糖质量浓度为0.6 g/dL。由此表明,定向进化明显提高了米曲霉β-半乳糖苷酶水解乳糖的效率,所得正向突变体在制备无乳糖乳品中具有很大的应用潜力。

摘要： 通过分子克隆技术获得了金褐霉素生物合成基因簇中新基因aurT(Genbank登录号:MH247109.1),并利用高效表达、基因敲除、高效液相色谱(HPLC)和生物信息学技术分析了aurT基因功能及其对金褐霉素生物合成的调控作用,以期为提高金褐霉素发酵产量奠定理论基础.研究结果表明:AurT属于RhtB家族调节因子,是金褐霉素生物合成的氨基酸转运蛋白;aurT基因高效表达菌株(♂aurT)的金褐霉素产量增加了1.3倍;aurT基因敲除菌株(△aurT)的金褐霉素产量减少了65％,但金褐霉素的产量没有完全被抑制,说明aurT对金褐霉素生物合成的调控过程不同于途径特异性调控基因aurJ3M.比较了4种不同的PI因子结构类似物(1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺)对金褐霉素合成的调控作用,结果表明:0.4 mL的丙三醇对金褐霉素生物合成的调节效果最佳;发酵时间达到96 h时,外源添加丙三醇后,△aurT菌株的金褐霉素产量为784μg/mL,而未添加的产量为244μg/mL;进一步通过RT-PCR反应验证在野生型菌株培养中添加丙三醇后,增加了aurT基因的转录水平和表达,说明PI因子结构类似物与基因簇中的特异性受体结合并启动了相关基因的表达,aurT是通过介导PI因子的胞外运输来参与金褐霉素的生物合成与调控的.

摘要： 针对目前国产食品级亮氨酸氨肽酶的工业生产产量不高的现状,将米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉的5 个亮氨酸氨肽酶基因(lapA、laplO、lap2、laplS、laplN)在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达,通过信号肽替换对其编码区进行改造,利用杂合启动子PnaⅡ及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,并基于规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9工具设计亮氨酸氨肽酶的基因组定点整合策略,获得高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株,重组菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力达到11701.2U/mL,比未利用CRISPR工具的LapA-T重组表达菌株的酶活力(2476.0U/mL)提高了约3.7倍.此外,通过融合6XHis标签实现了重组亮氨酸氨肽酶LapA的纯化,并对其进行了酶学性质研究:蛋白质大小约为35.0kDa,重组亮氨酸氨肽酶LapA最适pH值为8.5,最适温度为65°C.综上所述,本研究基于CRISPR策略成功实现了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重组表达.

摘要： 通过分子克隆技术获得了金褐霉素生物合成基因簇中新基因aurT(Genbank登录号:MH247109.1),并利用高效表达、基因敲除、高效液相色谱(HPLC)和生物信息学技术分析了aurT基因功能及其对金褐霉素生物合成的调控作用,以期为提高金褐霉素发酵产量奠定理论基础。研究结果表明:AurT属于RhtB家族调节因子,是金褐霉素生物合成的氨基酸转运蛋白;aurT基因高效表达菌株(♂aurT)的金褐霉素产量增加了1.3倍;aurT基因敲除菌株(ΔaurT)的金褐霉素产量减少了65%,但金褐霉素的产量没有完全被抑制,说明aurT对金褐霉素生物合成的调控过程不同于途径特异性调控基因aurJ3M。比较了4种不同的PI因子结构类似物(1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺)对金褐霉素合成的调控作用,结果表明:0.4 mL的丙三醇对金褐霉素生物合成的调节效果最佳;发酵时间达到96 h时,外源添加丙三醇后,ΔaurT菌株的金褐霉素产量为784μg/mL,而未添加的产量为244μg/mL;进一步通过R T-PCR反应验证在野生型菌株培养中添加丙三醇后,增加了aurT基因的转录水平和表达,说明PI因子结构类似物与基因簇中的特异性受体结合并启动了相关基因的表达,aurT是通过介导PI因子的胞外运输来参与金褐霉素的生物合成与调控的。

摘要： 毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)是一种甲基营养型酵母,作为外源蛋白表达的宿主系统,因其优良的功能特性,具有重要的研究价值,在工业上有广泛应用。本文结合国内外已有研究,对P.pastoris的高效发酵作用、异源蛋白高效表达以及免疫调节活性进行了论述,并对异源蛋白在P.pastoris中高效表达的多拷贝载体和启动子的调控作用的机理或物质基础进行了详细总结与归纳,最后对P.pastoris相关研究工作作出简单展望,其在发酵菌种资源开发中拥有巨大潜力。

摘要： 在5-10L规模发酵罐下,对一株高产猪α干扰素(pIFN-α)重组毕赤酵母高效表达生产pIFN-α的最优化发酵工艺进行了系统性研究。研究发现,1)使用基于人工神经网络模式识别的控制系统(ANNPR-Ctrl),可以实现重组毕赤酵母高密度培养的高效化、自动化和通用化。在细胞生长期,采用ANNPR-Ctrl控制系统流加底物,可以将整个培养期的底物浓度控制在一个较低的水平,在相同培养时间下表达猪α-干扰素和植酸酶的重组毕赤酵母细胞浓度分别比使用DO-Stat法控制时提高了81％和44％,有效地缩短了培养周期。2)传统300C甲醇诱导条件下,甲醇浓度控制在10g／t,左右的水平,O2消耗速度(OUR)高而稳定,pIFN-α抗病毒活性高,最高抗病毒活性可达到6．7x106IU／mL。3)但此工艺条件并不能保证能得到具有高pIFN-α活性的发酵产品,故障发酵是因为培养期的不适当甘油流加、导致重组毕赤酵母细胞骨架或功能不健全所致。利用多状态变量在线测量和聚类分析的方法监控底物(甘油和O2)比消耗速度与细胞比生长速度之间的关系,可以在第一时间及时地发现故障或采取措施排除故障,为高效稳定的毕赤酵母发酵生产pIFN-α工艺的形成提供了条件,pIFN-α抗病毒活性可稳定在1．0×106 IU／mL,以上,达到摇瓶发酵条件下相应活性的300倍。4)在5-10L罐上,降低诱导温度到20°C有利于改善发酵性能指标。与30°C下的同类指标相比,醇氧化酶(AOX)活性可提高50-300％,甲醇比消耗速度可增加1倍,O2比消耗速度可增加20-40％,pIFN-α表达活性可提高10-20倍,细胞对于培养／甲醇诱导环境切换的适应期从5-10 h缩短到1h。另外,200C诱导条件下,发酵系统对外部干扰、特别是甲醇过量添加的抵御能力大大提升,细胞可以耐受40．g／L以上甲醇的冲击。发酵系统在20°C下的高甲醇抗冲击能力有利于降低过程对甲醇精密测量和控制的要求,强化发酵过程的操作稳定性。5)在5L罐下,提出了低温(20°C)诱导与高溶解氧耦联控制发酵生产pIFN-α的新工艺,使用该工艺条件可以解除因供氧不足所导致的能量运转的劣化,促使pIFN-α有效表达时间延长,pIFN-α抗病毒活性最高可达3．62×107IU／mL。6)在10L罐下,利用多变量在线检测和代谢分析的手段,研究了诱导温度对碳代谢流分配与能量再生效率／速度的影响和规律,并对中大型罐下的最优和可实现的操作模式进行了初探。结果显示,降低诱导温度不但可以提高AOX活性和pIFN-α的表达水平,还可以造成胞内产能途径和目标物质合成途径的代谢流分配比例的改变,可以强化走向pIFN-α合成途径的碳代谢流通量。更加重要的是,20°C诱导条件下,产能途径中所生成的NADH可以得到有效的利用,提高了ATP再生效率,绝对ATP再生速度也增加近50％,使得毕赤酵母发酵生产外源蛋白的整体效率得到改善。7)对传统甲醇诱导和甲醇／山梨醇共混诱导下甲醛异化途径和TCA循环途径中关键酶活性进行了比较分析。结果表明,甲醇／山梨醇共混诱导使细胞能量供应途径发生了改变,甲醛异化产能途径明显被弱化,而TCA循环产能途径则被强化,从而有效缓解了细胞的能量供应压力及甲醛异化产能途径中的毒副产物甲醛对细胞的毒害作用。30°C诱导下,能量体系运转正常,10 L发酵罐下的最高pIFN-α抗病毒活性达到1．8×107IU／mL,发酵成本明显下降,提高了整体发酵性能。

摘要： 目前常用的蛋白质表达系统主要有细菌、酵母、哺乳动物细胞、动物生物反应器等,不同特性的蛋白质需要选择相应合适的表达系统.乳腺生物反应器属于动物生物反应器中的一个重要分支,用于在乳腺中生产生物活性物质的转基因动物,将具有重要价值的生物活性蛋白的基因导入动物的受精卵中培养出转基因动物,使外源基因在动物乳腺中高效表达并分泌到乳汁中,再从乳汁中提取目的基因产物.

摘要： 目的：将乙型脑炎病毒E蛋白基因克隆至pET-28a(+)表达载体，构建原核表达质粒pET-28a(+)/E，并使该基因在E.coli中高效表达，为进一步研制乙脑早期诊断试剂奠定基础。 方法：以乙型脑炎病毒疫苗株全基因序列为模板设计引物，通过RT-PCR 方法扩增目的片段，将其克隆到pMD18-T载体中，得到克隆质粒pMD18-T/E。pMD18-T/E经Xho I和EcoR I酶切，测序后连接pET-28a(+)载体，构建了重组原核表达质粒pET-28a(+)/E。转化至大肠杆菌BL21(DE3)后，利用IPTG诱导获得高效表达。 结果：扩增出了1500bp的基因片段，与预期大小一致，测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SAl4-14-2株E蛋白基因序列同源性为98％，成功克隆至表达载体pET-28a(+)并获得高效表达，表达产物分子量约为53kDa。 结论：该表达产物的稳定高效表达为乙脑的诊断试剂开发提供了依据。

摘要： 碱性木聚糖酶在造纸、纺织、能源和低聚木糖生产等行业有广泛的应用.前期工作中将Bacillus puwiilus来源的木聚糖酶基因xvnHB进行定点突变后,在毕赤酵母中进行了高效表达,得到热稳定性显著提高的突变体XynHBN188A和碱性木聚糖酶高产工程菌.

摘要： 工业酶要实现在大宗产品生产中的应用,通常需要解决酶的规模化生产(高效表达）和对应用环境的高抗逆性两个关键问题.为实现此目的,科学家们开发出了各种选育策略和选育方法.

摘要： 与其他重组蛋白生产系统相比,植物质体(叶绿体）生产系统具有独特的优势,如外源蛋白的高效表达(能高达70％的总可溶性蛋白）、可以按照操纵子形式将多个基因同时导入叶绿体中从而实现多基因共转化、由于大部分高等植物叶绿体的母系遗传特性,外源基因不会随花粉扩散而造成环境安全性问题等.

摘要： 为建立基于GP5蛋白的PRRSV中和抗体检测方法,本实验通过基因合成技术将GP5蛋白的胞外区(GP5-ecto)进行串联合成,并将该串联基因克隆到pET28a载体上,在37°C培养含重组质粒pET28a-GP5-ecto的 E.coli BL21(DE3)细胞至OD600值为0.6-1.0时,以终浓度为0.5mM的IPTG诱导4小时后,重组GP5-ecto蛋白实现了高效表达.Western blot表明GP5-ecto蛋白能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应.Ni-NTA亲和层析纯化后,间接ELISA证实1∶400倍稀释的PRRSV阳性猪血清可检测到低达0.125μg/ml的GP5-ecto蛋白,表明GP5-ecto蛋白具有良好免疫原性.IFA试验证实GP5-ecto蛋白免疫BALB/c小鼠后获得的阳性鼠血清能与天然PRRSV病毒发生特异性反应,进一步说明GP5-ecto蛋白具有良好免疫原性.本研究获得的GP5-ecto蛋白为建立检测PRRSV中和抗体的ELISA方法提供了材料.

摘要： N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)的金属水解酶，广泛存在于多种微生物中，近年来作为一种新型抗菌策略(群体感应淬灭策略)的工具酶而成为研究的热点。目前主要是通过构建转基因植物、转基因细菌研究其在群体感应淬灭中的作用机制，而转基因植物或转基因细菌在实际应用中存在生物安全和有效性方面的问题。本研究的目的是毕赤酵母高效表达N-酰基高丝氨酸内酯并将该酶以酶制剂的形式来防治水产养殖中嗜水气单胞菌引起的疾病。首先以3-oxo-C6-HSL为唯一碳源和氮源的筛选培养基通过富集培养的方法从天津武清池塘低泥分离出一株产N-酰基高丝氨酸内酯酶的菌株，经16srDNA鉴定为苏云金芽胞杆菌。通过设计该种属N-酰基高丝氨酸内酯酶的兼并引物，成功克隆了N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiAB546，aiiAB546片段大小为753 bp，编码250个氨基酸，预测编码蛋白的分子量为28.14 kDa，等电点为4.64，在蛋白的N端预测一个N糖基化位点(Asn-Ser-Thr)。将aiiAB546连接pPIC9表达载体，转化毕赤酵母GS115感受态细胞并成功表达。通过根癌农杆菌KYC 55活性平板法筛选出高效表达的13号菌株。以3-oxo-C8-HSL为底物，在摇瓶水平上该菌株表达的N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活为27.1±3.2U/mL，通过3.7L发酵罐高密度发酵，重组蛋白的表达量高达3,5584±81.3 U/Ml，而大肠杆菌表达的酶活仅为0.24 U/mL。毕赤酵母明显提高了N-酰基高丝氨酸内酯酶的表达量，实现了目的蛋白的高效表达。毕赤酵母表达的重组蛋白通过硫酸铵沉淀和阴离子柱纯化出33.6kDa的单一条带。经质谱鉴定为目的蛋白，Endo H处理验证了N糖基化的存在。纯化AiiA的最适pH和温度分别为8.0和20"C，在pH6.5-8.5范围内，酶活性均能维持在80％以上，在0°C，20°C～37°C，AiiA具有60％的酶活力。AiiA具有良好的pH和温度稳定性。在pH6.5-12.0范围内处理60min后，酶活性均高于100％，说明AiiA在中性和碱性条件下非常稳定。AiiA在60°C保温60min，酶活性基本维持不变，70°C保温15min，剩余90％以上的酶活，说明AiiA在60°C和70°C条件下仍非常稳定。AiiA具有非常好的抗胰蛋白酶，α-糜蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，胶原蛋白酶，碱性蛋白酶的能力，AiiA与上述蛋白酶共处理60min，AiiA的酶活性均大于100％。此外，大多数离子对AiiA无抑制作用。AiiA 和嗜水气单胞菌共注射锦鲤可以明显降低嗜水气单胞菌致死锦鲤的平均累积死亡率为25％，延迟了锦鲤的半数致死时间为18h。单独注射锦鲤AiiA，经长时间观察锦鲤生存状态良好。根据实验结果预测AiiA对鱼体无害并且可以降低嗜水气单胞菌致死能力，本实验为潜在机制的研究提供了重要的实验数据。本实验不仅在毕赤酵母中成功高效表达了AiiA，低成本获得大量的AiiA成为可能，而且以酶制剂的形式通过活体注射的方式成功衰减嗜水气单胞菌在锦鲤中的致死能力。根据所知，这是首次在毕赤酵母中高效表达AiiA并通过注射AiiA衰减嗜水气单胞菌的毒力。本实验具有潜在的抗菌策略研究与水产养殖应用方面的价值。

摘要： 通过人工合成猪附红细胞体MSG1基因的编码序列，提高目的基因在大肠杆菌中的高效表达。根据GenBank注册的AM407404的544-942氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子，设计并合成了12条寡核苷酸片段。用PAS方法，全基因合成MSG1部分目的基因，克隆入pjet1.2/blunt载体。经测序证实正确后，构建原核表达载体pET-28c/MSG1，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得含重组表达质粒的转化子，IPTG诱导表达，并进行SDS-PAGE分析。测序、酶切鉴定等结果表明表达栽体构建成功，诱导表达后大约在16KD的位置出现明显的蛋白条带。

摘要： 重组Tm-Bg1A水解大豆粉的应用研究表明:以脱脂大豆粉为原料，采用料水比1:3,酶用量为100 U/g，80°C下水解3h，染料木苷和丙二酰基染料木苷转化为染料木素的转化率达到95％以上，大豆黄苷和丙二酰基大豆黄苷转化为大豆黄素的转化率达到92％以上;重组Tm-BglA直接用于大豆异黄酮的热提取过程中，使原料中的大豆异黄酮搪苷边抽提边转化为大豆异黄酮苷元，改变了原有的先提取大豆异黄酮糖苷然后再将其生物转化成苷元的两步法，大大加快反应速度，提高酶水解效率，是目前大豆异黄酮提取及生物转化的最直接有效的途径。

摘要： 本发明提供了一种食蟹猴U6基因启动子macU6，包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸酸序列。本发明首次在食蟹猴基因组中获得一段与U6启动子同源的序列，即macU6启动子，且具有高效的转录能力。并将其引入到多gRNA表达载体中。本发明中采用Golden Gate克隆技术和Gateway重组克隆技术相结合的方法，构建出由不同U6启动子驱动gRNA串联表达的多gRNA表达载体，该方法简单、高效、灵活、省时。同时，通过引入新的高效的macU6启动子来解决因U6启动子种类过少、U6重复出现导致的载体不稳定问题。

摘要： 本发明公开了一种罗氏沼虾外源基因的表达质粒及其高效转录表达方法，本发明表达质粒包括顺序排列的hr5增强子、转录启动子IE1、外源目标基因和终止子；hr5增强子核苷酸序列如SEQIDNo：1所示，转录启动子IE1核苷酸序列如SEQIDNo：2所示。本发明以10ug质粒每g虾体重的量，从沼虾腹部头胸甲和躯干交界线插入微量注射器并注射上述表达质粒，每只虾注射量控制在5μL～20μL的范围内；注射外源表达质粒4～12h后，采集罗氏沼虾躯干肌肉组织，并验证外源目标基因的表达量。本发明对鉴定罗氏沼虾外源基因肌肉内的转录表达水平更高，高出目前常用启动子IE1转录水平约3倍；并且对于外源基因活体表达的方法快捷高效。

摘要： 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及利用枯草芽孢杆菌高效表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF21)基因的方法。首先，本发明通过在目的蛋白基因5’端添加不同类型的cistron顺反子序列，调节目的蛋白基因的转录和翻译效率，从而优化其可溶性表达水平，可应用于不同类型的异源蛋白优化表达。其次，本发明还优化了二硫键相关基因构建了促进rhFGF21二硫键折叠效率；过表达分子伴侣系统构建了适于rhFGF21蛋白折叠效率；敲除胞外多种蛋白酶基因构建了提高rhFGF21胞外稳定性的枯草芽孢杆菌基因工程菌株，最终提供了一种具有良好应用前景的能够高效分泌表达rhFGF21蛋白质的枯草芽孢杆菌基因工程菌株。

摘要： 涉及一种基因工程,构建了包含蓝藻热休克基因groESL强启动区、目的基因UBTα1、rbcS终止区和Km标记基因的完整的可高效表达的蓝藻基因表达系统,并运用基因整合平台系统和穿梭质粒系统进行转基因表达胸腺素α1,由于利用热休克基因groESL的强启动子,易调控,经热诱导后能几十上百倍地加快转录,同时利用泛素融合技术,使目的基因Tα1得到高效表达,本发明工艺简单,可举一反三,具有很大的开发前景,为产业化开发转基因蓝藻开辟一条新途径。

摘要： 本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种环状RNA的高效表达方法及表达载体，克隆环状RNA全长序列至环状RNA表达载体pCRE5(puromysin筛选标记)或pCRE6(copGFP筛选标记)载体；RNA抽提；逆转录；环化检测PCR体系及引物构建。本发明通过前期的实验验证，构建出能够利用细胞内的相关作用原件实现细胞内环状RNA的准确环化的过表达系统；将环状RNA形成所需的序列原件整合，能够用于多数环状RNA的表达。本发明仅需要将环状RNA的序列克隆至表达区中就能实现大部分环状RNA的表达；促进了环状RNA形成的序列均来自于人源细胞RNA序列，避免形成的RNA结构被识别为外源序列而被清除。

摘要： 本发明提供一种高效表达透明质酸水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示。本发明通过在全长透明质酸水解酶基因的N端截掉了一段自身信号肽序列，构建了高水平表达基因工程透明质酸水解酶的毕赤酵母工程菌，使用所构建的毕赤酵母工程菌高密度发酵得到的发酵液中透明质酸水解酶的酶活高达4.7×105U/mL。因此，将有利于进一步降低工业化生产山大齿猛蚁透明质酸水解酶的成本，从而扩大透明质酸酶在医药、化工及食品领域的应用范围。

摘要： 本发明提供了的一种适于大肠杆菌高效表达的IsDNA序列、制备方法、重组表达质粒及工程菌，其表达产物具有高效催化吲哚促进靛蓝形成的作用；基于马蓝植株细胞色素P450mRNA序列(GenbankID：MG857655.1)的核酸和氨基酸序列信息，经过大肠杆菌(E.coli)密码子偏好优化获得；该IsDNA序列经化学合成后，运用亚克隆技术将合成的IsDNA序列插入到质粒pET‑22b中构建重组表达质粒，将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得基因工程菌BL21(DE3)/IsDNA。该工程菌可在大肠杆菌中实现靛蓝色素生物合成，为后续应用生物合成技术实现靛蓝的工业化生产奠定基础。

摘要： 本发明公开了一种能高效表达LL‑37多肽的多拷贝重组表达载体、重组毕赤酵母、构建方法及应用，本发明以PPICZα为骨架质粒来构建重组表达载体，所述的重组表达载体PPICZα包括信号肽α因子、拷贝的LL‑37序列。多拷贝重组载体质粒是用双酶切目标片段后进行回收、沉淀和连接，得到多拷贝的质粒；同时用BamH I线性化重组质粒pPICZαA‑LL‑37；乙醇沉淀法进行纯化，把多拷贝质粒与载体相连接，再与毕赤酵母电转化为感受态细胞。通过诱导表达产生目标蛋白；利用本发明的重组酵母能够有序合成并将目标蛋白分泌到胞外，产生与人源抗菌肽LL‑37相同功能的结构多肽。经过测量抑菌圈和最小抑菌浓度，检测LL‑37的活性。本发明得到的LL‑37具有广谱抗菌性，能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

摘要： 本发明公开了一种CHO细胞高效表达体系，所述的CHO细胞中含有CAG启动子基因‑人干扰素‑α2信号肽基因‑Luc基因的真核表达载体。本发明还公开了一种所述的CHO细胞高效表达体系的筛选方法，所述的方法包括以下步骤：启动子的筛选和信号肽的筛选。本发明还公开了一种所述的CHO细胞高效表达体系在PCV2Cap蛋白表达中的应用，所述的应用是将PCV2Cap蛋白基因替换所述的真核表达载体中的Luc基因。本发明所述的CHO细胞高效表达体系使用时，直接将目的蛋白基因替换Luc基因，即可实现目的蛋白在CHO细胞中稳定高效分泌表达，且使用我们的体系在PCV2Cap蛋白的表达中的应用很成功。

摘要： 本发明涉及一种高效表达外源蛋白的大肠杆菌构建方法及其应用，其中，所述方法包括：步骤(1)BL21(DE3)lpxM基因的敲除；步骤(2)将tig基因插入步骤(1)得到的BL21(DE3)lpxM基因缺失株；(3)重组载体pET28a‑Rcodon的构建；(4)外源蛋白基因克隆至步骤(3)得到的重组载体pET28a‑Rcodon；(5)将步骤(4)所得重组载体转化步骤(2)得到的菌株；以及步骤(6)外源蛋白的收获。本发明方法使得外源蛋白高效表达，能较大肠杆菌常规表达显著提高外源蛋白的表达量，内毒素含量大大降低，且本发明方法可应用到多种外源蛋白的高效表达，可广泛适用于真核生物来源的蛋白在内的多种兽医疫苗蛋白，具有广泛的适用范围。