在糖工程化的酵母巴斯德毕赤酵母中对半乳糖同化途径的代谢工程化

摘要

描述了通常不能利用半乳糖作为碳源但根据本文的方法已被基因工程化为利用半乳糖作为单一碳源的低等真核细胞例如巴斯德毕赤酵母。细胞被基因工程化为表达包含Leloir途径的酶中的几种。具体地，细胞被基因工程化为表达半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，以及任选地半乳糖通透酶。另外，提供了用于改进在已被基因工程化为产生具有N-聚糖(其具有半乳糖残基)的糖蛋白但通常缺乏包含Leloir途径的酶的细胞中具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的产量的方法，所述方法包括用编码半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的一种或多种核酸分子转化细胞。描述的方法和宿主细胞使得同化半乳糖的能力的存在或缺乏作为用于制备重组细胞的选择方法。所述方法和宿主细胞在本文显示对于制备具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的免疫球蛋白和类似物是特别有用的。

说明书

发明背景

(1)发明领域

本发明涉及低等真核细胞，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)， 其通常不能利用半乳糖作为碳源，但通过基因工程化细胞为表达包含 Leloir途径的酶中的几种，使其能够利用半乳糖作为单一碳源。具体地， 细胞被基因工程化为表达半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半 乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，以及任选地半乳糖通透酶。另外，本发明进 一步涉及用于改进在已被基因工程化为产生具有N-聚糖(其具有半乳 糖残基)的糖蛋白但通常缺乏包含Leloir途径的酶的低等真核细胞中具 有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的产量的方法，包含用编码半乳 糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的一 个或多个核酸分子转化低等真核细胞。

(2)相关领域的描述

基于蛋白的疗法组成了药物发现的最活跃领域之一并被期望是未 来十年新的治疗用化合物的主要来源(Walsh，Nat.Biotechnol.18(8)： 831-3(2000))。治疗用蛋白(在它们的天然状态未被糖基化)可在缺乏 糖基化机制的宿主中表达，例如埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)。 但是，大多数治疗用蛋白是糖蛋白，其需要在蛋白的特定天冬酰胺残基 翻译后添加聚糖，以确保正确的折叠和随后在人血清中的稳定性 (Helenius和Aebi，Science 291：2364-9(2001))。在一些情况中，治疗用蛋 白的效力已通过在另外的糖基化位点中的工程化而被改进。一个实例是 人红细胞生成素，其添加另外两个糖基化位点后已表明在体内显示三倍 长的半衰期(Macdougall等人，J.Am.Soc.Nephrol.10：2392-2395 (1999))。意在人中用于治疗用途的大多数糖蛋白需要N-糖基化，因此， 哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其具有类似的人糖蛋 白加工，目前最常用于生产治疗用糖蛋白。但是，这些细胞系具有明显 的缺点，包括较差的基因溯源性、较长的发酵时间、异源糖基化和正在 发生的病毒污染问题(Birch和Racher，Adv.药物Deliv.Rev.58：671-85 (2006)；Kalyanpur，Mol.Biotechnol.22：87-98(2002))。

许多工业蛋白表达系统基于可在化学上成分确定的培养基中生长 至高细胞密度且通常不受上述限制的酵母菌株(Cereghino和Cregg  FEMS Microbiol.Rev.24：45-66(2000)；Hollenberg和Gellisen，Curr.Opin. Biotechnol.8：554-560(1997)；Muller，酵母14：1267-1283(1998)。尽管 酵母已被用于生产缺乏糖基化的治疗用蛋白，例如胰岛素，但是其仍未 被用于糖蛋白生产，因为酵母产生具有非人的、高甘露糖型N-聚糖的糖 蛋白(参见图1)，其产生具有缩短的体内半衰期并在高等哺乳动物中具 有免疫原潜能的糖蛋白(Tanner等人，Biochim.Biophys.Acta.906：81-99 (1987))。

为解决这些问题，本发明人和其他研究者已聚焦到各种不同酵母和 丝状真菌中糖基化途径的再工程化，以从这些蛋白表达宿主中获得人样 糖蛋白。例如，Gerngross等人，美国公开的申请号2004/0018590(所述 公开内容在此通过参考并入本文)提供酵母巴斯德毕赤酵母的细胞，其 已被基因工程化为消除酵母和丝状真菌典型的高甘露糖-型N-聚糖的产 生和提供具有糖基化机制的宿主细胞以产生具有杂合或复合N-聚糖的 糖蛋白，即哺乳动物细胞产生的更典型的糖蛋白。

Gerngross等人如上公开了重组酵母菌株，该重组酵母菌株可生产其 上高百分比的N-聚糖含有半乳糖残基的重组糖蛋白：即，产生主要具有 寡糖结构GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G1)或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G2)和较少量寡糖结构GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G0)的N-聚糖的酵母菌 株。已获得70-85％的G2产率。但是，已发现在这些细胞中生产的一 些糖蛋白例如免疫球蛋白和免疫粘附素，其中G0∶G1/G2的比值降低至 约2∶1(参见例如，Li等人，Nature Biotechnol.24：210-215(2006)，其中 通过用半乳糖和可溶型β-1，4-半乳糖基转移酶体外处理糖蛋白，这些细 胞中半乳糖末端的N-聚糖的产率得到改进)。相反，哺乳动物细胞例如 CHO细胞中生产的免疫球蛋白的G0∶G1/G2的比值约1∶1。因此，期望 的是提供能够在体内产生G0∶G1/G2比值小于2∶1的重组糖蛋白的重组 酵母宿主细胞。

巴斯德毕赤酵母仅可利用有限数量的碳源以生存。目前，这些碳 源是甘油、葡萄糖、甲醇以及可能是鼠李糖和甘露糖，但不是半乳糖。 期望的是具有可利用上述所列以外的碳源的巴斯德毕赤酵母菌株。

发明概述

本发明解决了上述确定的问题。本发明提供方法和材料用于从缺 乏同化半乳糖作为碳源的能力的宿主细胞产生具有利用半乳糖作为能 源的能力的重组宿主细胞。当重组宿主细胞被进一步基因工程化为生 产具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白时，该宿主细胞能 够产生重组糖蛋白例如抗体，其中G0∶G1/G2比值小于2∶1、或G0∶G1/G2 比值为1∶1或更小或G0∶G1/G2比值为1∶2或更小。一般而言，所述包括 将编码Leloir途径酶(半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳 糖-1-磷酸尿苷酰转移酶以及任选地半乳糖通透酶)引入宿主细胞核酸分 子。因此，本文中的方法和材料提供选择系统，其仅通过在含有半乳 糖作为碳源的培养基上培养细胞可用于鉴定已被转化宿主细胞，以及提 供用于生产糖蛋白(具有高水平的末端的或含有半乳糖的N-聚糖)例如 免疫球蛋白的方法。

利用半乳糖作为碳源的能力提供了选择使用的表达系统的灵活性 和经济性。例如，在设计用于表达具有末端半乳糖或末端唾液酸化的重 组糖蛋白的系统中，可将半乳糖添加至培养基，半乳糖被细胞吸收和被 细胞利用作为能源并提供半乳糖残基用于参入N-聚糖，其在重组糖蛋白 上被合成。本发明的优势是通过使半乳糖存在于培养基或在发酵过程中 添加半乳糖和/或诱导重组糖蛋白，重组蛋白的生产可得到高水平的半乳 糖基化的或唾液酸化的糖蛋白。因此，如巴斯德毕赤酵母所表明的，通 常缺乏Leloir途径的酵母物种，以本文公开的方式基因工程化巴斯德毕 赤酵母产生可利用半乳糖作为单一碳源的重组巴斯德毕赤酵母细胞系。 另外，基因工程化巴斯德毕赤酵母细胞系(包括Leloir途径酶和使得细 胞能够产生具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白所需的 酶)产生了这样的重组细胞系，其中半乳糖末端的或含有半乳糖的N- 聚糖的产率大于缺乏Leloir途径酶的细胞系。因此，本发明引起了已被 基因工程化为生产半乳糖基化的或唾液酸化的糖蛋白的巴斯德毕赤酵 母细胞系的增加的生产率。

具体地，本发明提供了用于在体内生产具有高水平半乳糖或唾液酸 的抗体的方法和材料。利用本发明的方法和材料，将半乳糖添加至细胞 生长培养基以完成多个目的，包括(a)能够利用半乳糖作为糖源的宿主 细胞的选择；(b)提供用于宿主细胞生长的碳源和(c)提供用于参入N- 聚糖的半乳糖残基来源，其作为N-聚糖中的末端半乳糖残基或提供底物 用于末端唾液酸残基随后添加至N-聚糖。因此，本发明提供方法和材料， 通过该方法和材料，可通过体内过程而不是使用更低效和更昂贵的体外 反应使半乳糖基化的水平增加，在体外反应中，带电的半乳糖和可溶性 半乳糖基转移酶被添加至含有纯化的但部分半乳糖基化的重组糖蛋白 的培养基或溶液中。

本发明的一个实施方案是发展能够在半乳糖作为单一碳能源存在 的培养基上生存的巴斯德毕赤酵母宿主细胞。利用本发明的方法和材 料，本领域普通技术人员将能够从本文公开的利用半乳糖作为碳源的转 化的宿主细胞生产重组糖蛋白用于选择和维持转化的宿主细胞。另外， 当宿主细胞已被基因工程化为产生半乳糖基化的或唾液酸化的N-聚糖 时，通过提供具有半乳糖的细胞培养基，本发明可用于增加从细胞产生 的半乳糖基化的或唾液酸化的糖蛋白的水平。

因此，提供巴斯德毕赤酵母宿主细胞，其已被基因工程化为表达半 乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向异构酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰 转移酶活性，以及任选地半乳糖通透酶活性，其中所述宿主细胞能够利 用半乳糖作为单一碳能源。

在具体方面，巴斯德毕赤酵母宿主细胞已被进一步基因工程化为能 够产生这样的重组糖蛋白，其具有包含半乳糖残基的杂合或复合N-聚 糖。在具体实施方案中，UDP-半乳糖-4-差向异构酶活性被提供在融合 蛋白中，所述融合蛋白包含半乳糖基转移酶的催化结构域和UDP-半乳 糖-4-差向异构酶的催化结构域。

一般而言，宿主细胞能够产生具有复合N-聚糖的糖蛋白，其中复合 N-聚糖的G0∶G1/G2比值小于2∶1。

在具体实施方案中，上述细胞产生的糖蛋白主要具有选自 GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、 GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂和NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的 N-聚糖。

在另外的实施方案中，N-聚糖是半乳糖末端的N-聚糖，其选自 GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂和 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。在其他实施方案中，N-聚糖是半乳糖末端的 杂合N-聚糖；以及在另外的实施方案中，N-聚糖是唾液酸化的N-聚糖， 其选自NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂和NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。

另外提供的是在巴斯德毕赤酵母宿主中生产具有N-聚糖的重组糖 蛋白的方法，所述N-聚糖具有半乳糖残基，所述方法包括：a)提供重 组宿主细胞，其已被基因工程化为表达(i)糖基化途径，其使得所述宿 主细胞能够产生重组糖蛋白，所述重组糖蛋白具有包含半乳糖残基的杂 合或复合N-聚糖；(ii)半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向异构酶活 性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖通透酶活性；和 (iii)重组糖蛋白；和b)在含有半乳糖的培养基中培养所述宿主细胞以 产生具有一个或多个N-聚糖的重组糖蛋白，所述N-聚糖具有半乳糖残 基。

在所述方法的进一步的方面，UDP-半乳糖-4-差向异构酶活性被提 供在融合蛋白中，所述融合蛋白包含半乳糖基转移酶的催化结构域和 UDP-半乳糖-4-差向异构酶的催化结构域。

本发明另外提供选择表达异源蛋白的重组宿主细胞的方法。用编码 异源蛋白和不存在于重组宿主细胞的Leloir途径酶的一个或多个核酸分 子转化表达一种或两种但不是全部的Leloir途径酶活性的重组宿主细 胞。由于转化的重组宿主细胞含有完整的Leloir途径，从非转化的细胞 中选择表达异源蛋白的转化的重组宿主细胞可通过在半乳糖是单一碳 源的培养基中培养转化的重组宿主细胞获得。因此，另外提供的是产 生表达异源蛋白的重组宿主细胞的方法，其包括：(a)提供已被基因工 程化为表达一种或两种酶的宿主细胞，所述酶选自半乳糖激酶、UDP- 半乳糖-4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶；(b)用编码异源蛋 白和在步骤(a)的宿主细胞中不表达的选自步骤(a)的酶或多种酶的一个 或多个核酸分子转化所述宿主细胞；和(c)在含有半乳糖作为单一碳能 源的培养基中培养所述宿主细胞以提供表达异源蛋白的重组巴斯德毕 赤酵母宿主细胞。在所述方法的进一步的方面，宿主细胞被基因工程化 为表达半乳糖通透酶。在还进一步的方面，宿主细胞被基因修饰以产生 糖蛋白，所述糖蛋白具有一个或多个包含半乳糖的N-聚糖。

另外提供的是产生和选择能够利用半乳糖作为单一碳源的巴斯德 毕赤酵母宿主细胞的方法，所述方法包括：a)提供巴斯德毕赤酵母宿主 细胞；b)用编码半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向异构酶活性、半 乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖通透酶的一个或多个 核酸分子转化所述宿主细胞；c)在含有半乳糖作为单一碳源的培养基上 培养转化的宿主细胞；和d)选择可以在含有半乳糖作为单一碳源的培 养基上生长的宿主细胞。

本文中的宿主细胞和方法能够生产包含重组糖蛋白的组合物，其中 在药学上可接受的载体中重组糖蛋白上的G0∶G1/G2糖形的比值小于 2∶1。在具体实施方案中，重组糖蛋白选自红细胞生成素(EPO)，细胞因 子例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ和干扰素ω，和粒细胞集落刺激因 子(GCSF)，GM-CSF，凝固因子例如因子VIII、因子IX和人蛋白C， 抗凝血酶III，凝血酶，可溶性IgE受体α-链，免疫球蛋白例如IgG、IgG 片段、IgG融合体和IgM，免疫粘附素和其它Fc融合蛋白例如可溶性 TNF受体-Fc融合蛋白，RAGE-Fc融合蛋白，白细胞介素，尿激酶， 糜蛋白酶和尿胰蛋白酶抑制剂，IGF-结合蛋白，表皮生长因子，生长激 素释放因子，膜联蛋白V融合蛋白，制管张素，血管内皮生长因子-2， 骨髓样前体抑制因子-1，骨保护蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，甲胎蛋白，DNA 酶II，人纤溶酶原的三环3，葡糖脑苷脂酶，TNF结合蛋白1，促卵泡 激素，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-Ig，跨膜激活剂和钙调节剂和 亲环蛋白配体，胰高血糖素样蛋白1和IL-2受体激动剂。

在另外的实施方案中，糖蛋白是抗体，具体是人源化的、嵌合或人 抗体。在具体实施方案中，抗体选自抗-Her2抗体、抗-RSV(呼吸道合 胞病毒)抗体、抗-TNFα抗体、抗-VEGF抗体、抗-CD3受体抗体、抗 -CD41 7E3抗体、抗-CD25抗体、抗-CD52抗体、抗-CD33抗体、抗 -IgE抗体、抗-CD11a抗体、抗-EGF受体抗体和抗-CD20抗体及其变 体。抗体的实例包括莫罗单抗-CD3、阿昔单抗、利妥昔单抗、达珠单抗、 巴利昔单抗、帕利珠单抗、英利昔单抗、曲妥珠单抗、吉姆单抗奥佐米 星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗-131I、 依法利珠单抗、西妥昔单抗、戈利木单抗和贝伐单抗。

在还进一步的实施方案中，糖蛋白是Fc融合蛋白，例如依那西普。

尽管巴斯德毕赤酵母证实作为如本文所公开的可被修饰的宿主细 胞的实例，但是方法和宿主细胞不限于巴斯德毕赤酵母。本文的方法可 用于产生来自其他低等真核细胞物种的重组宿主细胞，所述物种通常不 表达Leloir途径酶并如此不能利用半乳糖作为碳源。因此，在另外的实 施方案中，宿主细胞是通常不表达Leloir途径酶的任何低等真核细胞物 种。

定义

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学具有与本发明所属领 域的普通技术人员通常理解的相同含义。另外，除非上下文另有要求， 单数术语应包括复数和复数术语应包括单数。通常地，所用的相关命名 和本文所述的生化、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及 蛋白和核酸化学以及杂交技术是本领域熟知并通常使用的。本发明的方 法和技术通常根据本领域熟知的常规方法并如贯穿本说明书引用和讨 论的各种一般和更具体的参考中所述的进行，除非另有说明。参见，例 如，Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold  Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing  Associates(1992，和Supplements to 2002)；Harlow和Lane，Antibodies：A  Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring  Harbor，N.Y.(1990)；Taylor和Drickamer，Inrroduction to Glycobiology， Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington  Biochemical Corp.，Freehold，NJ；Handbook of Biochemistry：Section A  Proteins，Vol I，CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A  Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring  Harbor Laboratory Press(1999)。示例性方法和材料如下述，虽然与本文 所述类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实践并应对本领域普 通技术人员是显而易见的。本文提及的所有公开和其他参考通过参考对 于它们引用的公开内容而被整体引入。在矛盾的情况下，以本说明书(包 括定义)为准。材料、方法和实施例仅是说明性的，且意图不是以任 何方式限制。

以下术语，除非另有说明，应理解具有以下含有：

如本文所用，术语“人源化的”、“人源化”和“人样”可互换地使用， 是指以一种方式工程化非人细胞例如低等真核宿主细胞的方法，其中该 方式引起工程化的细胞具有产生蛋白特别是糖蛋白的能力，所述糖蛋白 具有糖基化，比相同物种的非工程化的、野生型非人细胞产生的糖蛋 白具有更类似哺乳动物糖基化的模式。人源化可对于N-糖基化、O-糖基 化或二者进行。例如，野生型巴斯德毕赤酵母和其它低等真核细胞通常 在N-糖基化位点产生高甘露糖基化的蛋白。在本发明优选的实施方案 中，本发明的“人源化的”宿主细胞能够产生具有杂合和/或复合N-聚 糖的糖蛋白；即“人样N-糖基化”。人源化的宿主细胞产生的糖蛋白上 主要存在的特定“人样”聚糖将取决于进行的特定人源化步骤。

如本文所用，术语“N-聚糖”和“糖形”可互换地使用和是指N-连接 的寡糖，例如，通过天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺连接而连接到多肽的天冬 酰胺残基的寡糖。N-连接的糖蛋白含有连接到蛋白中天冬酰胺残基的 酰胺氮上的N-乙酰基葡糖胺残基。糖蛋白上发现的主要糖是葡萄糖、半 乳糖、甘露糖、果糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡糖胺 (GlcNAc)和唾液酸(例如N-乙酰基-神经氨酸(NANA))。对于N-连接的 糖蛋白，糖基团的加工在ER的腔中与翻译同时发生并在高尔基体中继 续。

N-聚糖具有共同的五糖核心Man₃GlcNAc₂(“Man”是指甘露糖； “Glc”是指葡萄糖和“NAc”是指N-乙酰基、GlcNAc是指N-乙酰基葡 糖胺)。根据分支(触角)的数量，N-聚糖不同，所述分支(触角)包含被 添加至Man₃GlcNAc₂(“Man3”)核心结构(还称为“三甘露糖核心”、“五 糖核心”或“少甘露糖核心”)的外周糖(例如GlcNAc、半乳糖、果糖和 唾液酸)。N-聚糖根据它们分支的成分(例如高甘露糖、复合或杂合)而 分类。“高甘露糖”型N-聚糖具有5个或更多个甘露糖残基。“复合”型 N-聚糖通常具有至少一个连接至1，3甘露糖臂的GlcNAc和至少一个连 接至“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂的GlcNAc。复合N-聚糖也可具有 半乳糖(“Gal”)或N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)残基，其任选地用唾液 酸或衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸和 “Ac”是指乙酰基)修饰。复合N-聚糖也可具有链内置换，其包含“等分 的”GlcNAc和核心果糖(“Fuc”)。复合N-聚糖也可在“三甘露糖核心” 上具有多个触角，通常称为“多触角聚糖”。“杂合”N-聚糖在三甘露糖 核心的1，3甘露糖臂末端具有至少一个GlcNAc并在三甘露糖核心的1，6 甘露糖臂上具有0或多个甘露糖。多种N-聚糖也称为“糖形”。图2显示 多种高甘露糖、杂合和复合N-聚糖，其已在基因工程化为产生哺乳动物 样N-聚糖的巴斯德毕赤酵母中产生。

如本文所用，术语“O-聚糖”和“糖形”可互换地使用和是指O-连接 的寡糖，例如，经由丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接至肽链的聚糖.在 真菌细胞中，天然O-糖基化通过将在内质网中从多萜醇单磷酸甘露糖 (Dol-P-Man)转移的第一个甘露糖基残基连接到蛋白而发生，和另外的甘 露糖基残基可在高尔基体中经由从GPD-Man转移而被连接。高等真核 细胞，例如人或哺乳动物细胞，通过将N-乙酰基-半乳糖胺(GlcNac)共 价连接到丝氨酸或苏氨酸残基经历O-糖基化。

如本文所用，术语“人样O-糖基化”应理解为含义是真菌-特定的磷 酸化甘露糖结构被降低或消除，引起电荷和β-甘露糖结构的降低或消 除，或糖蛋白上存在的和糖蛋白组合物中的主要O-聚糖种类包括具有选 自GlcNac、Gal或NANA(或Sia)的末端残基加帽的聚糖。以这种方式， 具有主要人样O-糖基化的重组糖蛋白可被人或哺乳动物细胞识别，如同 它是天然产生的糖蛋白，其产生重组糖蛋白的改进的治疗用性质。

本文所用的缩写是本领域常见使用的，参见，例如，上述糖的缩写。 其他常见缩写包括“PNGase”或“聚糖酶”或“葡糖苷酶”均是指肽N-糖苷 酶F(EC 3.2.2.18)。

如本文所用，术语“抗体”、“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白分子”可互 换地使用。每个免疫球蛋白分子具有独特结构，使得其结合它的特异性 抗原，但所有免疫球蛋白具有本文所述的相同整体结构。基础的免疫球 蛋白结构单元已知包括亚基的四聚体。每个四聚体具有两对相同的多 肽链，每对具有一个“轻”链(LC)(约25kDa)和一个“重”链(HC)(约 50-70kDa)。每个链的氨基-末端部分包括约100-110或更多个氨基酸的 可变区，主要负责抗原识别。每个链的羧基-末端部分确定恒定区，主要 负责效应物功能。轻链(LCs)被分类为κ或λ。重链(HCs)分类为γ、 μ、α、δ或ε和确定抗体同种型分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

轻和重链被亚分类为可变区和恒定区(通常参见Fundamental  Immunology(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.，1989)，Ch.7。每个 轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，天然抗体具有两个结合位 点。除了双功能或双特异抗体，两个结合位点是相同。链都显示相同的 通常结构，被三个高度可变区连接的相对保守构架区(FR)，还称为互补 决定区或CDR。来自每对的两个链的CDR通过构架区连接，使得结合 特异性表位。术语包括天然形成形式、以及片段和衍生物。包括在术语 范围内的是免疫球蛋白(Igs)的种类，称为IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。 还包括在术语范围内的是IgG的亚型，称为IgG1、IgG2、gG3和IgG4。 术语用于最广泛的含义并包括单个单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗 体)以及结合多个表位或抗原的抗体组合物。术语特定地覆盖单克隆抗 体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异抗体(例如双特异抗体) 和抗体片段，只要它们含有或被修饰为含有重链免疫球蛋白恒定区的 C_H2结构域的至少一部分，其包括C_H2结构域的N-连接的糖基化位点 或其变体。包括在术语内的是仅包含Fc区的分子，例如免疫黏附素 (美国公开的专利申请号20040136986)、Fc融合和抗体样分子。可选地， 这些术语可以是指至少Fab区的抗体片段，其至少含有N-连接的糖基 化位点。

术语“Fc”片段是指抗体的“片段结晶的”C-末端区，其含有C_H2 和C_H3结构域。术语“Fab”片段是指抗体的“片段抗原结合”区，其含 有V_H、C_H1、V_L和C_L结构域。

如本文所用术语“单克隆抗体”(mAb)是指获自基本上均一的抗体 群体的抗体，即包含群体是相同的单独的抗体，除了可以小量存在的可 能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，是针对单个抗原性位 点。另外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克 隆)抗体制备物相反，每个mAb针对抗原上的单个决定簇。除了它们特 异性，单克隆抗体是有利的，原因在于它们可以是通过杂交瘤培养合成 的，不被其他免疫球蛋白污染。术语“单克隆”指示抗体的特征为获自基 本上均一的抗体群体，并且不解释为要求通过任何具体方法产生抗体。 例如，根据本发明使用的单克隆抗体可由Kohler等人，(1975)Nature，256： 495首次描述的杂交瘤方法制备或可通过重组DNA方法制备(参见， 例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。

在术语“抗体”或“免疫球蛋白”范围内的术语“片段”包括those通 过用多种蛋白酶消化产生的、通过化学切割和/或化学解离产生的和重组 地产生的片段，只要片段保持能够特异性结合靶分子。在这类片段中的 是Fc、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2和单链Fv(scFv)片段。下文中，术语“免 疫球蛋白”也包括术语“片段”。

免疫球蛋白另外包括免疫球蛋白或片段，其在序列上已被修饰但保 持能够特异性结合靶分子，包括：物种间嵌合和人源化的抗体；抗体融 合；异聚体抗体复合物和抗体融合，例如双抗体(双特异抗体)，单链双抗 体和胞内抗体(参见，例如，Intracellular Antibodies：Research and Disease  Applications，(Marasco，ed.，Springer-Verlag New York，Inc.，1998)。

术语“催化抗体”是指能够催化生化反应的免疫球蛋白分子。催化 抗体是本领域熟知的并已被描述在Schochetman等人的美国专利号 7,205,136；4,888,281和5,037,750，以及Barbas，III等人的美国专利号 5,733,757；5,985,626和6,368,839中。

如本文所用术语“载体”意图是指能够转运已被连接的另一个核酸 的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，在 其中另外的DNA片段可被连接。其他载体包括黏粒、细菌人工染色体 (BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一种类型的载体是病毒载体，其中 另外的DNA片段可连接至病毒基因组(如下更详细讨论)。某些载体能 够在它们被引入的宿主细胞中自我复制(例如，载体具有在宿主细胞中 发挥作用的复制起点)。其他载体在引入宿主细胞后可以被整合到宿主细 胞的基因组，以及从而随宿主基因组一起复制。另外，某些优选的载 体能够引导被可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文称为“重组 表达载体”(或简称“表达载体”)。

如本文所用，术语“目的序列”或“目的基因”是指核酸序列，通常编 码蛋白，其通常不能在宿主细胞中产生。本文公开的方法使得稳定整合 到宿主细胞基因组中的一个或多个目的序列或目的基因的有效表达。目 的序列的非限制实例包括编码一个或多个具有酶促活性的多肽的序列， 例如，所述酶为在宿主中影响N-聚糖合成酶，例如甘露糖基转移酶、 N-乙酰基葡糖胺转移酶、UDP-N-乙酰基葡糖胺转运蛋白、半乳糖基转移 酶、UDP-N-乙酰基半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶。

术语“标记序列”或“标记基因”是指这样的核酸序列，其能够表达使 得对于在宿主细胞存在或缺乏序列进行阳性或阴性选择的活性。例如， 巴斯德毕赤酵母URA5基因是标记基因，因为它的存在可以是通过含有 基因的细胞在尿嘧啶缺乏下生长的能力而被选择。它的存在还可通过含 有基因的细胞不能在5-FOA存在下生长而被选择。标记序列或基因不必 需地显示阳性和阴性可选择性。来自巴斯德毕赤酵母的标记序列或基因 的非限制实例包括ADE1、ARG4、HIS4和URA3。对于抗生素抗性标 记基因，通常利用卡那霉素、新霉素、遗传霉素(或G418)、巴龙霉素 和潮霉素抗性基因以允许在这些抗生素存在下生长。

术语“可操作地连接”表达控制序列是指这样的连接，其中表达控 制序列与目的基因是连续的以控制目的基因以及表达控制序列，其以反 式或以一定距离发挥作用以控制目的基因。

术语“表达控制序列”或“调节序列”可互换地使用和如本文所用是 指多核苷酸序列，其对影响被可操作地连接的编码序列的表达是必需 的。表达控制序列是控制转录、转录后事件和核酸序列翻译的序列。表 达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效 RNA加工信号例如剪切和多聚腺苷酸信号；稳定细胞质mRNA的序列； 增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白稳定性的序列 和当期望时，增强蛋白分泌的序列。这类控制序列的性质根据宿主生物 而不同；在原核生物中，这类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位 点和转录终止序列。术语“控制序列”意图最小程度地包括其存在对表 达是必要的所有成分，还可包括其存在是有利的另外的成分，例如，引 导序列和融合配偶体序列。

如本文所用，术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”，“表达宿主系 统”，“表达系统”或简称″宿主细胞″)意图是指重组载体已被引入其中的 细胞。应理解的是这类术语意图不仅是指具体对象细胞，而且是指这 类细胞的后代。因为某些修饰可在后代中发生，原因在于突变或环境影 响，这类后代实际上可以与母本细胞不相同，但仍包括在本文所用的术 语“宿主细胞”范围内。重组宿主细胞可以是分离的细胞或在培养物中 生长的细胞系或可以是存在于活体组织或生物中的细胞。

术语“真核”是指有核细胞或生物并包括昆虫细胞、植物细胞、哺 乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞.

术语“低等真核细胞”包括酵母、真菌、领鞭毛虫、微孢子虫、 alveolates(例如腰鞭毛虫)、原生藻(例如褐色藻类、原生动物)、红 藻(例如红藻(red algae))、植物(例如绿藻、植物细胞、苔藓)和 其它原生生物。酵母和丝状真菌包括但不限于：巴斯德毕赤酵母、芬兰 毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、 Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤 酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、 Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、 皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤 酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属的种(Pichia sp.)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、酵母菌属的种(Saccharomyces sp.)、多形汉 逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属的种(Kluyveromyces sp.)、 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium  lucknowense、镰孢菌属的种(Fusarium sp.)、禾谷镰孢菌(Fusarium  gramineum)、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens和粗糙脉胞菌 (Neurospora crassa)。

本文所用术语“肽”指短的多肽，例如通常少于约50个氨基酸长 度且更通常少于约30个氨基酸长度的多肽。如本文所用的术语包括类 似物和模拟结构并因此模拟生物学功能的模拟物。

术语“多肽”包括天然形成的和非天然形成的蛋白及其片段、突变 体、衍生物和类似物。多肽可单体的或多聚体的。另外，多肽可包括多 个不同结构域，其中各个具有一种或多种独特的活性。

术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是这样的蛋白或多肽，由于其衍 生的起源或来源(1不与在其天然状态中伴随它的天然结合的成分结合， (2)在自然界中未发现以纯化物存在，其中可以就其它细胞成份而论判断 纯化物(例如，不含来自同一物种的其它蛋白质)，(3)由来自不同物种的 细胞表达，或(4)在自然界中不存在(例如，它是在自然界中发现的多肽 的片段或它包括在自然界中没有发现的氨基酸类似物或衍生物或不是 标准肽键的连接)的蛋白质或多肽。因此，化学合成的多肽或在与多肽所 来源的细胞体系不同的细胞体系中合成的多肽将从其天然结合的成分 中“分离”。也可以使用本领域熟知的蛋白纯化技术，通过分离，使多 肽或蛋白质基本上不含或纯化天然结合的成分。如这样所定义的，“分 离的”不必要求这样描述的蛋白质、多肽、肽或寡肽已经从其自然环境 中物理地移出。

本文所用术语“多肽片段”是指具有缺失，例如，与全长多肽比较 的氨基端和/或羧基端缺失的多肽。在优选的实施方案中，多肽片段是连 续序列，其中片段的氨基酸序列与在天然存在的序列中的相应位置同 一。片段的长度典型地为至少5、6、7、8、9或10个氨基酸，优选至少 12、14、16或18个氨基酸，更优选至少20个氨基酸，更优选至少25、30、 35、40或45个氨基酸，甚至更优选至少50或60个氨基酸，和甚至更优选 至少70个氨基酸。

修饰的衍生物”指在一级结构序列中基本上同源的，但包括，例如， 在体内的或在体外的化学修饰和生物化学修饰的、或掺入在天然多肽中 没有发现的氨基酸的多肽或其片段。这样的修饰包括，例如，乙酰化、 羧化、磷酰化、糖基化、泛素化、标记例如用放射性核素、和各种酶的 修饰，如将容易被本领域的技术人员所了解的。标记多肽的多种方法和 用于此目的的多种取代物或标记物为本领域所熟知，并包括放射性同位 素例如¹²⁵I、³²P、³⁵S、和³H，结合至标记的抗配体(例如，抗体)的配体， 荧光团，化学发光剂，酶，和可以用作标记的配体的特异性结合配对成 员的抗配体。标记物的选择依赖于所需要的灵敏度、与引物结合的容易 程度、稳定性要求、和可利用的仪器。用于标记多肽的方法为本领域所 熟知。见，例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing Associates(1992，和2002的增刊)(通过引用并入本文 中)。

术语“嵌合基因”或“嵌合核苷酸序列”是指核苷酸序列，其包含偶联 到异源核苷酸序列的核苷酸序列或片段。嵌合序列用于融合蛋白的表 达。嵌合基因或嵌合核苷酸序列也可包括一个或多个片段或结构域，其 对于意图的宿主细胞是异源的，并且可具有产生异源重组蛋白的优势性 质。通常，嵌合核苷酸序列包括来自基因的至少30个连续核苷酸，更优 选至少60或90或更多个核苷酸。嵌合核苷酸序列在本发明中具有特别 用途，所述嵌合核苷酸序列具有至少一个对于意图的宿主细胞是异源的 但与意图的重组蛋白同源的片段或结构域。例如，意图用于在利用巴斯 德毕赤酵母宿主细胞以表达重组人糖蛋白的表达系统中的嵌合基因应 优选具有至少一个片段或结构域，其是人来源的，例如编码具有潜在 治疗用价值的人蛋白的序列，而嵌合基因的其余部分，例如应使得宿 主细胞处理并表达嵌合基因的调节序列，应优选是巴斯德毕赤酵母来源 的。如果期望的，人来源的片段也可以是对于在宿主细胞中表达是密码 子最优化的。(参见，例如，美国专利6,884,602，在此通过引用并入)。

术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是指包含与异源氨基酸序列偶联的 多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因为它们可以被构建以包含来 自两种或更多种不同蛋白的两个或多个所需功能元件。融合蛋白包含来 自目的多肽的至少10个连续氨基酸，优选至少20或30个氨基酸，甚 至更优选至少40、50或60个氨基酸，还更优选至少75、100或125个 氨基酸。包括整个本发明蛋白的融合具有特殊的效用。包含于本发明融 合蛋白内的异源多肽的长度为至少6个氨基酸，通常至少8个氨基酸， 和有用地为至少15、20、和25个氨基酸。融合体还包括较大的多肽、 或甚至整个蛋白质，例如绿色荧光蛋白(“GFP”)，具有特殊效用的含 发色团的蛋白质。可以通过将编码多肽或其片段的核酸序列在框内与编 码不同蛋白质或多肽的核酸序列一起构建，然后表达融合蛋白，来重组 产生融合蛋白。或者，可以通过交联多肽或其片段至另一蛋白质，来以 化学方法产生融合蛋白。

术语“非肽类似物”是指具有与那些参考多肽类似的性质的化合 物。非肽化合物也可以称为“肽模拟物”或“拟肽”.参见，例如，Jones， Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford University Press(1992)；Jung， Combinatorial Peptide and Nonpeptide文库：A Handbook，John Wiley (1997)；Bodanszky等，Peptide Chemistry-A Practical Textbook，Springer  Verlag(1993)；Synthetic Peptides：A Users Guide，(Grant，编辑，W.H. Freeman and Co.，1992)；Evans等，J.Med.Chem.30：1229(1987)； Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger，Trends  Neurosci.，8：392-396(1985)；和在以上各出版物中所引用的参考文献， 其通过参考并入本文。这样的化合物经常在计算机分子模拟的帮助下开 发。在结构上与本发明的有用肽相似的肽模拟物可用于产生同等作用并 因此被考虑为本发明的一部分。

术语“区域”如本文所用是指生物分子的一级结构的在物理上的邻 接部分。对于蛋白质而言，区域被定义为该蛋白质的氨基酸序列连续部 分。

术语“结构域”如本文所用是指作用于生物分子已知或未知功能的 生物分子结构。结构域可与区域或其部分共延伸；结构域也可以包括生 物分子的不同的、非连续的区域。

如本文所用，术语“分子”意思是任意化合物，包括但不是限于小分 子、肽、蛋白质、糖、核苷酸、核酸、脂类等，并且这样的化合物可以 是天然的或合成的。

如本文所用，术语“包括”(“comprise”)或变化例如“包括” (“comprises”)或“包括”(“comprising”)，应理解为意指包含规定 的整体或成组的整体但不排除任何其它的整体或成组的整体。

如本文所用，术语“主要地”或变化例如“主要的”或“其是主要的”应 理解为意指在已经用PNG酶处理糖蛋白并由质谱例如MALDI-TOF MS 分析释放的聚糖之后具有最高摩尔百分比(％)的总O-聚糖或N-聚糖的聚 糖种类。换言之，短语“主要地”被定义为为个体实体，以使特定“主要” 糖形以比任何其它个体实体更大的摩尔百分比存在。例如，如果组合物 由40摩尔百分比的种类A、35摩尔百分比的种类B和25摩尔百分比的种类 C组成，则组合物主要包含种类A。

附图说明

图1图解了人和巴斯德毕赤酵母中N-糖基化途径。ER中的早期事 件是高度保守的，包括由葡糖苷酶I和II去除三个葡萄糖残基和由ER甘 露糖苷酶处理单个特定α-1，2-连接的甘露糖残基，引起相同核心结构 Man₈GlcNAc₂(Man8B)。但是，加工事件在高尔基体中不同。Mns，α-1，2- 甘露糖苷酶；MnsII，甘露糖苷酶II；GnT I，α-1，2-N-乙酰基葡糖胺转移酶 I；GnT II，α-1，2-N-乙酰基葡糖胺转移酶II；MnT，甘露糖基转移酶。两个 核心GlcNAc残基虽然在所有情况中存在，但在命名中忽略。

图2图解了N-糖基化中的关键中间步骤以及缩写命名，其指产生 各自聚糖结构(GS)的基因工程化巴斯德毕赤酵母菌株。

图3图解了N-糖苷酶F释放的N-聚糖的MALDI-TOF质谱(MS) 分析。K3(人纤溶酶原的三环3结构域)在巴斯德毕赤酵母菌株GS115 来源的野生型对照(Invitrogen，Carlsbad，CA)、YSH44、YSH71、RDP52 和RDP80中产生并通过Ni-亲和层析从培养物上清液中纯化。通过N- 糖苷酶F处理释放N-聚糖并进行MALDI-TOF MS分析(阳性模式，除 了图3G是阴性模式)，其表现为钠或钾络合物。两个核心GlcNAc残基 虽然存在，但在命名中忽略。GN，GlcNAc；M，甘露糖。

图3A：GS115来源的野生型对照菌株中产生的N-聚糖；

图3B：菌株YSH44中K3上产生的N-聚糖；

图3C：菌株YSH71(YSH44表达hGalTI)中K3上产生的N-聚糖，

图(3D)菌株RDP52(YSH44表达hGalTI和SpGALE)中K3上产生 的N-聚糖，

图(3E)菌株RDP80(YSH44表达hGalTI、SpGALE和DmUGT)中 K3上产生的N-聚糖；

图(3F)在α-半乳糖苷酶体外处理后来自RDP80的聚糖；和

图(3G)在用α-2，6-(N)-唾液酸转移酶处理后在阴性模式中来自 RDP80的聚糖。

图4图解了Leloir半乳糖利用途径。经由半乳糖通透酶引入细胞外 半乳糖。通过酶半乳糖激酶，半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和UDP-半乳 糖C4-差向异构酶的作用半乳糖被转化成葡萄糖-6-磷酸。来自酿酒酵母 的蛋白名称在括号中。

图5显示巴斯德毕赤酵母糖工程化的菌株YGLY578-1的构建。编 码高尔基体糖基转移酶的巴斯德毕赤酵母基因OCH1，MNN4，PNO1， MNN4L1和BMT2被敲除然后敲入12个异源基因，包括分泌的hK3的 表达盒。YGLY578-1能够生产糖蛋白具有Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N- 聚糖。CS，反选择。

图6显示质粒pRCD977b的示意图。该质粒是arg1::HIS1敲除质 粒，其整合进并删除巴斯德毕赤酵母ARG1基因而利用PpHIS1基因作 为选择标记并含有分别在PpOCH1、PpGAPDH、PpPMA1和PpTEF启 动子的控制下编码全长黑腹果蝇高尔基体UDP-半乳糖转运蛋白 (DmUGT)、全长酿酒酵母半乳糖激酶(ScGAL1)、全长酿酒酵母半乳糖-1- 磷酸尿苷酰转移酶(ScGAL7)和酿酒酵母半乳糖通透酶(ScGAL2)的表达 盒。TT是指转录终止序列。

图7显示表达酿酒酵母GAL1、GAL2和GAL7基因的糖工程化的 巴斯德毕赤酵母菌株可在半乳糖(作为单一碳源)上生长而母本菌株不 能。糖工程化的菌株YGLY578-1(表达ScGAL10和hGalTIβ)用质粒 pRCD977b转化，所述质粒含有编码ScGAL1、ScGAL7和ScGAL2的表 达盒。菌株在成分确定的培养基上培养，所述培养基含有酵母氮源、生 物素和3％半乳糖或2％葡萄糖作为碳源或二者均无。

图8显示巴斯德毕赤酵母糖工程化的菌株YGLY317-36的构建。通 过敲除五个酵母糖基转移酶产生巴斯德毕赤酵母菌株YGLY16-3。随后 敲入八个异源基因，得到RDP696-2，能够将人N-聚糖 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂转移到分泌的蛋白的菌株。经由CSTR培养 和引入表达分泌的人Fc的质粒选择健康(robust)克隆得到菌株 YGLY317-36。CS，反选择。

图9显示质粒pGLY954的示意图。该质粒是KINKO质粒，其整 合进巴斯德毕赤酵母TRP1基因座而不删除基因。质粒含有分别在 PpHHT1和PpPMA1启动子的控制下编码全长酿酒酵母半乳糖激酶 (ScGAL1)和全长酿酒酵母半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(ScGAL7)的表达 盒。质粒还含有在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途径靶向融合蛋 白(CO hGalTI)(包含ScMnt1(ScKre2)前导肽(33)融合至人半乳糖基 转移酶I催化结构域的N-末端)的表达盒。TT是指转录终止序列。

图10显示单独在BMMY培养基中诱导或在含有葡萄糖或半乳糖 的培养基中诱导的菌株PBP317-36和RDP783中产生的人Fc片段上N- 聚糖的MALDI-TOF MS分析。菌株从饱和的种子培养物接种至约一个 OD，在800mL BMGY中培养72小时，然后分离(split)并将100mL 培养液等分样离心和在25mL BMMY、25mL BMMY+0.5％葡萄糖或 25mL BMMY+0.5％半乳糖中诱导24小时。蛋白A纯化的蛋白进行蛋 白N-糖苷酶F消化和通过MALDI-TOF MS分析释放的N-聚糖。图A-C， 菌株PBP317-36中产生的人Fc上的N-聚糖；图D-E，菌株RDP783中 产生的人Fc上的N-聚糖。

图11显示巴斯德毕赤酵母糖工程化的菌株YDX477的构建。敲除 五种酵母糖基转移酶产生巴斯德毕赤酵母菌株YGLY16-3(Δoch1， Δpno1，Δbmt2，Δmnn4a，Δmnn4b)。随后敲入八个异源基因，得到 RDP697-1，能够将人N-聚糖Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂转移到分泌的 蛋白的菌株。引入表达分泌的抗体的质粒和表达分泌的形式的里氏木霉 MNS1的质粒得到菌株YDX477。CS，反选择。

图12显示质粒pGLY1418的示意图。该质粒是KINKO质粒，其 整合进巴斯德毕赤酵母TRP1基因座而不删除基因。质粒含有分别在 PpHHT1和PpPMA1启动子的控制下编码全长ScGAL1和ScGAL7的表 达盒。质粒还含有在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途径靶向融合 蛋白(hGalTI)(包含ScMnt1(ScKre2)前导肽融合至人半乳糖基转移 酶I催化结构域的N-末端)的表达盒。TT是指转录终止序列。

图13A-F显示单独在BMMY培养基中诱导或在含有半乳糖的培养 基中诱导的菌株YDX477和RDP968-1中产生的抗-Her2抗体上N-聚糖 的MALDI-TOF MS分析。菌株在150mL BMGY中培养72小时，然后 分离并将50mL培养液等分样离心和在25mL BMMY、25mL BMMY+ 0.1％半乳糖或25mL BMMY+0.5％半乳糖中诱导24小时。蛋白A纯 化的蛋白进行蛋白N-糖苷酶F消化和通过MALDI-TOF MS分析释放的 N-聚糖。图13A-C，菌株YDX477中产生的抗体上的N-聚糖；图13D-F， 菌株RDP968-1中产生的抗体上的N-聚糖。

图14显示质粒pAS24的示意图。该质粒是巴斯德毕赤酵母bmt2 敲除质粒，其含有PpURA3选择标记和含有在PpOCH1启动子的控制 下编码全长小鼠高尔基体UDP-GlcNAc转运蛋白(MmSLC35A3)的表 达盒。TT是指转录终止序列。

图15显示质粒pRCD742b的示意图。该质粒是KINKO质粒，其 含有PpURA5选择标记以及在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途径 靶向融合蛋白(FB8 MannI)(包含融合至小鼠甘露糖苷酶I催化结构域 的N-末端的ScSec12前导肽)的表达盒、在PpPMA1启动子的控制下 编码分泌途径靶向融合蛋白(CONA10)(包含融合至人GlcNAc转移 酶I(GnT I)催化结构域的N-末端的PpSec12前导肽)的表达盒和在 PpSEC4启动子的控制下编码小鼠高尔基体UDP-GlcNAc转运蛋白 (MmSLC35A3)的全长基因。TT是指转录终止序列。

图16显示质粒pDMG47的示意图。质粒包括在PpGAPDH的控制 下启动子编码分泌途径靶向融合蛋白(KD53)(包含融合至黑腹果蝇甘 露糖苷酶II催化结构域的N-末端的ScMnn2前导肽)的表达盒。质粒 还含有在PpPMA1启动子的控制下编码分泌途径靶向融合蛋白(TC54) (包含融合至大鼠GlcNAc转移酶II(GnT II)催化结构域的N-末端的 ScMnn2前导肽)的表达盒。TT是指转录终止序列。

图17显示质粒pRCD823b的示意图。该质粒是KINKO质粒，其 整合进巴斯德毕赤酵母HIS4基因座而不删除基因，并含有PpURA5选 择标记。质粒包括在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途径靶向融合 蛋白(TA54)(包含ScMnn2前导肽融合至大鼠GlcNAc转移酶II(GnT II)催化结构域的N-末端)的表达盒和分别在PpOCH1和PpPMA1启动 子的控制下编码全长黑腹果蝇高尔基体UDP-半乳糖转运蛋白(DmUGT) 和酿酒酵母UDP-半乳糖C4-差向异构酶(ScGAL10)的表达盒。TT是指 转录终止序列。

图18显示质粒pGLY893a的示意图。该质粒是巴斯德毕赤酵母 his1敲除质粒，其含有PpARG4选择标记。质粒含有在PpPMA1启动 子的控制下编码分泌途径靶向融合蛋白(KD10)(包含PpSEC12前导肽 融合至黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域的N-末端)的表达盒，在 PpTEF启动子的控制下编码分泌途径靶向融合蛋白(TA33)(包含 ScMnt1(ScKre2)前导肽融合至大鼠GlcNAc转移酶II(GnT II)催化结 构域的N-末端)的表达盒和在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途 径靶向融合蛋白(包含ScMnn2前导肽融合至人半乳糖基转移酶I催化 结构域的N-末端)表达盒。TT是指转录终止序列。

图19显示质粒pRCD742a的示意图。该质粒是KINKO质粒，其 整合进巴斯德毕赤酵母ADE1基因座而不删除基因并含有PpURA5选 择标记。质粒含有在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途径靶向融合 蛋白(FB8 MannI)(包含ScSEC12前导肽融合至小鼠甘露糖苷酶I催 化结构域的N-末端)的表达盒、在PpPMA1启动子的控制下编码分泌 途径靶向融合蛋白(CONA10)(包含PpSEC12前导肽融合至人GlcNAc 转移酶I(GnT I)催化结构域的N-末端)的表达盒和在PpSEC4启动子 的控制下编码全长小鼠高尔基体UDP-GlcNAc转运蛋白(MmSLC35A3) 的表达盒。TT是指转录终止序列。

图20显示质粒pRCD1006的示意图。该质粒是巴斯德毕赤酵母 his1敲除质粒，其含有PpURA5基因作为选择标记。质粒含有在 PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途径靶向融合蛋白(XB33)(包含 ScMnt1(ScKre2)前导肽融合至人半乳糖基转移酶I催化结构域的N-末 端)的表达盒和分别在PpOCH1和PpPMA1启动子的控制下编码全长黑 腹果蝇高尔基体UDP-半乳糖转运蛋白(DmUGT)和粟酒裂殖酵母UDP- 半乳糖C4-差向异构酶(SpGALE)的表达盒。TT是指转录终止序列。

图21显示质粒pGLY167b的示意图。该质粒是巴斯德毕赤酵母 arg1敲除质粒，其含有PpURA3选择标记并含有在PpGAPDH启动子 的控制下编码分泌途径靶向融合蛋白(CO-KD53)(包含ScMNN2前导 肽融合至黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域的N-末端)的表达盒和在 PpPMA1启动子的控制下编码分泌途径靶向融合蛋白(CO-TC54)(包含 ScMnn2前导肽融合至大鼠GlcNAc转移酶II(GnT II)催化结构域的 N-末端)的表达盒。TT是指转录终止序列。

图22显示质粒pBK 138的示意图。该质粒是滚入(roll-in)质粒， 其整合进巴斯德毕赤酵母AOX1启动子同时复制启动子。质粒含有编码 融合蛋白(包含酿酒酵母A交配因子前信号序列融合至人Fc抗体片段 (人IgG1H链的C-末端233-aa)的N-末端)的表达盒。TT是指转录终 止序列。

图23显示质粒pGLY510的示意图。该质粒是滚入质粒，其整合 进巴斯德毕赤酵母TRP2基因同时复制基因并含有AOX1启动子 -ScCYC1终止子表达盒以及PpARG1选择标记。TT是指转录终止序 列。

图24显示质粒pDX459-1的示意图。该质粒是滚入质粒，其靶向 并整合进巴斯德毕赤酵母AOX2启动子和含有Zeo^R同时复制启动子。 质粒含有分开的表达盒，其编码抗-HER2抗体重链和抗-HER2抗体轻 链，每个在N-末端融合至黑曲霉α-淀粉酶信号序列并在巴斯德毕赤酵母 AOX1启动子的控制下。TT是指转录终止序列。

图25显示质粒pGLY1138的示意图。该质粒是滚入质粒，其整合 进巴斯德毕赤酵母ADE1基因座同时复制基因和含有ScARR3选择标 记基因盒(其赋予亚砷酸盐抗性)以及在PpAOX1启动子的控制下编码 分泌的里氏木霉MNS1(包含MNS1催化结构域在其N-末端融合至酿 酒酵母α因子前信号序列)的表达盒。TT是指转录终止序列。

发明详述

酵母已被成功用于生产细胞内和分泌的重组蛋白(参见例如， Cereghino Cregg FEMS Microbiology Reviews 24(1)：45-66(2000)； Harkki，等人Bio-Technology 7(6)：596(1989)；Berka，等人Abstr.Papers  Amer.Chem.Soc.203：121-BIOT(1992)；Svetina，等人J.Biotechnol. 76(2-3)：245-251(2000))。多种酵母，例如乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤 酵母、甲醇毕赤酵母和多形汉逊酵母，已作为用于生产重组蛋白的真核 表达系统发挥特别重要的作用，因为它们能够生长至高细胞密度和分泌 大量重组蛋白。但是，在任意这些真核微生物中的糖蛋白表达在N-聚糖 结构上实质不同于哺乳动物中产生的糖蛋白表达。糖基化中的该差异已 阻止酵母或丝状真菌用作用于生产许多治疗用糖蛋白的宿主。

为了能够利用酵母以产生治疗用糖蛋白，酵母已被基因工程化为产 生具有杂合或复合N-聚糖的糖蛋白。能够生产包含具体杂合或复合N- 聚糖的组合物的重组酵母已在例如，美国专利号7,029,872和美国专利 号7,449,308中公开。另外，Hamilton等人，Science 313：1441-1443(2006) 和美国公开的申请号2006/0286637报道了酵母巴斯德毕赤酵母中糖基 化途径的人源化和具有复合N-糖基化(具有末端唾液酸)的重组人糖 蛋白的分泌。对于末端唾液酸的具有寡糖结构Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G2)前体N-聚糖是也作为从人血清中分离的几种蛋白上主要N-聚糖发 现的结构，所述从人血清中分离的几种蛋白包括促卵泡激素(FSH)、脱 唾液酸转铁蛋白，以及最显著的是在人免疫球蛋白(抗体)以不同的量存 在。Davidson等人在美国公开的申请号2006/0040353教导了利用已被基 因工程化为产生半乳糖末端的N-聚糖的酵母细胞获得半乳糖基化的糖 蛋白的有效方法。这些宿主细胞能够生产糖蛋白组合物具有G2或G1 (GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)寡糖结构的多种混合物，其具有G0寡糖结 构的变化量。G0是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂，其是半乳糖基转移酶的底物。 但是，对于某些糖蛋白，特别是抗体和Fc片段，已发现半乳糖转移过 程的效率不是最适的。在抗体和Fc片段的情况下，认为的是在细胞内 加工期间抗体或Fc片段上糖基化位点的定位和可及性抑制半乳糖有 效转移到抗体或Fc片段的N-聚糖上。因此，含有半乳糖的寡糖结构的 量小于其他糖蛋白例如三环3蛋白中已观察到的量。为了克服该问题， 本发明提供增加半乳糖转移到抗体或Fc片段的N-聚糖上的量的方法， 因此增加含有抗体或Fc片段的G1和G2的量高于含有抗体或Fc片段 的G0。

巴斯德毕赤酵母仅可利用有限数量的碳源进行生存。目前，这些碳 源已知是甘油、葡萄糖、甲醇以及可能是鼠李糖和甘露糖但不是半乳糖。 在许多商业生产过程中，利用巴斯德毕赤酵母，重组蛋白的表达在AOX 启动子的控制下，其w在甲醇存在下是有活性的但在甘油存在下被抑 制。因此，巴斯德毕赤酵母通常在含有甘油或甘油/甲醇的培养基中生长 直到细胞的浓度达到期望的水平，在此时，通过用仅含有甲醇作为碳源 的培养基替换培养基来进行重组蛋白的表达。但是，细胞处于低能量 状态，因为甲醇仅含有一个碳，使其成为贫瘠碳源。因此，期望的是具 有这样的生产过程，其中巴斯德毕赤酵母可利用更高级的能源，例如半 乳糖。本发明通过提供能够利用半乳糖作为单一碳源的基因工程化巴斯 德毕赤酵母也解决了该问题。

因此，本发明已解决上述确定的两个问题。本发明提供重组低等真 核细胞，特别是酵母和真菌细胞，其已被糖工程化以产生糖蛋白例如抗 体或Fc片段，其中与未被如本文所教导的基因工程化的细胞相比，其 上N-聚糖上的末端半乳糖水平增加。基因工程化宿主细胞可用于产生 具有N-聚糖(含有半乳糖)的糖蛋白的方法，其中所述N-聚糖中半乳 糖的量高于未被如本文所教导的基因工程化的宿主细胞中可获得的量。 本发明还提供基因工程化宿主细胞，其中通常不能利用半乳糖作为单一 碳源的宿主细胞已被如本文所教导的基因工程化以能够利用半乳糖作 为单一碳源。本文的使得宿主细胞能够利用半乳糖作为单一碳源的方法 利用巴斯德毕赤酵母作为模型。本文的方法可用于使得通常不能利用半 乳糖作为碳源的其他酵母或真菌物种能够利用半乳糖作为碳源。

为解决两个问题，基因工程化的宿主细胞(其已被基因工程化为能 够产生半乳糖末端的N-聚糖)被进一步基因工程化为表达Leloir途径酶： 半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)、UDP-半乳糖-4-差向异构酶(EC 5.1.3.2)和半乳 糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(EC 2.7.7.12)。任选地，宿主细胞可另外表达半 乳糖通透酶。这使得宿主细胞能够利用半乳糖作为碳源并产生UDP- 半乳糖库，其反过来作为涉及包括半乳糖残基的N-聚糖合成的半乳糖转 移酶的底物。因此，本文中的宿主细胞和方法能够产生糖蛋白组合物， 特别是抗体和Fc片段组合物，其中所述半乳糖末端的N-聚糖的比例高 于在糖工程化的低等真核细胞中可获得的比例。重组宿主细胞可生产重 组糖蛋白例如抗体和Fc融合蛋白，其中G0∶G1/G2比值小于2∶1或 G0∶G1/G2比值为1∶1或更小或G0∶G1/G2比值为1∶2或更小。

本文所述的宿主细胞和方法特别用于生产这样的抗体和Fc片段， 其含有具有N-聚糖的融合蛋白，所述N-聚糖具有半乳糖残基末端。在 抗体或抗体片段重链Asn-297处的N-聚糖对抗体的结构和功能重要。 这些功能包括Fcγ受体结合、激活补体的能力、激活细胞毒性T细胞 (ADCC)的能力和血清稳定性。但是，在酵母或哺乳动物细胞中目前的 抗体生产通常缺乏对于N-糖基化的控制，特别是在重链的恒定区或Fc 区Asn-297处发生的N-糖基化，以及特别是控制在N-聚糖上末端半乳 糖的水平的能力。一般而言，已发现尽管已被基因工程化为产生在N- 聚糖中包括半乳糖残基的糖蛋白的酵母细胞可以高效地产生许多具有 含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白，但是细胞产生抗体具有含有半乳糖的 N-聚糖的能力并不一样高效。如本文所示，本文的宿主细胞和方法提供 这样的宿主细胞，其与未被如本文所述基因工程化的细胞相比，可以产 生更高水平的具有含有半乳糖的N-聚糖的抗体。

尽管在不具有末端半乳糖残基的N-聚糖上末端的半乳糖水平可以 在体外在利用可溶性半乳糖基转移酶以将带电的半乳糖残基添加到N- 聚糖的末端的反应中增加，但是该体外方法费用高、复杂并且不容易扩 大规模用于生产大量糖蛋白。因此，本文公开的宿主细胞(并且其能够 在体内产生分泌的具有增加的末端半乳糖水平的N-聚糖的糖蛋白，包括 抗体或抗体片段)提供生产具有含有增加的半乳糖水平的N-聚糖的抗体 组合物的更理想的方法。因此，本发明在抗体生产中具有显著改进并且 首次提供控制具体抗体特征例如N-聚糖中半乳糖水平的能力，和特别是 生产具有改进的功能性特征的重组糖蛋白。

另外，当本文的方法用于已被基因工程化为产生具有唾液酸化的 N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞中时，半乳糖末端的N-聚糖是唾液酸转移酶 的底物。因此，唾液酸化的N-聚糖的量部分地随可用于唾液酸化的半乳 糖末端的N-聚糖的量而变化。本文中的宿主细胞和方法提供用于增加半 乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的量的方法，其中当在已被基因工程 化为产生唾液酸化的N-聚糖的宿主细胞中生产时，产生这样的宿主细 胞，其与未被如本文所教导的基因工程化的宿主细胞相比，产生增加量 的唾液酸化的N-聚糖。

尽管本发明用于生产包含半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的 糖蛋白，但是本发明还用作用于选择表达任意类型异源蛋白(不论是否 是糖蛋白)的重组宿主细胞的选择方法。表达一种或两种但不是全部 Leloir途径酶活性的重组宿主细胞用编码异源蛋白和不存在于重组宿主 细胞中的Leloir途径酶的一个或多个核酸分子转化。由于转化的重组宿 主细胞含有完整的Leloir途径，可通过在半乳糖是单一碳源的培养基中 培养转化的重组宿主细胞来获得选择表达对于非转化的细胞是异源蛋 白的转化的重组宿主细胞。因此，提供的是用于产生表达异源蛋白的重 组宿主细胞的方法，其包含以下步骤。提供宿主细胞，其已被基因工程 化为表达一种或两种选自半乳糖激酶、UDP-半乳糖-4-差向异构酶和半 乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的Leloir途径酶。在一些实施方案中，宿主细 胞能够产生具有人样N-聚糖的糖蛋白，和在其他实施方案中，宿主细胞 不产生具有人样N-聚糖的糖蛋白，因为要在宿主细胞中表达的异源蛋白 不具有N-聚糖。用编码异源蛋白和提供的重组宿主细胞中不表达的 Leloir途径酶或多种酶的一个或多个核酸分子转化宿主细胞。转化的宿 主细胞在含有半乳糖作为单一碳能源的培养基中培养以提供表达异源 蛋白的重组宿主细胞。任选地，宿主细胞可另外包括编码半乳糖通透酶 的核酸分子。在具体实施方案中，宿主细胞被基因工程化为控制O-糖基 化或在控制O-糖基化的条件下生长或二者。在另外的实施方案中，宿主 细胞另外已被修饰为降低磷酸甘露糖基转移酶和/或β-甘露糖基转移酶 活性.

在低等真核细胞中基因工程化糖基化途径

在大多数真核细胞中N-糖基化通过将脂类-连接的 Glc₃Man₉GlcNAc₂寡糖结构转移到新生多肽的特定Asn残基上在内质 网(ER)中起始(Lehle和Tanner，Biochim.Biophys.Acta 399：364-74 (1975)；Kornfeld和Kornfeld，Annu.Rev.Biochem 54：631-64(1985)； Burda和Aebi，Biochim.Biophys.Acta-General Subjects 1426：239-257 (1999))。对来自N-连接寡糖的所有三个葡萄糖部分和单个特定甘露糖的 修饰产生Man₈GlcNAc₂(参见图1)，其使得糖蛋白易位到高尔基体，在 高尔基体中发生进一步寡糖加工(Herscovics，Biochim.Biophys.Acta  1426：275-285(1999)；Moremen等人，Glycobiology 4：113-125(1994))。在 高尔基体中，哺乳动物N-聚糖加工不同于酵母和许多其他真核细胞，包 括植物和昆虫。哺乳动物以特定反应顺序加工N-聚糖，涉及在从寡糖在 添加GlcNAc以形成杂合中间体N-聚糖GlcNAcMan₅GlcNAc₂之前，去 除三个末端α-1，2-甘露糖(Schachter，Glycoconj.J.17：465-483(2000))(参 见图1)。该杂合结构是甘露糖苷酶II的底物，所述甘露糖苷酶II在寡糖 上去除末端α-1，3-和α-1，6-甘露糖以得到N-聚糖GlcNAcMan₃GlcNAc₂(Moremen，Biochim.Biophys.Acta 1573(3)：225-235(1994))。最后，如图 1所示，通过在添加半乳糖和唾液酸残基后，添加至少一个另外的 GlcNAc残基，产生复合N-聚糖(Schachter，(2000)，如上)，虽然唾液酸 通常在某些人蛋白，包括IgGs上缺乏(Keusch等人，Clin.Chim.Acta 252： 147-158(1996)；Creus等人，Clin.Endocrinol.(Oxf)44：181-189(1996))。

在酿酒酵母中，N-聚糖加工涉及在其通过整个高尔基体时，添加甘 露糖至寡糖，有时产生具有大于100个甘露糖残基的高甘露糖基化的聚 糖(Trimble和Verostek，Trends Glycosci.Glycotechnol.7：1-30(1995)； Dean，Biochim.Biophys.Acta-General Subjects 1426：309-322(1999))(参 见图1)。在通过α-1，6-甘露糖基转移酶(Ochlp)将第一个α-1，6-甘露糖添 加到Man₈GlcNAc₂后，另外的甘露糖基转移酶延伸具有α-1，2-、α-1，6- 和末端α-1，3-连接的甘露糖以及甘露糖基磷酸的Man₉GlcNAc₂聚糖。巴 斯德毕赤酵母是甲基营养酵母，通常用于异源蛋白的表达，具有与酿酒 酵母类似的糖基化机制(Bretthauer和Castellino，Biotechnol.Appl. Biochem.30：193-200(1999)；Cereghino和Cregg，Fems Microbiol.Rev.24： 45-66(2000)；Verostek和Trimble，Glycobiol.5：671-681(1995))。但是， 与N-糖基化的复杂度一致，巴斯德毕赤酵母中的糖基化不同于酿酒酵母 中的糖基化，原因在于它缺乏添加末端α-1，3-连接的甘露糖的能力，而 是添加其他甘露糖残基，包括磷酸甘露糖和β-连接的甘露糖(Miura等人， 基因324：129-137(2004)；Blanchard等人，Glycoconj.J.24：33-47(2007)； Mille等人，J.Biol.Chem.283：9724-9736(2008))。

在以往工作中，我们证明巴斯德毕赤酵母的och1突变体缺乏起始 酵母型外链形成的能力，并且因此，不能高甘露糖化N-聚糖(Choi等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：5022-5027(2003))。另外，我们鉴定了编 码负责β-甘露糖转移的高尔基体定位(residing)酶的新的基因家族并证 明该家族的多个成员的缺失降低或消除免疫原性β-甘露糖转移(参见美 国公开的申请号US2006/0211085)。随后引入五种单独的糖基化酶得到 在分泌的模式蛋白上产生复合人N-聚糖的菌株(参见图3A相对于图 3B)(Choi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：5022-5027(2003)； Hamilton等人Science 310：1244-1246(2003)；美国专利号7,029,872；美 国公开的申请号2004/0018590；美国公开的申请号2004/023004；美国公 开的申请号2005/0208617；美国公开的申请号2004/0171826；美国公开 的申请号2005/0208617；美国公开的申请号2005/0170452和美国公开的 申请号2006/0040353。更近期地，构建能够在酵母菌株产生的分泌的蛋 白上产生充分唾液酸化的N-聚糖的重组酵母菌株已在美国公开的申请 号2005/0260729和2006/0286637和Hamilton等人，Science 313： 1441-1443(2006)中描述。

复合N-聚糖的成熟涉及添加半乳糖至末端GlcNAc部分，这是可以 被几种半乳糖基转移酶(GalT)催化的反应。在人中，存在GalT的七种同 种型(I-VII)，其中至少四种已显示在体外在UDP-半乳糖存在下转移半 乳糖至末端GlcNAc(Guo，等人，Glycobiol.11：813-820(2001))。最先鉴定 的酶，已知为GalTI，通常被认为是作用N-聚糖的主要酶，这已由体外 实验、小鼠敲除研究和组织分布分析支持(Berger和Rohrer，Biochimie  85：261-74(2003)；Furukawa和Sato，Biochim.Biophys.Acta 1473：54-66 (1999))。如本文所示，人GalTI的表达，当其在宿主细胞高尔基体适当 定位时，可以在能够产生含有末端GlcNA的前体的糖工程化的酵母菌株 中转移半乳糖至复合N-聚糖上。另外，UDP-半乳糖4-差向异构酶的表 达以产生UDP-半乳糖库和UDP-半乳糖转运蛋白的表达以将底物移动至 高尔基体在能够产生末端GlcNAc前体的菌株中产生几乎相当量的 β-1，4-半乳糖转移到N-聚糖上。经由对于中间N-聚糖底物在GlcNAc和 半乳糖基转移酶之间的分离和降低的竞争，定位子文库的重复筛选得到 复合N-聚糖结构高于于杂合N-聚糖结构的改进的产生。

以往，在一组精确设计的实验(an elegant set of experiments)中， 人GalTI显示具有将β-1，4-半乳糖转移到末端GlcNAc的活性，这要求首 先产生Alg1p酶的突变体，其将核心或少甘露糖转移到在生长中的N- 聚糖前体分子(Schwientek等人，J.of Biol.Chem 271：3398-3405 (1996))。该突变引起GlcNAc₂截短的N-聚糖部分地转移到蛋白，并产 生末端GlcNAc。这之后，作者表明人GalTI能够将半乳糖以β-1，4-连接 转移到该人工末端GlcNAc结构。重要的是，显示了人GalTI可以在酵 母的高尔基体中以活性形式表达。

基于上述，首先利用靶向宿主细胞高尔基体的人GalTI-前导肽融合 蛋白的表达来检测本发明。在随后筛选人GalTII、GalTIII、GaITIV、 GalTV、牛GalTI和一对推测的线虫(C.elegans)GalT后，发现人GalTI 看起来是在该异源的系统中将半乳糖转移到复合双触角N-聚糖的最具 活性的酶。这可能表明hGalTI是用于转移至该底物(双触角复合N-聚 糖)的最具能力的酶或它可能仅是检测的GalT酶中最稳定的和最具活 性的或二者的组合。有意思的是，当利用将甘露糖苷酶II和GnT II催 化结构域-引导融合蛋白定位于高尔基体的相同前导肽将GalT定位于高 尔基体时，产生其中末端半乳糖在α-1，3臂上的杂合N-聚糖结构的显著 百分比(直至20％)。甘露糖苷酶II或GnT II活性的表达的增加不能显 著降低该现象。但是，筛选酵母型II分泌途径定位前导肽(定位于分泌 途径期望的细胞器例如ER、高尔基体或反式高尔基体网络的肽)文库得 到几种活性GalT-前导肽融合蛋白，其当被转化至宿主细胞时，产生显 著降低水平的杂合N-聚糖结构和增加的复合N-聚糖结构。之前，已报 道等分的(bisecting)GlcNAc转移是高尔基体中N-聚糖的成熟中对 于随后糖转移的停止信号，包括阻止果糖的转移(Umana等人，Nature  Biotechnol.17：176-180(1999))。此处的数据表明半乳糖转移到α-1，3臂 产生类似的停止信号，阻止甘露糖苷酶II和GnT II进行的α-1，6臂的成 熟。

上述结果表明在重组宿主细胞中产生的具有半乳糖末端或含有半 乳糖的杂合N-聚糖与具有半乳糖末端的或含有半乳糖的复合N-聚糖的 比值是GalTI位于高尔基体相对于甘露糖苷酶II和GnT II位于高尔基体 中的结果，并且通过操纵三种酶的定位，可以操纵杂合N-聚糖与复合 N-聚糖的比值。为了增加具有半乳糖末端的或含有半乳糖的杂合N-聚糖 的产率，所有三种酶活性应被靶向至高尔基体的相同区域，例如通过利 用相同分泌途径靶向前导肽来靶向所有三种酶活性。或者，筛选GalT- 前导肽融合蛋白的文库来鉴定将GalT活性定位于高尔基体的融合蛋 白，在高尔基体中更可能的是在其他两个酶可以发挥作用之前，GalT作 用N-聚糖底物。该增加了具有半乳糖末端的或含有半乳糖的杂合N-聚 糖相比于具有半乳糖末端的或含有半乳糖的复合N-聚糖的产率。相反 地，为了降低具有半乳糖末端的或含有半乳糖的杂合N-聚糖的产率， 应利用与其他两种酶活性所利用的分泌途径靶向前导肽不同的分泌途 径靶向前导肽来定位GalT活性。这可通过筛选GalT-前导肽融合蛋白 文库以鉴定GalT-前导肽融合蛋白组合来获得，所述GalT-前导肽融合蛋 白组合产生这样的宿主细胞，在其中与具有半乳糖末端的或含有半乳糖 的杂合N-聚糖的产率相比，具有半乳糖末端的或含有半乳糖的复合N- 聚糖的产率增加。

该结果进一步强调了当在异源宿主系统中表达嵌合糖基化酶时， 筛选催化结构域和分泌途径定位前导肽文库的价值，这是之前在Choi 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：5022-5027(2003)中说明的并在美 国专利号7,029,872和7,449,308中描述的概念。由于全基因组序列的可 获得性、更复杂的PCR和克隆技术以及更高通量的分析技术如质谱，筛 选数以百计甚至数以千计的组合是可能的。重要的是，这种类型的组合 筛选已证实在检测酶活性与驱动逐步反应之间的差异，每个依赖于之前 的产物而完成。此处，尽管在UDP-半乳糖4-差向异构酶的情况下，筛 选的几种酶看起来具有产生UDP-半乳糖库相对相同的能力，但是检测 的四种UDP-半乳糖转运蛋白中仅一种在该异源宿主中证实有活性，包 括令人惊讶地，来自一种酵母(粟酒裂殖酵母)的一种无活性转运蛋白。 另外，从多种分泌途径定位前导肽的筛选中，其中许多产生活性酶组合， 发现仅三种得到较高程度的具有双触角末端半乳糖(G2)的均一的复合 N-聚糖(＞85％)。高甘露糖和杂合中间结构的减少对于这类异源表达系统 在生产治疗用糖蛋白中的用途具有重要的作用，因为高甘露糖结构已显 示具有有效免疫原性并且最近的证据已表明肝毒性可源自过于丰富的 杂合N-聚糖。

因此，美国公开的申请号2006/0286637教导了在不通常产生含有半 乳糖的糖蛋白的宿主细胞中获得半乳糖转移的方法，三种条件已被克 服：(1)在高尔基体中内源半乳糖基转移酶(GalT)的缺乏，(2)内源 UDP-Gal不能转运至高尔基体和(3)低的内源细胞质UDP-Gal库。在缺 乏UDP-Gal转运蛋白的情况下，半乳糖向N-聚糖上末端GlcNAc残基 的转移为约55-60％。在缺乏UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的情况下，半乳 糖向N-聚糖上末端GlcNAc残基的转移为约10-15％。

利用具有暴露的N-聚糖(其在人中通常被唾液酸化)的报告子蛋白 (人纤溶酶原的K3结构域)已制备了所有上述修饰以产生宿主细胞 (其可产生半乳糖基化的N-聚糖)，并在美国公开的申请号20060040353 中报道。但是，以可与哺乳动物细胞相比较的方式，这些糖工程化的酵 母菌株仅产生部分的半乳糖转移到抗体Fc聚糖上，引起具有小于 10％G2和小于25％G1结构的N-聚糖库，偏好于具有末端GlcNAc的复 合N-聚糖。这与哺乳动物细胞系类似，其中抗体(IgG Fc Asn 297)N-聚 糖含有减少量的末端半乳糖。

半乳糖残基转移到N-聚糖上需要活化的半乳糖(UDP-Gal)库。在低 等真核细胞中产生高于内源水平的这类库的一种方式是如上所述并在 美国公开的申请号2006/0040353所示的UDP-半乳糖4差向异构酶的表 达。另一种方式本发明，其包括上述细胞，其中用核酸分子转化所述宿 主细胞，所述核酸分子编码至少以下三种Leloir途径酶：半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶EC 2.7.7.12)和UDP-半乳糖4差 向异构酶(EC 5.1.3.2)。半乳糖激酶是催化半乳糖代谢的第一步(称为半 乳糖磷酸化为半乳糖-1-磷酸)的酶。半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶催化半 乳糖代谢的第二步骤，其是UDP-葡萄糖和半乳糖-1-磷酸转换为UDP- 半乳糖和葡萄糖-1-磷酸。任选地，另外可以包括的是编码质膜半乳糖通 透酶的核酸分子。半乳糖通透酶是质膜己糖转运蛋白，其从外部来源输 入半乳糖。Leloir途径显示于图4。

如本文所示，当编码半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向异构酶 活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖通透酶活性的 基因被引入上述酵母，同时向该酵母给料酵母外源半乳糖，并诱导抗体 表达时，抗体Fc N-聚糖上末端半乳糖的水平实质增加，因此增加产生 的G2N-聚糖的量：N-聚糖可在人Fc上获得，其中大于50％的N-聚糖 是G2。通透酶是任选的，因为发现细胞中的内源通透酶能够将半乳糖 输入细胞。因此，当使用时，半乳糖通透酶可以是能够使半乳糖穿过细 胞膜转运的任意质膜己糖转运蛋白，例如，来自酿酒酵母的GAL2半乳 糖通透酶(参见GenBank：M81879)。半乳糖激酶可以是能够催化半乳糖 磷酸化为半乳糖-1-磷酸的任意酶，例如，来自酿酒酵母的GAL1基因(参 见GenBank：X76078)。半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶可以是催化UDP-葡 萄糖和半乳糖-1-磷酸转换为UDP-半乳糖和葡萄糖-1-磷酸的任意酶，例 如，酿酒酵母的GAL7(参见GenBank：M12348)。UDP-半乳糖4差向异 构酶可以是催化UDP-葡萄糖转换为UDP-半乳糖的任意酶，例如酿酒酵 母的GAL10(参见GenBank NC_001134)，粟酒裂殖酵母的GALE(参见 GenBank NC_003423)和人的hGALE(参见GenBank NM_000403)。差向 异构酶还可提供为融合蛋白，其中差向异构酶的催化结构域被融合至半 乳糖基转移酶的催化结构域(参见美国公开的申请号US2006/0040353)。

将上述Leloir途径酶引入巴斯德毕赤酵母菌株产生能够同化环境半 乳糖的重组细胞。另外，当上述Leloir途径酶被引入能够生产具有含有 半乳糖的N-聚糖的糖蛋白的细胞中时，得到的重组细胞能够产生与未被 如此工程化的细胞产生的糖蛋白相比，在复合N-聚糖上具有更高水平 β-1，4-半乳糖的糖蛋白。因此，这些工程化步骤的组合已得到这样的宿 主细胞，其被特定地糖工程化和代谢地工程化为对于糖蛋白例如抗体和 Fc-融合蛋白的N-聚糖的糖基化的增加的控制。因此，这些糖工程化的 酵母细胞系能够有效的产生重组抗体和Fc融合蛋白同时允许控制N-聚 糖加工。

表达载体

一般而言，半乳糖激酶、UDP-半乳糖-4-差向异构酶和半乳糖-1-磷 酸尿苷酰转移酶(以及任选地半乳糖通透酶)作为来自表达载体的表达 盒的组分而表达。在另外的方面，在宿主细胞中另外包括的是编码重组 目的蛋白的表达载体，其在具体的实施方案中另外包括促进重组蛋白从 宿主细胞中分泌的序列。对于每种Leloir途径酶和重组目的蛋白，编 码它的表达载体最低程度含有这样的序列，其影响编码Leloir途径酶或 重组蛋白的核酸序列的表达。该序列被可操作连接到编码Leloir途径 酶或重组蛋白的核酸分子。这类表达载体还可含有另外的元件，如复 制起点、选择标记、转录或终止信号、着丝粒、自我复制序列等。

根据本发明，编码重组目的蛋白和上述Leloir途径酶的核酸分子可 以分别地位于表达载体中以允许过表达的重组目的蛋白和上述Leloir途 径酶的受调节的表达。尽管重组蛋白和上述Leloir途径酶可以在相同的 表达载体中编码，但是上述Leloir途径酶优选地在与编码重组蛋白的载 体分开的表达载体中编码。编码上述Leloir途径酶和重组蛋白的核酸分 子位于分开的表达载体中可以增加产生的重组蛋白的量。

如本文所用，表达载体可以是可复制的或不可复制的表达载体。可 复制的表达载体可以不依赖于宿主细胞染色体DNA复制或因为这类载 体具有整合到宿主细胞染色体DNA而依赖于宿主细胞染色体DNA复 制。整合至宿主细胞染色体DNA后，这类表达载体可以失去一些结构 元件但保留编码重组蛋白或上述Leloir途径酶的核酸分子和可以作用于 重组蛋白或上述Leloir途径酶的表达的片段。因此，本发明的表达载体 可以是染色体整合或染色体非整合的表达载体。

在引入编码上述Leloir途径酶和重组蛋白的核酸分子后，然后通过 诱导编码重组蛋白的核酸的表达，使重组蛋白过表达。在另一实施方案 中，建立这样的细胞系，其组成型或诱导型表达上述Leloir途径酶。编 码将被过表达的重组蛋白的表达载体被引入这类细胞系以获得重组蛋 白的增加的产生。在具体实施方案中，编码Leloir途径酶的核酸分子被 可操作连接到组成型启动子。

本发明表达载体可以是在一种宿主细胞类型例如大肠杆菌 (Escherichia coli)中可复制的并在另一种宿主细胞类型例如真核宿主 细胞中进行很少复制或不能复制的，只要表达载体允许上述Leloir途径 酶或过表达的重组蛋白的表达并因而促进这类重组蛋白在选择的宿主 细胞类型中的分泌。

如本文所述的表达载体包括这样的DNA或RNA分子，其被工程 化为对期望的基因即编码上述Leloir途径酶或重组蛋白的基因的控制表 达。这类载体还编码核酸分子片段，其被可操作连接到编码本发明上述 Leloir途径酶或重组蛋白的核酸分子。在本发明上下文中，可操作连接 意思是这类片段可以作用于编码上述Leloir途径酶或重组蛋白的核酸分 子的表达。这些核酸序列包括启动子、增强子、上游控制元件、转录因 子或抑制子结合位点、终止信号和可以在预期的宿主细胞中控制基因表 达的其它元件。优选载体是载体、细菌噬菌体、黏粒或病毒。

本发明的表达载体在酵母或哺乳动物细胞中发挥功能。酵母载体可 以包括酵母2μ环及其衍生物，编码酵母自我复制序列的酵母载体，酵 母小染色体，任意酵母整合载体等。多种类型酵母载体的详细列表在 Parent等人(Yeast 1：83-138(1985))中提供。

能够作用于基因产物的表达的元件或核酸序列包括启动子、增强子 元件、上游激活序列、转录终止信号和多聚腺苷酸位点。所有这类启动 子和转录调节元件，单独或组合，被预期用于本发明的表达载体中。另 外，基因-工程化的和突变的调节序列还在本文中的预期。

启动子是用于控制基因表达的DNA序列元件。具体地，启动子确 定转录起始位点并可以包括TATA盒和上游启动子元件。选择的启动子 是期望在选择的具体宿主系统中可操纵的那些。例如，当利用酵母宿主 细胞例如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或巴斯德毕赤酵母时，酵母启动子 用于本发明的表达载体，而真菌启动子将用于宿主细胞例如黑曲霉、粗 糙脉胞菌或里氏木霉。酵母启动子的实例包括但不限于GAPDH，AOX1， SEC4，HH1，PMA1，OCH1，GAL1，PGK，GAP，TPI，CYC1，ADH2，PHO5， CUP1，MFα1，FLD1，PMA1，PDI，TEF和GUT1启动子。Romanos等人 (Yeast 8：423-488(1992))提供了酵母启动子和表达载体的综述。Hartner 等人，Nucl.Acid Res.36：e76(于2008年6月6日在线出版)描述了用于 巴斯德毕赤酵母中异源蛋白精确调节表达的启动子文库。

可操作连接本文公开的核酸分子的启动子可以是组成型启动子和 诱导型启动子。诱导型启动子是结合转录因子后以增加或降低的速率 引导转录的启动子。如本文所用的转录因子包括可以结合启动子的调节 或控制区并因而影响转录的任意因子。在宿主细胞中转录因子的合成或 启动子结合能力可以通过将宿主暴露于诱导物或将诱导物从宿主细胞 培养基中去除来控制。因此，为了调节诱导型启动子的表达，将诱导物添 加或从宿主细胞的生长培养基中去除。这类诱导物可以包括糖、磷酸、 醇、金属离子、激素、热、冷等。例如，在酵母中常用诱导物是葡萄糖、 半乳糖等。

选择的转录终止序列是在选择的具体宿主系统中可操纵的那些。例 如，当利用酵母宿主细胞例如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或巴斯德毕赤 酵母时，酵母转录终止序列用于本发明的表达载体，而真菌转录终止序 列将用于宿主细胞例如黑曲霉、粗糙脉胞菌或里氏木霉。转录终止序列 包括但不限于酿酒酵母CYC转录终止序列(ScCYC TT)、巴斯德毕赤 酵母ALG3转录终止序列(ALG3 TT)、巴斯德毕赤酵母ALG6转录终止 序列(ALG6 TT)、巴斯德毕赤酵母ALG12转录终止序列(ALG12 TT)、 巴斯德毕赤酵母AOX1转录终止序列(AOX1 TT)、巴斯德毕赤酵母 OCH1转录终止序列(OCH1 TT)和巴斯德毕赤酵母PMA1转录终止序列 (PMA1 TT)。

本发明的表达载体还可编码选择标记。选择标记是基因功能物，其 赋予宿主细胞可鉴定的性状以使用携带选择标记的载体转化的细胞可 以与非转化的细胞区分。载体中包含选择标记还可用于确保连接到标记 的基因功能物保留在宿主细胞群体中。这类选择标记可以赋予任意容易 鉴定的显性性状，例如药物抗性、合成或代谢细胞营养物的能力等。

酵母选择标记包括药物抗性标记和基因功能物，其允许酵母宿主细 胞合成基本的细胞营养物，例如氨基酸。常用于酵母的药物抗性标记包 括氯霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、G418(遗传霉素)、博莱霉素等。允 许酵母宿主细胞合基本的细胞营养物的基因功能物与在相应基因组功 能中具有营养缺陷型突变的可利用的酵母菌株一起使用。常见酵母选择 标记提供用于合成亮氨酸(LEU2)、色氨酸(TRP1和TRP2)、尿嘧啶 (URA3，URA5，URA6)、组氨酸(HIS3)、赖氨酸(LYS2)、腺嘌呤(ADE1或 ADE2)等的基因功能物。其他酵母选择标记包括来自酿酒酵母的ARR3 基因，其赋予在亚砷酸盐存在下生长的酵母细胞亚砷酸盐抗性 (Bobrowicz等人，Yeast，13：819-828(1997)；Wysocki等人，J.Biol.Chem. 272：30061-30066(1997))。大量合适的整合位点包括美国公开的申请号 2007/0072262中列举的那些并包括与已知酿酒酵母和其它酵母或真菌 的基因座的同源物。用于将载体整合至酵母的方法是熟知的，例如，参 见WO2007136865。

因此，本发明表达载体可以编码选择标记，其用于在存在于培养 物中的细胞群体中鉴定和维持含有载体的宿主细胞。在一些环境下，选 择标记还可用于扩增表达载体的拷贝数。在诱导来自本发明表达载体的 转录以产生编码过表达的重组蛋白或Leloir途径酶的RNA后，RNA被 细胞因子翻译以产生重组蛋白或Leloir途径酶。

在酵母和其它真核细胞中，通过核糖体结合mRNA的5′帽和核糖 体延mRNA移动至第一个AUG起始密码子(在此处多肽合成可以开始) 而启动信使RNA(mRNA)的翻译。在酵母和哺乳动物细胞中的表达通常 不需要核糖体-结合位点和起始密码子之间特定数量的核苷酸(如有时在 原核表达系统中需要的)。但是，对于在酵母或哺乳动物宿主细胞中表 达，mRNA中第一个AUG密码子优选是期望的翻译起始密码子。

另外，当表达在酵母宿主细胞中进行时，长的非翻译引导序列例如 长于50-100个核苷酸的存在可以减弱mRNA的翻译。酵母mRNA引导 序列具有约50个核苷酸的平均长度，富含腺嘌呤，具有较少的二级结 构和几乎通常使用第一个AUG来起始。由于不具有这些特征的引导序 列可以降低蛋白翻译的效率，酵母引导序列优选用于在酵母宿主细胞中 过表达的基因产物或分子伴侣蛋白的表达。许多酵母引导序列的序列是 本领域技术人员已知的和可利用的，例如，参考Cigan等人(Gene 59： 1-18(1987)).

除了启动子、核糖体-结合位点和起始密码子的位置，可以影响得到 的表达水平的因素包括可复制的表达载体的拷贝数。通常通过载体复制 起点和与其关联的任意顺式作用控制元件来确定载体的拷贝数。例如， 编码调节的着丝粒的酵母游离载体的拷贝数的增加可通过诱导紧密排 列至着丝粒的启动子的转录来获得。另外，在酵母载体中编码酵母FLP 功能物还可增加载体的拷贝数。

通过组合来自可利用的载体的DNA片段，通过合成编码这类调节 元件的核酸分子或通过克隆新的调节元件并使新的调节元件位于该载 体，本领域技术人员还可容易地设计和制备包括上述序列的表达载体。 产生表达载体的方法是熟知的。过表达的DNA方法见于种种关于基因 工程的标准实验室手册中的任意。

本发明的表达载体可以通过以适当的方法将上述Leloir途径酶和重 组蛋白的编码区连接到启动子和用于控制基因表达的其它序列元件上 来制备。在该表达载体构建后，这类载体被转化至宿主细胞，其中可以 表达过表达的重组蛋白和Leloir途径酶。用表达载体转化酵母和其它低 等真核细胞的方法是本领域技术人员熟知的和容易利用的。例如，表达 载体可以通过几种方法包括醋酸锂、原生质体、电穿孔和类似方法中的 任意被转化至酵母细胞。

宿主细胞

酵母例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和多形汉逊酵母可用于细 胞培养，因为它们能够生长至高细胞密度和分泌大量重组蛋白。同样， 丝状真菌例如黑曲霉、镰孢菌属的种、粗糙脉胞菌等可用于以工业规模 产生本发明的糖蛋白。一般而言，用于实践本文的方法的低等真核细胞 包括通常不能利用半乳糖作为碳源的酵母和真菌。不能利用半乳糖作为 碳源的酵母的实例包括但不限于毕赤酵母属的甲基营养酵母，例如巴斯 德毕赤酵母，和酵母，例如S.kudriavzevii、C.glabrata、K.waltii和E. gossypii。酵母可用于糖蛋白的表达，因为它们可以是较经济地培养，提 供高产量，并且当适当修饰时，能够合适的糖基化。酵母特别提供了确 定的遗传学，允许快速转化、测试蛋白定位策略和容易的基因敲除技术。 合适的载体具有表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或 其他糖酵解酶，以及复制起点，终止序列等，如期望的。因此，上述宿 主细胞(其不能通常利用半乳糖作为碳源)已被基因工程化为表达半乳 糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向异构酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转 移酶活性以及任选地半乳糖通透酶活性，使得宿主细胞能够利用半乳糖 作为碳源。

低等真核细胞，特别是酵母，还可被基因修饰以使它们表达糖蛋白， 其中糖基化模式是人样或人源化的。这可通过如Gerngross等人，美国公 开的申请号2004/0018590所述去除选择的内源糖基化酶和/或提供外源 酶来获得。例如，宿主细胞可以被选择或工程化为缺乏1，6-甘露糖基转 移酶活性，其将另外添加甘露糖残基至糖蛋白的N-聚糖上。

在一个实施方案中，如本文所述被基因工程化为同化环境半乳糖作 为碳源的宿主细胞还如下所述被基因工程化为产生复合N-聚糖。这类宿 主细胞另外包括α1，2-甘露糖苷酶催化结构域(其融合至通常不与催化结 构域结合的细胞靶向信号肽并被选择将α1，2-甘露糖苷酶活性靶向宿主 细胞的ER或高尔基体)。重组糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体 产生包含Man₅GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白，例如包含主要Man₅GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利号7,029,872和美国公开的专 利申请号2004/0018590和2005/0170452公开了能够产生包含 Man₅GlcNAc₂糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。这些宿主细胞当 进一步如本文所教导的被基因工程化为表达半乳糖激酶活性、UDP-半乳 糖-4-差向异构酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳 糖通透酶活性时，能够利用半乳糖作为碳源。

紧接前述宿主细胞另外包括GlcNAc转移酶I(GnT I)催化结构域 (其融合至通常不与催化结构域结合的细胞靶向信号肽并被选择将 GlcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体)。重组糖蛋白经 过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖形的重组 糖蛋白，例如包含主要GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白组合物。 美国专利号7,029,872和美国公开的专利申请号2004/0018590和 2005/0170452公开了能够产生包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂的糖蛋白的低 等真核生物宿主细胞。上述细胞产生的糖蛋白可以体外用氨基己糖苷酶 处理以产生包含Man₅GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白。这些宿主细胞当进一 步如本文所教导的被基因工程化为表达半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖 -4-差向异构酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖 通透酶活性时，能够利用半乳糖作为碳源。

然后，紧接前述宿主细胞另外包括甘露糖苷酶II催化结构域(其 融合至通常不与催化结构域结合的细胞靶向信号肽并被选择将甘露糖 苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体)。重组糖蛋白经过宿主细 胞的ER或高尔基体产生包含GlcNAcMan₃GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白， 例如包含主要GlcNAcMan₃GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白组合物。美国专 利号7,029,872和美国公开的专利申请号2004/0230042公开了表达甘露 糖苷酶II酶和能够生产糖蛋白具有主要GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖形的 低等真核生物宿主细胞。上述细胞产生的糖蛋白可以体外用氨基己糖苷 酶处理以产生包含Man₃GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白。这些宿主细胞当进 一步如本文所教导的被基因工程化为表达半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖 -4-差向异构酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖 通透酶活性时，能够利用半乳糖作为碳源。

然后，紧接前述宿主细胞另外包括GlcNAc转移酶II(GnT II)催化 结构域(其融合至通常不与催化结构域结合的细胞靶向信号肽并被选择 将the GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体)。重组 糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G0)糖形的重组糖蛋白，例如包含主要 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872 和美国公开的专利申请号2004/0018590和2005/0170452公开了能够产 生包含GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。 上述细胞产生的糖蛋白可以体外用氨基己糖苷酶处理以产生包含 Man₃GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白。这些宿主细胞当进一步如本文所教导 的被基因工程化为表达半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向异构酶活 性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖通透酶活性时， 能够利用半乳糖作为碳源。

最后，紧接前述宿主细胞另外包括半乳糖基转移酶催化结构域(其 融合至通常不与催化结构域结合的细胞靶向信号肽并被选择将半乳糖 基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体)。重组糖蛋白经过宿主 细胞的ER或高尔基体产生包含GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G1)或 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G2)糖形或其混合物的重组糖蛋白，例如包 含主要GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G1)糖形或 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G2)糖形或其混合物的重组糖蛋白组合物。 美国专利号7,029,872和美国公开的专利申请号2006/0040353公开了能 够产生包含Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖形的糖蛋白的低等真核生物宿 主细胞。上述细胞产生的糖蛋白可以体外用半乳糖苷酶处理以产生包含 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白，例如包含主要 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白组合物。这些宿主细胞当进一 步如本文所教导的被基因工程化为表达半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖 -4-差向异构酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖 通透酶活性时，能够利用半乳糖作为碳源并能够生产这样的糖蛋白，其 中含有半乳糖的N-聚糖的比例大于未被基因工程化为包括上述Leloir 途径酶的宿主细胞中的比例。

在另一实施方案中，紧接前述宿主细胞(其如本文所公开的能够产 生具有半乳糖末端的复合N-聚糖并能够同化半乳糖作为碳源)可另外包 括唾液酸转移酶催化结构域(其融合至通常不与催化结构域结合的细胞 靶向信号肽并被选择将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基 体)。重组糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含主要 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖形或 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖形或其混合物的重组糖蛋白。对于低 等真核生物宿主细胞例如酵母和丝状真菌，有用的是宿主细胞另外包括 提供CMP-唾液酸用于转移至N-聚糖的方法。美国公开的专利申请号 2005/0260729公开了基因工程化低等真核细胞以具有CMP-唾液酸合成 途径的方法，和美国公开的专利申请号2006/0286637公开了基因工程 化低等真核细胞以产生唾液酸化的糖蛋白的方法。这些宿主细胞当进一 步如本文所教导的被基因工程化为表达半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖 -4-差向异构酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖 通透酶活性时，能够利用半乳糖作为碳源并能够生产这样的糖蛋白，其 中含有半乳糖的N-聚糖的比例大于未被基因工程化为包括上述Leloir 途径酶的宿主细胞中的比例。

在另一实施方案中，产生主要具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖的 糖蛋白的宿主细胞另外包括半乳糖基转移酶催化结构域(其融合至通常 不与催化结构域结合的细胞靶向信号肽并被选择将半乳糖基转移酶活 性靶向宿主细胞的ER或高尔基体)。重组糖蛋白经过宿主细胞的ER 或高尔基体产生包含主要GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白。 这些宿主细胞当进一步如本文所教导的被基因工程化为表达半乳糖激 酶活性、UDP-半乳糖-4-差向异构酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 活性以及任选地半乳糖通透酶活性时，能够利用半乳糖作为碳源。

在另一实施方案中，紧接前述宿主细胞(其如本文所公开的能够产 生具有半乳糖末端的杂合N-聚糖并能够同化半乳糖作为碳源)可另外包 括唾液酸转移酶催化结构域(其融合至通常不与催化结构域结合的细胞 靶向信号肽并被选择将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基 体)。重组糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含 NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂糖形的重组糖蛋白。这些宿主细胞当进 一步如本文所教导的被基因工程化为表达半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖 -4-差向异构酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖 通透酶活性时，能够利用半乳糖作为碳源。

多种前述宿主细胞另外包括一个或多个糖转运蛋白，例如 UDP-GlcNAc转运蛋白(例如乳酸克鲁维酵母和小家鼠(Mus musculus) UDP-GlcNAc转运蛋白)、UDP-半乳糖转运蛋白(例如黑腹果蝇UDP- 半乳糖转运蛋白)和CMP-唾液酸转运蛋白(例如人唾液酸转运蛋白)。因 为低等真核生物宿主细胞例如酵母和丝状真菌缺乏上述转运蛋白，优选 的是低等真核生物宿主细胞例如酵母和丝状真菌被基因工程化为包括 上述转运蛋白。

宿主细胞另外包括这样的细胞，其通过删除或破坏一个或多个β- 甘露糖基转移酶基因(例如BMT1，BMT2，BMT3和BMT4)被基因工程化 为消除具有α-甘露糖苷酶-抗性的N-聚糖的糖蛋白(参见，美国公开的专 利申请号2006/0211085)和通过删除或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因 PNO1和MNN4B之一或二者被基因工程化为消除具有磷酸甘露糖残基 的糖蛋白(参见例如，美国专利号7,198,921和7,259,007)，在另外的方 面，还可包括删除或破坏MNN4A基因。破坏包括破坏编码特定酶的开 放读码框或利用干扰RNA、反义RNA或类似物破坏编码一种或多种β- 甘露糖基转移酶和/或磷酸甘露糖基转移酶的开放读码框的表达或消除 编码一种或多种β-甘露糖基转移酶和/或磷酸甘露糖基转移酶的RNA 的翻译。宿主细胞可另外包括任意一种修饰为产生特定N-聚糖结构的前 述宿主细胞。

宿主细胞另外包括这样的低等真核细胞(例如酵母例如巴斯德毕赤 酵母)，其通过删除或破坏一个或多个蛋白O-甘露糖基转移酶 (Dol-P-Man：蛋白(Ser/Thr)甘露糖基转移酶基因)(PMT)被基因修饰以控 制糖蛋白的O-糖基化(参见美国专利号5,714,377)或如公开的国际申请 号WO 2007061631中公开的在Pmtp抑制剂和/或α-甘露糖苷酶存在下 生长，或二者。破坏包括破坏编码Pmtp的开放读码框或利用干扰RNA、 反义RNA或类似物破坏编码一个或多个Pmtp的开放读码框的表达或消 除编码一个或多个Pmtp的RNA的翻译。宿主细胞可另外包括任意一种 修饰为产生特定N-聚糖结构的前述宿主细胞。

Pmtp抑制剂包括但不限于苯亚甲基噻唑烷二酮类。可以利用的苯亚 甲基噻唑烷二酮的实例是5-[[3，4-双(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代 -2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚 甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸和5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2- 苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸.

在具体实施方案中，至少一个内源PMT基因的功能或表达被降低、 破坏或缺失。例如，在具体的实施方案中，至少一个选自PMT1、PMT2、 PMT3和PMT4基因的内源PMT基因的功能或表达被降低、破坏或缺 失；或在一个或多个PMT抑制剂存在下培养宿主细胞。在另外的实施 方案中，宿主细胞包括一个或多个PMT基因缺失或破坏以及在一个或 多个Pmtp抑制剂存在下培养宿主细胞。在这些实施方案的具体方面，宿 主细胞还表达分泌的α-1，2-甘露糖苷酶。

PMT缺失或破坏和/或Pmtp抑制剂通过降低O-糖基化占据 (occupancy)即通过降低在糖蛋白上被糖基化的O-糖基化位点的总数来 控制O-糖基化。进一步添加细胞分泌的α-1，2-甘露糖苷酶降低糖蛋白上 O-聚糖的甘露糖链长度来控制O-糖基化。因此，将PMT缺失或破坏和 /或Pmtp抑制剂与分泌的α-1，2-甘露糖苷酶的表达组合通过降低占据和 链长度来控制O-糖基化。在具体的情况中，确定PMT缺失或破坏、Pmtp 抑制剂和α-1，2-甘露糖苷酶的具体组合，经验上是因为具体的异源糖蛋 白(例如Fab和抗体)可通过具有不同效率程度的高尔基体被表达和转 运，因此可需要PMT缺失或破坏、Pmtp抑制剂和α-1，2-甘露糖苷酶的 具体组合。在另一方面，编码一个或多个内源甘露糖基转移酶的基因被 缺失。该缺失可以与提供分泌的α-1，2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制剂组 合或可以代替提供分泌的α-1，2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制剂。

因此，O-糖基化的控制可以用于在本文公开的宿主细胞中以更高的 总产量或适当组装的糖蛋白的产量生产具体糖蛋白。O-糖基化的降低或 消除看起来具有组装和转运完整抗体和Fab片段的优势效果，因为它们 穿越分泌途径和被转运至细胞表面。因此，在O-糖基化被控制的细胞中， 适当组装的抗体或Fab片段的产率比在O-糖基化未被控制的宿主细胞 中得到的产率增加。

因此，预期的是已被基因修饰的宿主细胞，以产生糖蛋白，其中在 糖蛋白上的主要N-聚糖包括但不限于Man₈GlcNAc₂、Man₇GlcNAc₂、 Man₆GlcNAc₂、Man₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、 GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、 Man₃GlcNAc₂、GlcNAc_(1-4)Man₂GlcNAc₂、 Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂、 NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂。另外包括的是这样的宿主细 胞，其产生具有前述N-聚糖的具体混合物的糖蛋白。

本文中的宿主细胞和方法用于产生广泛的重组蛋白和糖蛋白。可以 在本文公开的宿主细胞中产生的重组蛋白和糖蛋白的实例包括但不限 于红细胞生成素(EPO)，细胞因子例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ和 干扰素ω，和粒细胞集落刺激因子(GCSF)，GM-CSF，凝固因子例如因 子VIII、因子IX和人蛋白C，抗凝血酶III，凝血酶，可溶性IgE受体 α-链，免疫球蛋白例如IgG、IgG片段、IgG融合体和IgM，免疫粘附素 和其它Fc融合蛋白例如可溶性TNF受体-Fc融合蛋白，RAGE-Fc融 合蛋白，白细胞介素，尿激酶，糜蛋白酶和尿胰蛋白酶抑制剂，IGF-结 合蛋白，表皮生长因子，生长激素释放因子，膜联蛋白V融合蛋白， 制管张素，血管内皮生长因子-2，骨髓样前体抑制因子-1，骨保护蛋白， α-1-抗胰蛋白酶，甲胎蛋白，DNA酶II，人纤溶酶原的三环3，葡糖脑 苷脂酶，TNF结合蛋白1，促卵泡激素，细胞毒性T淋巴细胞相关抗 原4-Ig，跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体，胰高血糖素样蛋白1 和IL-2受体激动剂。

本文公开的本发明的重组宿主细胞特别用于生产抗体、Fc融合蛋 白等，期望的是与在进行如本文所教导的修饰之前的宿主细胞中获得的 抗体组合物的半乳糖百分比相比，在重组宿主细胞中提供增加的含有半 乳糖的N-聚糖的百分比的抗体组合物。一般而言，宿主细胞能够使得这 样的抗体组合物产生，其中所述G0∶G1/G2糖形的比值小于2∶1。可以在 本文中的宿主细胞中产生并具有G0∶G1/G2的比值小于2∶1的抗体的实 例包括但不限于人抗体、人源化的抗体、嵌合抗体、重链抗体(例如骆 驼(camel或llama))。具体抗体包括但不限于以其通用名称(靶)引 用的以下抗体：莫罗单抗-CD3(抗-CD3受体抗体)、阿昔单抗(抗-CD41 7E3抗体)、利妥昔单抗(抗-CD20抗体)、达珠单抗(抗-CD25抗体)、 巴利昔单抗(抗-CD25抗体)、帕利珠单抗(抗-RSV(呼吸道合胞病 毒)抗体)、英夫利昔单抗(抗-TNFα抗体)、曲妥珠单抗(抗-Her2抗 体)、吉姆单抗奥佐米星(抗-CD33抗体)、阿仑单抗(抗-CD52抗 体)、替伊莫单抗(抗-CD20抗体)、阿达木单抗(抗-TNFα抗体)、 奥马珠单抗(抗-IgE抗体)、托西莫单抗-¹³¹I(抗-CD20抗体的碘化的 衍生物)、依法利珠单抗(抗-CD11a抗体)、西妥昔单抗(抗-EGF受 体抗体)、戈利木单抗(抗-TNFα抗体)、贝伐单抗(抗VEGF-A抗 体)及其变体。可以在本文中的宿主细胞中产生的Fc-融合蛋白的实例包 括但不限于依那西普(TNFR-Fc融合蛋白)、FGF-21-Fc融合蛋白、 GLP-1-Fc融合蛋白、RAGE-Fc融合蛋白、EPO-Fc融合蛋白、ActRIIA-Fc 融合蛋白、ActRIIB-Fc融合蛋白、胰高血糖素-Fc融合物、泌酸调节肽 -Fc-融合物及其类似物和变体。

本文公开的重组细胞可用于产生适合于化学缀合异源的肽或药物 分子的抗体和Fc片段。例如WO2005047334、WO2005047336、 WO2005047337和WO2006107124公开了将肽或药物分子与Fc片段化 学缀合。EP1180121、EP1105409和US6593295公开了将血液组分与肽 等化学缀合，其包括完整抗体。

如本文所教导的宿主细胞和/或编码Leloir途径酶的多种组合的质 粒载体可以作为试剂盒提供，其提供用于产生表达异源蛋白的重组巴斯 德毕赤酵母的选择系统。巴斯德毕赤酵母宿主细胞被基因工程化为表达 选自半乳糖激酶、UDP-半乳糖-4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转 移酶的Leloir途径酶中的一种或两种。任选地，宿主细胞也可表达半乳 糖通透酶。克隆载体包括多克隆位点和编码宿主细胞中未提供的Leloir 途径酶的表达盒。载体可另外包括在多克隆位点两侧的巴斯德毕赤酵母 可操纵的启动子和转录终止序列以及可另外包括用于将载体靶向到宿 主细胞基因组中的具体位置的靶向序列。在一些实施方案中，试剂盒提 供这样的载体，其编码所有三个Leloir途径酶(半乳糖激酶、UDP-半乳 糖-4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶)和包括多克隆位点和缺 乏三种Leloir途径酶的宿主细胞。试剂盒应另外包括说明书、载体图谱 等。

以下实施例意图是促进对本发明的进一步理解。

实施例1

在该实施例中，通常根据Davidson等人在美国公开的申请号 2006/0040353中公开的方法构建能够产生含有半乳糖的N-聚糖的巴斯 德毕赤酵母宿主细胞。本文的方法可用于将其他物种的通常不能利用半 乳糖作为碳源的重组宿主细胞变成能够利用半乳糖作为单一碳源的重 组宿主细胞。

半乳糖基转移酶I嵌合酶。利用PCR引物RCD192 (5’-GCCGCGACCTGAGCC GCCTGCCCCAAC-3’(SEQ ID NO：1))和 RCD186(5’-CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACTGT-3’(SEQ ID NO：2)) 从人肾脏cDNA(Clontech)PCR扩增智人(Homo sapiens)β-1，4-半乳糖 基转移酶I基因(hGalTI，Genbank AH003575)。该PCR产物被克隆至 pCR2.1载体(Invitrogen)并测序。从该克隆进行PCR重叠突变发生用于 三个目的：1)去除开放读码框内的NotI位点同时维持野生型蛋白序列， 2)在内源跨膜结构域的立即下游截短蛋白以仅提供催化结构域和3)在 5’和3’端分别引入AscI和PacI位点用于克隆。为了进行PCR重叠突 变发生，利用PCR引物RCD198 (5’-CTTAGGCGCGCCGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCC-3’(SEQ ID  NO：3))和RCD201(5’-GGGGCATATCTGCCGCCCATC-3’(SEQ ID  NO：4))PCR扩增基因的5’端直至NotI位点和利用PCR引物RCD200 (5’-GATGGGCGGCAGATATGCCCC-3’(SEQ ID NO：5))和RCD199 (5’-CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’(SEQ ID  NO：6))PCR扩增3’端。用引物RCD198和RCD199将产物在一起重叠 以重合成具有野生型氨基酸序列同时去除NotI位点的截短的编码半乳 糖基转移酶的开放读码框(ORF)。新的hGalTIβPCR催化结构域产物 被克隆至pCR2.1载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)并测序。引入的AscI和 PacI位点用它们识别的限制酶切割并将DNA片段亚克隆进质粒 pRCD259的PpGAPDH启动子下游以产生质粒pRCD260。编码 hGalTI43催化结构域(缺乏最先的43个氨基酸；SEQ ID NO：50)的核 苷酸序列显示于SEQ ID NO：49。

来自酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母的将蛋白靶向到 高尔基体中的各种位置的酵母引导序列文库被连接到该载体NotI和 AscI位点之间，从而将这些引导编码序列符合读框地与编码hGalTIβ43 催化结构域的开放读码框融合。上述GalT融合蛋白的组合文库在 YSH44中表达并通过从来自各个转化子的纯化的K3释放N-聚糖和用 MALDI-TOF MS测定它们各自分子量分析得到的转化子。巴斯德毕赤酵 母菌株YSH44表达人纤溶酶原的三环3结构域(K3)，其为实质上均 一的具有双触角末端GlcNAc残基的复合糖形(GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂， 参见图1)。活性构建体之一是Mnn2-hGalTIβ43，其编码融合蛋白，所 述融合蛋白包含酿酒酵母Mnn2靶向肽的的N-末端(氨基酸1-36(53) SEQ ID NO：20)融合至hGalTIβ43催化结构域的N-末端(氨基酸44-398； SEQ ID NO：50)。引导序列含有酿酒酵母MNN2基因最先的108bp并 且该序列确实已被插入pRCD260的NotI和AscI位点之间以产生质粒 pXB53。用XbaI线性化质粒pXB53并转化至酵母菌株YSH44以产生 菌株YSH71。菌株YSH44已描述在美国公开的申请号20070037248、 20060040353、20050208617和20040230042中以及菌株YSH71已描述 在美国公开的申请号20060040353中。

如图3C所示，菌株YSH71产生的一小部分(约10％)N-聚糖具有 与单个半乳糖添加到K3上的GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G0)N-聚糖底物一 致的质量以产生GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G1)N-聚糖，而其余的N-聚 糖与母本菌株YSH44产生的N-聚糖相同(图3B)。图3A显示野生型酵 母中产生的N-聚糖。

我们认为对于不完全的半乳糖转移存在几种解释。这些解释包括较 差的UDP-半乳糖转运、较低的内源水平UDP-半乳糖或亚最适的 (suboptimal)GalT活性。看起来半乳糖转移到N-聚糖上可能较低，因 为菌株可能需要转运蛋白以将UDP-半乳糖从细胞质转位至高尔基体 (Ishida等人，J.Biochem.120：1074-1078(1996)；Miura等人，J.Biochem (Tokyo)120：236-241(1996)；Tabuchi等人，Biochem.Biophys.Res.Com. 232：121-125(1997)；Segawa等人，FEBS Letts.451：295-298(1999))。转运 蛋白是具有多个跨膜结构域的复合蛋白，其可以不适当地定位于异源宿 主。但是，几种糖核苷酸转运蛋白，包括UDP-半乳糖转运蛋白已在异 源系统中活跃表达(Sun-Wada等人，J.Biochem.(Tokyo)123：912-917 (1998)；Segawa等人Eur.J.Biochem.269：128-138(2002)；Kainuma等人， Glycobiol.9：133-141(1999)；Choi等人，Proc Natl Acad Sci U S A 100(9)： 5022-5027(2003))。为确保UDP-半乳糖有效转运至高尔基体，编码UDP- 半乳糖转运蛋白的黑腹果蝇基因DmUGT(GenBank登记号AB055493) 被克隆并将该克隆如下转化至表达MNN2-hGalTIβ43构建体的菌株 YSH71。

UDP-半乳糖转运蛋白的克隆。利用PCR引物DmUGT-5’(5’- GGCTCGAGCGGC CGCCACCATGAATAGCATACACATGAACGCCAATACG-3’(SEQ ID  NO：7))和DmUGT-3’(5’- CCCTCGAGTTAATTAACTAGACGCGCGGCAGCAGCTTCTCCTCATC G-3’(SEQ ID NO：8))，从黑腹果蝇cDNA文库(UC Berkeley Drosophila 基因组Project，卵巢λ-ZAP文库GM)PCR扩增编码UDP半乳糖转运 蛋白的黑腹果蝇基因(GenBank AB055493)，称为DmUGT，并将PCR 扩增的DNA片段克隆至pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)并测序。然后 利用NotI和PacI位点将该开放读码框亚克隆至质粒pRCD393的 PpOCH1启动子下游NotI和PacI位点之间以产生质粒pSH263。编码 DmUGT的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：37和DmUGT的氨基酸序列显 示于SEQ ID NO：38。将该质粒用AgeI线性化并转化至菌株YSH71以 产生菌株YSH80。但是，当编码DmUGT的质粒被转化至YSH71时， 发现K3的N-聚糖分布情况没有显著变化。因此，我们决定将精力集中 于增强UDP-半乳糖细胞内库(pool)。

因为巴斯德毕赤酵母不能同化半乳糖作为碳源(Kurtzman Pichia. The Yeasts：A Taxonomic Study.C.P.a.F.Kurtzman，J.W.Amsterdam， Elsevier Science Publ.：273-352(1998))，我们推测菌株中的UDP-半乳糖 库可能不充分。在半乳糖同化生物包括细菌和哺乳动物中保守的UDP- 半乳糖4-差向异构酶催化Leloir途径的第三步。该酶通常位于真核细 胞的细胞质并负责UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的可逆转换(Allard等人， 细胞.Mol.Life Sci.58：1650-1665(2001))。我们推论异源UDP-半乳糖4- 差向异构酶的表达将产生细胞质UDP-半乳糖库，去转运至高尔基体后， 将使得半乳糖转移酶将半乳糖转移到N-聚糖上。

UDP-半乳糖4-差向异构酶的克隆。从粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)克隆之前未表征的基因，以下命名为 SpGALE，其编码与已知的UDP-半乳糖4-差向异构酶具有显著同一性的 蛋白。利用PCR引物GALE2-L(5’-ATGACTGGTGTTCATGAAGGG-3’ (SEQ ID NO：9))和GALE2-R(5’-TTACTTATA TGTCTTGGTATG-3’ ((SEQ ID NO：10))，从粟酒裂殖酵母(ATCC24843)基因组DNA PCR扩 增编码预测的UDP半乳糖-4-差向异构酶(GenBank NC_003423)的1.1 Kb粟酒裂殖酵母基因，称为SpGALE。PCR扩增的产物被克隆至 pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)并测序。测序显示在+66位存在内含子 (175bp)。为了消除内含子，设计上游PCR引物GD1 (5’-GCGGCCGCATGA CTGGTGTTCA TGAAGGGACT GTGTTGGTTA CTGGCGGCGC TGGTTATATA GGTTCTCATA CGTGCGTTGT TTTGTTAGAA AA-3’((SEQ ID NO：11))，其具有NotI位点，位于内含 子上游第66个碱基处，然后在内含子之前20个碱基和下游PCR引物 GD2(5’-TTAATTAATT ACTTATATGT CTTGGTATG-3’((SEQ ID  NO：12))具有PacI位点。利用引物GD1和GD2以从pCR2.1亚克隆扩 增SpGALE内含子缺少的基因并将产物再克隆至pCR2.1并测序。然后 将SpGALE在NotI和PacI位点之间分别亚克隆至质粒pRCD402和 pRCD403以产生质粒pRCD406(P_OCH1-SpGALE-CYC1TT)和pRCD407 (P_SEC4-SpGALE-CYC1TT)。这些质粒已在之前的美国公开的申请号 20060040353中描述。编码不含内含子的SpGALE的核苷酸序列显示于 SEQ ID NO：35和氨基酸序列显示于SEQ ID NO：36。

人UDP半乳糖-4-差向异构酶(hGalE)具有SEQ ID NO：48所示的氨 基酸序列，其由SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列编码。可以利用hGalE 代替SpGALE。

双GalT/半乳糖-4-差向异构酶构建体的构建。含有 ScMNN2-hGalTIβ43融合基因的质粒pXB53用XhoI线性化并用T4 DNA聚合酶产生平端。然后用XhoI和SphI并将末端用T4DNA聚合 酶产生平端从质粒pRCD406去除P_PpOCH1SpGALE-CYC1TT表达盒，并 将片段插入上述pXB53质粒以产生质粒pRCD425。将该质粒用XbaI 线性化并转化至菌株YSH44以产生菌株RDP52，其已在之前的美国公 开的申请号20060040353中描述。通过MALDI-TOF MS分析从几种转 化子分离的纯化的K3上的N-聚糖。如图3D所示，发现相当比例的N- 聚糖已获得与两个(约20％G2：Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)或单个半乳糖 部分(约40％G1：Gal₁GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)添加到G0 (GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)底物上的一致的质量，而其余的N-聚糖保持 与YSH44母本中发现的质量没有改变(图3B)，即G0。

三GalT/半乳糖-4-差向异构酶/UDP半乳糖转运蛋白构建体的构建。 通过用SacI消化将含有P_OCH1-DmUGT-CYC1TT的G418^R质粒pSH263 线性化并用T4 DNA聚合酶进行末端平端化。通过用XhoI和SphI消化 将P_SEC4-SpGALE-CYC1TT表达盒从质粒pRCD407去除并用T4 DNA 聚合酶进行末端平端化。然后将平末端的SpGALE片段插入上述 pSH263以产生质粒pRCD446。通过用BglII/BamHI消化从质粒pXB53 释放P_GAPDHScMNN2-hGalTIβ43-CYC1TT表达盒并用T4 DNA聚合酶进 行末端平端化。然后将平末端的hGalTI-53插入pRCD446的平端的 EcoRI位点以产生质粒pRCD465，其是含有hGalTI-53、SpGALE和 DmUGT的三G418R质粒。用AgeI线性化质粒pRCD465并转化至菌 株YSH44以产生菌株RDP80，其如美国公开的申请号20060040353中 描述的。通过MALDI-TOF MS分析从菌株产生的分泌的K3释放的N- 聚糖。发现N-聚糖具有定量添加两个半乳糖残基到G0底物上一致的 质量以产生人半乳糖基化、双触角复合N-聚糖G2 (Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)(图3E)。该N-聚糖的体外β-半乳糖苷酶消 化产生对应于去除两个半乳糖残基的降低的质量，得到G0 (GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)(图3F)。

另外，在CMP-唾液酸存在下用大鼠α-2，6-N-唾液酸转移酶体外处理 从菌株RDP80纯化的K3产生几乎均一地转换成 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(图3G)。这些结果表明通过(1)充分 的细胞内UDP-半乳糖库的代谢工程，(2)活性的和适当定位的GalT的 表达和(3)通过活性UDP-半乳糖转运蛋白的UDP-半乳糖至高尔基体的 易位，可获得在巴斯德毕赤酵母产生的复合N-聚糖高效延伸。但是，半 乳糖转移的效率通过进一步包括将Leloir途径的酶引入宿主细胞来改 进，如实施例2所示。

菌株和培养基。大肠杆菌菌株TOP10或DH5α用于重组DNA工作。 来源于菌株JC308(J.Cregg，Claremont，CA)的巴斯德毕赤酵母菌株 YSH44(Hamilton等人，Science 301：1244-1246(2003))用于产生多种酵 母菌株。酵母菌株的转化通过如前报道的电穿孔进行(Cregg，等人，Mol. Biotechnol.16：23-52(2000))。在室温在96孔板形式中进行蛋白表达(除 了生物反应器实验)，使用缓冲的甘油-复合培养基(BMGY)，由1％酵 母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0，1.34％酵母氮源， 4X10^-5％生物素和1％甘油组成，作为生长培养基；以及缓冲的甲醇-复 合培养基(BMMY)，由1％甲醇替代甘油的BMGY组成作为诱导培养基。 YPD是1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖和2％琼脂。

限制和修饰酶来自New England BioLabs(Beverly，MA)。寡核苷酸 获自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)。β-半乳糖苷酶获自QA bio(San Mateo，CA)。96孔裂解物清除板(lysate-clearing plate)来自 Promega(Madison，WI)。蛋白-结合96孔板来自Millipore(Bedford，MA)。 盐和缓冲剂来自Sigma(St.Louis，MO)。MALDI基质来自Aldrich (Milwaukee，WI)。

蛋白纯化和N-聚糖分析。K3纯化如前述(Choi等人，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.100：5022-5027(2003))。利用获自New England BioLabs (Beverly，MA)的N-糖苷酶F从K3释放N-聚糖，如前述(Choi等人， ibid.)。利用Applied Bio系统(Foster City，CA)的Voyager DE PRO线性 MALDI-TOF质谱仪测定聚糖的分子量，如前述(Choi等人，ibid.)。

生物反应器培养。用1mL的种子培养物(参见摇瓶培养)接种含有 150mL BMGY培养基的500mL带挡板的容量瓶。在24℃将接种物培 养至OD600为4-6(大约18小时)。然后将来自接种培养物的细胞离心 并重悬至50mL发酵培养基(每升培养基：CaSO₄.2H₂O 0.30g，K₂SO₄6.00g，MgSO₄.7H₂O 5.00g，甘油40.0g，PTM₁盐2.0mL，生物素 4x10^-3g，H₃PO₄(85％)30mL，PTM1盐每升：CuSO₄.H₂O 6.00g，NaI 0.08g，MnSO₄.7H₂O 3.00g，NaMoO₄.2H₂O 0.20g，H₃BO₃ 0.02g， CoCl₂.6H₂O 0.50g，ZnCl₂ 20.0g，FeSO₄.7H₂O 65.0g，生物素0.20g， H₂SO₄(98％)5.00mL)。

在3升碟形底(1.5升初始进料体积)Applikon生物反应器中进行 发酵。发酵罐在24℃的温度下以分批补料模式运行，并将pH控制在 4.5±0.1利用30％氢氧化铵。通过调整搅拌速率(450-900rpm)和纯氧提 供，将溶解氧维持在40％以上，相对于在1atm下用空气饱和。空气流 动速率维持在1vvm。当在分批培养期(the batch phase)初始甘油(40g/L) 被耗尽时，这是DO增加的指示，将含有12ml/L PTM1盐的50％甘油 溶液以12mL/L/h的进料速率补料直到达到所期望的生物质浓度。在半 小时饥饿期后，起始甲醇补料(含有12mL/L PTM1的100％甲醇)。甲 醇进料速率用于控制发酵罐中甲醇浓度在0.2-0.5％之间。利用位于发 酵罐的排出气中TGS气体传感器(TGS822，来自Figaro Engineering Inc.) 在线测量甲醇浓度。每8小时对发酵罐中进行取样和分析生物质 (OD600，湿细胞重和细胞计数)，剩余碳源水平(利用Aminex 87H通过 HPLC测量甘油和甲醇)和细胞外蛋白含量(通过SDS page和Bio-Rad 蛋白测定)。

体外β-半乳糖苷酶消化。来自RDP80的N-聚糖与β1，4-半乳糖苷 酶(QA bio，San Mateo，CA)在50mM NH₄HCO₃，pH6.0中在37℃孵育 16-20小时。

体外唾液酸转移。从菌株RDP80纯化的K3用作唾液酸转移的底 物。将200μg该蛋白与50μg CMP-唾液酸和15mU大鼠重组 α-(2，6)-(N)-唾液酸转移酶(来自EMD Biosciences(San Diego，CA， formerly Calbiochem))在50mM NH₄HCO₃，pH6.0中在37℃孵育16-20 小时。然后通过PNGaseF消化释放N-聚糖并通过MALDI-TOF MS检测。

实施例2

UDP-半乳糖4-差向异构酶催化Leloir途径的第三步(图4)。如实施 例1所示，在糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株中编码该酶的基因的异源 表达引起UDP-半乳糖细胞内库的产生，如表达该异源基因的菌株中半 乳糖转移显著增加所证实的。但是，还如所示的，仅添加该酶不能赋予 巴斯德毕赤酵母菌株在半乳糖(作为单一碳源)上生长的能力(参见图 7，菌株RDP578-1)。因此，将酿酒酵母中Leloir途径的其余酶引入实施 例1的各种菌株中。因此，在该实施例中，构建了能够利用半乳糖作为 单一碳源的巴斯德毕赤酵母宿主细胞。本文的方法可用于将通常不能利 用半乳糖作为碳源的其他物种的重组宿主细胞制备成能够利用半乳糖 作为单一碳源的重组宿主细胞。

酿酒酵母GAL1的克隆。利用PCR引物PB158(5’- TTAGCGGCCGCAGGAATGACTAAATCTCATTCA-3’(SEQ ID NO：13)) 和PB159(5’-AACTTAATTAAGCTTATAATTCATATAGACAGC-3’ (SEQ ID NO：14))，从酿酒酵母基因组DNA(菌株W303，标准smash和 grab基因组DNA制备)PCR扩增编码半乳糖激酶(GenBank NP_009576) 的酿酒酵母基因(称为ScGAL1)，将PCR扩增的DNA片段克隆至 pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)并测序。得到的质粒命名为pRCD917。 用NotI和PacI将编码半乳糖激酶的DNA片段从质粒释放并将DNA片 段亚克隆进质粒pGLY894的巴斯德毕赤酵母HHT1强组成型启动子下 游NotI和PacI位点之间以产生质粒pGLY939。半乳糖激酶具有SEQ ID  NO：40所示的氨基酸序列并由SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列编码。

酿酒酵母GAL2的克隆。利用PCR引物PB156(5’- TTAGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：15))和PB157(5’-AACTTAATTAA-3’ (SEQ ID NO：16))从酿酒酵母基因组DNA(菌株W303，标准“smash and  grab”基因组DNA制备)PCR扩增编码半乳糖通透酶(GenBank NP_013182)的酿酒酵母基因(称为ScGAL2)，将PCR扩增的DNA 片段亚克隆进pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)并测序。得到的质粒命 名为pPB290。用NotI和PacI将编码半乳糖通透酶的DNA片段从质粒 释放并将DNA片段亚克隆进质粒pJN664的PpPMA1启动子下游 NotI和PacI位点之间以产生质粒pPB292。半乳糖通透酶具有SEQ ID  NO：44所示的氨基酸序列并由SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列编码。

酿酒酵母GAL7的克隆。利用PCR引物PB160(5’-TTAGCGGCCG CAGGAATGAC TGCTGAAGAA TT-3’(SEQ ID NO：17))和PB161(5’- AACTTAATTA AGCTTACAGT CTTTGTAGAT AATC-3’(SEQ ID  NO：18)从酿酒酵母基因组DNA(菌株W303，标准smash and grab基因 组DNA制备)PCR扩增编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GenBank  NP_009574)的酿酒酵母基因(称为ScGAL7)，将PCR扩增的DNA 片段克隆至pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)并测序。得到的质粒命名 为pRCD918。用NotI和PacI将编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的DNA 片段从质粒释放并将DNA片段亚克隆进质粒pGLY143的PpPMA1强 组成型启动子下游NotI和PacI位点之间以产生质粒pGLY940。个别地， NotI和PacI位点还用于亚克隆该ORF至质粒pRCD830巴斯德毕赤酵 母TEF1强组成型启动子下游的NotI/PacI处以产生质粒pRCD929。半 乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列并由 SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列编码。

三ScGAL1/ScGAL7/ScGAL2构建体的构建。将来自pGLY917的 ScGAL1开放读码框亚克隆至pJN702，一种巴斯德毕赤酵母his1敲除 载体，具有巴斯德毕赤酵母ARG1选择标记(his1::ARG1，参见美国专 利号7,479,389)且还含有P_GAPDH-启动子表达盒；含有P_GAPDH-ScGAL1融 合的这种新的载体命名为pRCD928。将来自pGLY929的P_TEF1-ScGAL7 表达盒亚克隆至pGLY928，新的载体命名为pGLY946a。下一步，将来 自pRCD634的P_OCH1-DmUGT(高尔基体UDP-半乳糖转运蛋白)表达盒 亚克隆至pGLY946a以产生pGLY956b。最后，将来自pPB292的 P_GAPDH-ScGAL2表达盒亚克隆至pRCD956b以产生质粒pRCD977b(参 见图6)。质粒pRCD977b含有DmUGT、ScGAL1、ScGAL7和ScGAL2 表达盒并具有ARG1显性选择标记盒。

双ScGAL1/ScGAL7构建体的构建。将来自pGLY939的 P_TEF1-ScGAL1表达盒亚克隆至pGLY941，一种敲入载体，具有巴斯德毕 赤酵母ARG1选择标记、TRP1基因座敲入区、还含有P_GAPDH-hGalTIβ 表达盒，该新的载体命名为pGLY952。将来自pGLY940的P_PMA1-ScGAL7 表达盒亚克隆至pGLY952，新的载体命名为pGLY955。最后，将诺尔 丝菌素抗性表达盒(NATR)从pGLY597(最初来自pAG25，来自 EROSCARF，Scientific Research and Development GmbH，Daimlerstrasse  13a，D-61352 Bad Homburg，Germany，参见Goldstein等人，1999，Yeast  15：1541)亚克隆至pGLY952以产生质粒pGLY1418(参见图12)，其含 有hGalTIβ、ScGAL1和ScGAL7表达盒并具有NAT^R显性选择标记盒。

具有所有三个基因的单一整合质粒pRCD977b(图6)被转化至巴斯 德毕赤酵母菌株RDP578-1以产生菌株RDP635-1、-2和-3。菌株 RDP578-1已含有异源基因和基因敲除用于产生含有末端β-1，4-半乳糖 残基的人N-聚糖(参见图5和实施例3用于构建体)。菌株RDP578-1也 包括编码酿酒酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶编码基因ScGAL10的表 达盒并表达测试蛋白人三环3。得到的菌株RDP635-1、-2和-3具有两个 拷贝的DmUGT半乳糖转运蛋白。

母本菌株RDP578-1和具有ScGAL1、ScGAL2、ScGAL7和ScGAL10 基因的转化子(RDP635-1、-2和-3)在含有葡萄糖、半乳糖或无碳源的最 低培养基生长五天然后拍照。有意思的是，尽管具有分泌具有半乳糖末 端的N-聚糖的蛋白的能力，RDP578-1显示出不能同化半乳糖，同时在 葡萄糖上正常生长，如野生型巴斯德毕赤酵母所期望的。但是，表达 ScGAL1、ScGAL2和ScGAL7基因的转化子能够同化半乳糖，如图7所 示。如期望的，在缺乏碳源的平板上观察到最低生长。这些结果表明可 以构建重组巴斯德毕赤酵母，当与Leloir半乳糖同化途径的基础结构(但 不是调节)元件重构时其可同化半乳糖作为碳源。

在糖工程化的巴斯德毕赤酵母中表达的Fc第297位Asn残基上 N-聚糖的测定。人IgG的Fc部分在每个重链二聚体上含有单个N-聚糖 位点(Asn297，Kabat numbering)，其通常含有不同于其他分泌的人蛋白 的N-聚糖分布情况。通常地，天然存在的人抗体含有具有末端GlcNAc 和一定量末端半乳糖的N-聚糖，其基于多种因素而不同，并很少含有显 著量的末端唾液酸。在证明N-聚糖的高水平末端β-1，4-半乳糖后，我们 试图测定在这类糖工程化的酵母菌株产生的抗体上观察到的N-聚糖分 布情况。因此，用在AOX1启动子的控制下编码人免疫球蛋白G1(IgG1) 重链的Fc结构域或C-末端半部分的质粒(pBK138)转化已被基因工程 化为产生具有末端半乳糖的N-聚糖的巴斯德毕赤酵母菌株(YGB02；参 见图8和实施例4)。由PCR鉴定的选择的阳性克隆命名为PBP317-36 (图8和实施例4)。该菌株在摇瓶中生长并用甲醇作为单一碳源诱导。 通过离心收获上清并通过蛋白A亲和层析进行纯化。纯化的蛋白在 SDS-PAGE上分离并进行考马斯染色。观察到具有期望大小的标记的条 带。然后将纯化的蛋白进行PNGase消化并通过MALDI-TOF MS分析释 放的N-聚糖。得到的N-聚糖(图10A)显示与具有末端GlcNAc的复合人 核心结构(G0：GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)一致的主要质量，较少种类具有 单个末端半乳糖(G1：GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)和次要种类(minor物 种)具有用半乳糖加帽复合种类的两个臂(G2： Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)。这些种类的质量不同于预测的文献中报道 的规范值，原因在于缺乏单个果糖残基。糖工程化的酵母菌株不含有内 源岩藻糖基转移酶，因此缺乏将果糖添加至核心人N-聚糖结构的内在性 质。还观察到与Man₅GlcNAc₂一致的另一次要种类。

然后将上述菌株PBP317-36(其表达组装具有末端半乳糖的人样N- 聚糖所需的糖基化活性和还表达SpGALE(UDP-半乳糖4-差向异构 酶))基因工程化为能够利用外源半乳糖作为碳源并以代谢工程化的方 式控制N-糖基化。构建在组成型启动子控制下表达ScGAL1和ScGAL7 的整合质粒pGLY954(图9)并将其转化至巴斯德毕赤酵母菌株 PBP317-36。质粒pGLY954赋予菌株PBP317-36(其已含有SpGALE UDP-半乳糖差向异构酶，图8)在半乳糖(作为单一碳源)上生长的能 力。该gal+菌株命名为RDP783。因为尽管我们没有将半乳糖通透酶引 入至细胞，细胞仍能够利用半乳糖作为碳源，我们得出结论：对巴斯德 毕赤酵母是内源的一般己糖转运蛋白能够充分穿过细胞膜转运半乳糖。

巴斯德毕赤酵母菌株PBP317-36和RDP783具有在甲醇-诱导型 AOX1启动子控制下编码人Fc结构域作为分泌的报告子蛋白的整合质 粒构建体。菌株PBP317-36和RDP783在标准培养基中在摇瓶中培养， 所述标准培养基含有甘油和在甲醇作为单一碳源存在下诱导或用甲醇 与不同浓度葡萄糖或半乳糖组合诱导。收获的上清蛋白通过蛋白A被亲 和纯化，进行PNGase消化通过MALDI-TOF MS分析。从菌株RDP783 的人Fc释放的N-聚糖产生与用甲醇单独诱导或在葡萄糖或甘露糖存 在下诱导后在PBP317-36中观察到的分布情况类似的N-聚糖，具有主要 糖形G0(GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)(图10)。但是，外源半乳糖给料后，菌 株RDP783(但不是母本菌株PBP317-36)产生在人Fc上的含有半乳糖 的N-聚糖的剂量依赖增加，其主要糖形现在转移到 G1(GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)且在完全地β-1，4-半乳糖加帽的糖形G2 (Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)中污染增加(图10)。

最后，为证明用人Fc观察到的利用外源半乳糖控制糖基化的能力 可应用于全长单克隆抗体，产生糖工程化的酵母菌株YDX477(图11，实 施例5)，其表达抗-Her2单克隆抗体。该菌株还工程化为转移G2形的 人N-聚糖(Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)到分泌的糖蛋白上。在mAb-A 的表达后N-聚糖的释放显示N-聚糖模式(图13A)，其由与G0 (GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)一致的主要峰组成，具有与G1 (GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)一致的次主要峰，以及G2 (Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)和M5(Man₅GlcNAc₂)的次要峰。该数据与对 于人IgG1的截短的Fc部分观察到的相似并且是期望的，因为在相同残 基处(Asn-297)N-糖基化。构建具有ScGAL1和ScGAL7的整合质粒 pGLY1418(图12)和转化至巴斯德毕赤酵母菌株YDX477以制备菌株 RDP968-1。该质粒赋予菌株YDX477(其已含有SpGALE UDP-半乳糖差 向异构酶，图11)在半乳糖(作为单一碳源)上生长的能力。

菌株YDX477和RDP968-1在标准培养基中在摇瓶中培养，所述标 准培养基含有甘油和在甲醇作为单一碳源存在下诱导或用甲醇与不同 浓度半乳糖组合诱导。收获的上清蛋白通过蛋白A被亲和纯化，进行 PNGase消化通过MALDI-TOF MS分析。两种菌株产生与之前用甲醇单 独诱导或在葡萄糖或甘露糖存在下诱导后在PBP317-36中观察到的分布 情况类似的N-聚糖，具有主要糖形G0(GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)(图 10A相对于图13A和13D)。但是，外源半乳糖给料后，菌株RDP968-1 (但不是母本菌株YDX477)产生在抗体上的含有半乳糖的N-聚糖的剂 量依赖增加，其主要糖形现在转移到G1(GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)且在 完全地β-1，4-半乳糖加帽的糖形G2(Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)中污染 增加(图13E和F)。

实施例3

菌株RDP578-1的构建显示于图5并涉及以下步骤。菌株JC308是 起始菌株。该菌株已在Choi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100： 5022-5027(2003)中描述，但简言之，菌株是ura3，ade1，arg4，his4。通 过利用质粒pJN329破坏OCH1基因并根据Choi等人(ibid.)和美国专 利号7,449,308中描述的方法，使得该菌株缺乏α-1，6甘露糖基转移酶 活性以产生菌株YJN153。质粒pJN329携带PPURA3显性选择标记， 在反选择ura-活性后，通过利用质粒载体pJN503b和pAS19破坏 PNO1、MMN4A和MNN4B基因并根据美国专利号7,259,007中描述的 方法，使得得到的菌株YJN156缺乏磷酸甘露糖基转移酶活性以产生菌 株YAS180-2。包含本文中的融合蛋白的分泌途径靶向前导肽定位催化 结构域，其被融合至ER、高尔基体或反式高尔基体网络。

在反选择ura-活性后，通常如美国专利号7,465,577中描述的利用质 粒pAS24(参见图14)使得得到的菌株YAS187-2缺乏β-甘露糖基转移 酶活性以制备菌株YAS218-2。质粒pAS24是巴斯德毕赤酵母BMT2敲 除质粒，其含有PpURA3选择标记和在PpOCH1启动子的下游含有编 码全长小鼠高尔基体UDP-GlcNAc转运蛋白(MmSLC35A3)的表达盒。 MmSLC35A3具有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，其由SEQ ID  NO；33所示的核苷酸序列编码。可以如美国专利号7,465,577所示获得 在序列两侧的5’和3’BMT2用于去除β-甘露糖基转移酶活性(其归因于 bmt2p)。在对于ura-活性反选择菌株YAS218-2后，得到的菌株YAS269-2 是ura-并具有插入BMT2基因的小鼠高尔基体UDP-GlcNAc转运蛋白。

然后用质粒pRCD742b(参见图15)转化菌株YAS269-2，质粒 pRCD742b包括编码嵌合小鼠α-1，2-甘露糖基转移酶I(FB8 MannI)、嵌 合人GlcNAc转移酶I(CONA10)和全长基因编码小鼠高尔基体 UDP-GlcNAc转运蛋白(MmSLC35A3)的表达盒并将质粒靶向ADE1基 因座(参见PCT/US2008/13719)。质粒pRCD742b是敲入敲除(KINKO) 质粒，其已在WO2007/136865和WO2007136752中描述。质粒整合进巴 斯德毕赤酵母ADE1基因而不删除编码Ade1p的开放读码框。质粒还 含有PpURA5选择标记。编码分泌途径靶向融合蛋白(FB8MannI)的表 达盒包括在PpGAPDH启动子的控制下融合至小鼠α-1，2-甘露糖基转移 酶I催化结构域(FB MannI：SEQ ID NO：54)的N-末端的ScSec12前导肽 (ScSec12(8)：SEQ ID NO：32的最先的103个氨基酸)。编码分泌途径靶 向融合蛋白CONA10的表达盒包括在PpPMA1启动子的控制下融合至 人GlcNAc转移酶I(GnT I)催化结构域(SEQ ID NO：52)的N-末端的 PpSec12前导肽(PpSec12(10)：SEQ ID NO：28的最先的29个氨基酸)。 质粒另外包括在PpSEC4启动子的控制下编码全长小鼠高尔基体 UDP-GlcNAc转运蛋白(MmSLC35A3)的表达盒。将质粒pRCD742b转 染进菌株YAS269-2产生菌株RDP307。该菌株能够产生具有 GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖的糖蛋白。SEQ ID NO：53和51是分别编码 小鼠α-1，2-甘露糖基转移酶I和人GlcNAc转移酶I(GnT I)催化结构域 的核苷酸序列。编码人GnT I的核苷酸序列被密码子最优化用于在巴 斯德毕赤酵母中表达。SEQ ID NO：27和31是分别编码PpSEC12(10)和 ScSEC12(8)的核苷酸序列。

菌株RDP361如下构建：用质粒pDMG47转化菌株RDP307以产 生菌株RDP361。质粒pDMG47(参见图16)是KINKO质粒，其整合进 巴斯德毕赤酵母TRP1基因座而不删除编码Trp1p的开放读码框。质粒 还含有PpURA3选择标记并包括编码分泌途径靶向融合蛋白(KD53) 的表达盒，其包含在PpGAPDH启动子的控制下融合至黑腹果蝇甘露糖 苷酶II(KD：SEQ ID NO：63)催化结构域的N-末端的ScMnn2引导靶向肽 (ScMnn2(53)：SEQ ID NO：19最先的36个氨基酸)。质粒还含有编码分泌 途径靶向融合蛋白(TC54)的表达盒，其包含在PpPMA1启动子的控 制下融合至大鼠GlcNAc转移酶II(TC：SEQ ID NO：58)的催化结构域 的N-末端的ScMnn2引导靶向肽(ScMnn2(54)：SEQ ID NO：22的最先的 97个氨基酸)。ScMnn2前导区53和54的核酸序列分别显示于SEQ ID  NO：19和21。编码黑腹果蝇甘露糖苷酶II和大鼠GlcNAc转移酶II(GnT II)的催化结构域的核酸序列分别显示于SEQ ID NO：62和57。

上述菌株RDP361用质粒pRCD823b转化以产生菌株RDP415-1。 质粒pRCD823b(参见图17)是KINKO质粒，其整合进巴斯德毕赤酵母 HIS4基因座(参见美国专利号7,479,389)而不删除编码His4p的开放读 码框，并含有PpURA5选择标记(参见美国公开的申请号20040229306) 以及编码分泌途径靶向融合蛋白(TA54)的表达盒，其包含大鼠 GlcNAc转移酶II催化结构域(TA：SEQ ID NO：61)，如上述在它的N- 末端与ScMnn2(54)的最先的97个氨基酸融合但在PpGAPDH启动子 的控制下。质粒还含有在PpOCH1启动子的控制下编码全长黑腹果蝇高 尔基体UDP-半乳糖转运蛋白(DmUGT)和在PpPMA1启动子的控制下 编码全长酿酒酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶(ScGAL10)的表达盒。 ScGAL10具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO：45 所示的核苷酸序列编码。大鼠GlcNAc转移酶II(TA)的核苷酸序列显示 于SEQ ID NO：60。

上述菌株RDP415-1用质粒pRCD893a转化以产生菌株RDP523-1。 质粒pGLY893a(参见图18)是巴斯德毕赤酵母his1敲除质粒，其含有 PpARG4选择标记(参见美国专利号7,479,389)。质粒包括编码分泌途径 靶向融合蛋白(KD10)的表达盒，其包含在PpPMA1启动子的控制下 融合至黑腹果蝇甘露糖苷酶II(KD：SEQ ID NO：63)的催化结构域的N- 末端的PpSEC12引导靶向肽(PpSEC12(10)：SEQ ID NO：28的最先的29 个氨基酸)。质粒还含有编码分泌途径靶向融合蛋白(TA33)的表达盒， 其包含在PpTEF1启动子的控制下融合至大鼠GlcNAc转移酶II(TA： SEQ ID NO：61)的催化结构域的N-末端的ScMntIp(ScKre2p)引导靶向 肽(ScMntIp(ScKre2p)(33)：SEQ ID NO：30的最先的53个氨基酸)。质 粒还含有编码分泌途径靶向融合蛋白(XB53)的表达盒，其包含融合至 人半乳糖基转移酶I(hGalTIβ43；SEQ ID NO：50)的催化结构域的N-末 端的ScMnn2p前导肽(53)的最先的36个氨基酸。PpSEC12和ScMNTI (ScKRE2)前导区的核酸序列分别显示于SEQ ID NO：27和29。编码黑 腹果蝇甘露糖苷酶II、大鼠GlcNAc转移酶II(GnT II)和人GalTI的催 化结构域的核酸序列分别显示于SEQ ID NO：62、60和49。该菌株可产 生具有N-聚糖的糖蛋白，所述N-聚糖具有末端半乳糖残基。菌株编码 两个拷贝的黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域和三个拷贝的大鼠GnT II催化结构域。

最后，上述菌株RDP523-1用质粒pBK64转化以产生菌株 RDP578-1。质粒pBK64编码人三环3测试蛋白并已在Choi等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 100：5022-5027(2003)中描述。

实施例4

菌株PBP317-36的构建显示于图8。起始菌株是YGLY16-3。这是 具有OCH1，PNO1，MNN4A，Mnn4B和BMT2基因缺失的ura-菌株并可 以根据实施例3所用方法制备。菌株YGLY16-3还在WO2007136752中 公开。

菌株YGLY16-3用质粒pRCD742a(参见图19)转化以制备菌株 RDP616-2。质粒pRCD742a(参见图19)是KINKO质粒，其整合进巴斯 德毕赤酵母ADE1基因而不删除编码Ade1p的开放读码框。质粒还含有 PpURA5选择标记和包括编码嵌合小鼠α-1，2-甘露糖基转移酶(FB8 MannI)、嵌合人GlcNAc转移酶I(CONA10)和全长小鼠高尔基体 UDP-GlcNAc转运蛋白(MmSLC35A3)的表达盒。质粒与质粒 pRCD742b相同，除了编码嵌合人GlcNAc转移酶I的表达盒的方向为 相反方向。将质粒pRCD742a转染进菌株YGLY16-3产生菌株 RDP616-2。该菌株能够产生具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的糖蛋 白。

反选择菌株RDP616-2以产生ura-菌株RDP641-3后，然后将质粒 pRCD1006转化至菌株以制备菌株RDP666。质粒pRCD1006(参见图 20)是巴斯德毕赤酵母his1敲除质粒，其含有PpURA5基因作为选择标 记。质粒含有在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途径靶向融合蛋白 (XB33)的表达盒(其包含融合至人半乳糖基转移酶I催化结构域 (hGalTIβ43)的N-末端的ScMnt1p(ScKre2p)(33)的最先的58个氨基酸)； 在PpOCH1启动子的控制下编码全长黑腹果蝇高尔基体UDP-半乳糖转 运蛋白(DmUGT)的表达盒和在PpPMA1启动子的控制下编码粟酒裂殖 酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶(SpGALE)的表达盒。

菌株RDP666用质粒pGLY167b转化以制备菌株RDP696-2。质 粒pGLY167b(参见图21)是巴斯德毕赤酵母arg1敲除质粒，其含有 PpURA3选择标记。质粒含有在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途 径靶向融合蛋白(CO-KD53)的表达盒(其包含融合至黑腹果蝇甘露糖 苷酶II催化结构域(KD)的N-末端的ScMnn2p(53)的最先的36个氨 基酸)和在PpPMA1启动子的控制下表达分泌途径靶向融合蛋白 (CO-TC54)的表达盒(其包含融合至大鼠GlcNAc转移酶II催化结构 域(TC)的N-末端的ScMnn2p(54)的最先的97个氨基酸)。得到的菌株 RDP696-2进行恒化器选择(参见Dykhuizen和Hartl，Microbiol.Revs. 47：150-168(1983)关于恒化器选择的综述)。恒化器选择产生菌株 YGB02。菌株YGB02可产生具有N-聚糖的糖蛋白，所述N-聚糖具有 末端半乳糖残基。在该菌株中，甘露糖苷酶II催化结构域(KD)和GnT II(TC)被密码子最优化为在巴斯德毕赤酵母中表达的核酸分子(分别为 SEQ ID NO：64和59)编码。

菌株YGB02用质粒pBK138转染以产生菌株PBP317-36。质粒 pBK138(参见图22)是滚入(roll-in)质粒，其整合进巴斯德毕赤酵母 AOX1启动子同时复制启动子。质粒含有编码融合蛋白的表达盒，其包 含融合至人Fc抗体片段(C-末端233-aa of a人IgG1重链，SEQ ID  NO：66)的N-末端的酿酒酵母A交配因子前信号序列(SEQ ID NO：24)。 编码酿酒酵母A交配因子前信号序列的核酸序列显示于SEQ ID NO：23 和编码人IgG1重链的C-末端233-aa的核酸序列显示于SEQ ID NO：65)。

实施例5

菌株YDX477的构建显示于图11。起始菌株是YGLY16-3。菌株 YGLY16-3用质粒pRCD742a(参见图19)转化以制备菌株RDP616-2。 质粒pRCD742a(参见图19)是KINKO质粒，其整合进巴斯德毕赤酵母 ADE1基因而不删除编码ade1p的开放读码框。质粒还含有PpURA5选 择标记和包括编码嵌合小鼠α-1，2-甘露糖基转移酶(FB8MannI)、嵌合人 GlcNAc转移酶I(CONA10)和全长小鼠高尔基体UDP-GlcNAc转运蛋 白(MmSLC35A3)表达盒。质粒与质粒pRCD742b相同，除了编码嵌合 人GlcNAc转移酶I的表达盒的方向为相反方向。将质粒pRCD742a 转染进菌株YGLY16-3产生菌株RDP616-2。该菌株能够产生具有 GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的糖蛋白。

反选择菌株RDP616-2以产生ura-菌株RDP641-4后，然后将质粒 pRCD1006转化至菌株以制备菌株RDP667-1.质粒pRCD1006(参见图 20)是巴斯德毕赤酵母his1敲除质粒，其含有PpURA5基因作为选择标 记。质粒含有在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途径靶向融合蛋白 (XB33)的表达盒(其包含融合至人半乳糖基转移酶I催化结构域 (hGalTIβ43)的N-末端的ScMnt1p(ScKre2p)(33)的最先的58个氨基酸)； 在PpOCH1启动子的控制下编码全长黑腹果蝇高尔基体UDP-半乳糖转 运蛋白(DmUGT)的表达盒和在PpPMA1启动子的控制下编码粟酒裂殖 酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶(SpGALE)的表达盒。

菌株RDP667-1用质粒pGLY167b转化以制备菌株RDP697-1。质 粒pGLY167b(参见图21)是巴斯德毕赤酵母arg1敲除质粒，其含有 PpURA3选择标记。质粒含有在PpGAPDH启动子的控制下编码分泌途 径靶向融合蛋白(CO-KD53)的表达盒(其包含融合至黑腹果蝇甘露糖 苷酶II催化结构域(KD)的N-末端的ScMnn2p(53)的最先的36个氨 基酸)和在PpPMA1启动子的控制下表达分泌途径靶向融合蛋白 (CO-TC54)的表达盒(其包含融合至大鼠GlcNAc转移酶II催化结构 域(TC)的N-末端的ScMnn2p(54)的最先的97个氨基酸)。编码甘露糖 苷酶II和GnT II催化结构域的核酸分子被密码子最优化用于在巴斯德 毕赤酵母中表达(分别为SEQ ID NO：64和59)。该菌株可产生具有N-聚 糖的糖蛋白，所述N-聚糖具有末端半乳糖残基。

用质粒pGLY510转化菌株RDP697-1以制备菌株YDX414。质粒 pGLY510(参见图23)是滚入质粒，其整合进巴斯德毕赤酵母TRP2基因 座同时复制基因并含有AOX1启动子-ScCYC1终止子表达盒以及 PpARG1选择标记。

用质粒pDX459-1(mAb-A)转化菌株YDX414以制备菌株 YDX458。质粒pDX459-1(参见图24)是滚入质粒，其靶向并整合进巴 斯德毕赤酵母AOX2启动子并含有ZeoR同时复制启动子。质粒含有编 码抗-HER2抗体重链和抗-HER2抗体轻链(分别为SEQ ID NO：68和70) 的分开的表达盒，其各个在N-末端融合黑曲霉α-淀粉酶信号序列(SEQ  ID NO：26)并被巴斯德毕赤酵母AOX1启动子控制。编码重链和轻链的 核酸序列分别显示于SEQ ID NO：67和69，和编码黑曲霉α-淀粉酶信 号序列的核酸序列显示于SEQ ID NO：25。

用质粒pGLY1138转化菌株YDX458以制备菌株YDX477。质粒 pGLY1138(参见图25)是滚入质粒，其整合进巴斯德毕赤酵母ADE1基 因座同时复制基因。质粒含有ScARR3选择标记基因盒。来自酿酒酵母 的ARR3基因赋予细胞亚砷酸盐抗性，使细胞可在亚砷酸盐存在下生长 (Bobrowicz等人，Yeast，13：819-828(1997)；Wysocki等人，J.Biol.Chem. 272：30061-30066(1997))。质粒含有在PpAOX1启动子的控制下编码分 泌的融合蛋白的表达盒，其包含融合至里氏木霉(MNS1)催化结构域 (SEQ ID NO：56，由SEQ ID NO：55的核苷酸序列编码)的N-末端的酿酒 酵母α因子前信号序列(SEQ ID NO：24)。融合蛋白分泌至培养基中。

尽管本发明参考例举的实施方案在本文中描述，但应理解的是本发 明不限于此。具有本领域普通技术且获得本文教导的人员应认识到在其 范围内的另外的修改和实施方案。因此，本发明仅通过本文所附权利要 限制。