病毒增殖

摘要： 细胞自噬是真核细胞维持稳态的一种重要生命活动,是细胞内主要依赖于溶酶体的一种降解途径,将机体不需要的生物大分子包裹形成自噬体,并与溶酶体融合将内容物降解;自噬与许多疾病的发生密切相关,也具有抑制病原体的功能,这一功能常与天然免疫密切相关,最终拮抗病原微生物的感染。

摘要： A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)属小RNA病毒科塞内卡病毒属,是一种感染猪的新兴病毒,该病毒可感染各个年龄段的猪群,其感染后引起的临床症状与口蹄疫、水疱性口炎、猪传染性水疱病相似。自2014年11月以来,在美国和加拿大等各地区都有零星发生猪感染SVA的病例。我国于2015年5月在广东省首次检测到SVA的感染,随后在河南、福建、湖北等省份的猪场中也相继检测到了SVA感染的情况。

摘要： 为探究国内流行的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)野毒株在鼠源BHK-21细胞中的复制生长特性,用间接免疫荧光、蛋白免疫印迹和透射电镜方法,确定了在BHK-21细胞系中能够感染中国流行的LSDV/FJ/CHA/2021毒株。蛋白免疫印迹和病毒生长曲线结果均表明,LSDV野毒株呈现时间依赖性的方式在BHK-21细胞中进行有效复制。电镜结果证明LSDV病毒工厂位于BHK-21细胞质内而非细胞核内。结果表明,LSDV国内流行毒株能够在BHK-21细胞中进行高效复制,为探究LSDV感染的致病机制、动物模型建立及弱毒疫苗的研制奠定重要理论基础。

摘要： [目的]研究鳜AKT2(ScAKT2)在传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)增殖中的作用,为鳜ISKNV防控提供参考.[方法]克隆ScAKT2基因开放阅读框,构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化.用纯化后的ScAKT2重组蛋白免疫日本大耳兔后制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体的效价,用间接免疫荧光和Western blot法测定抗体的特异性.克隆鳜AKT2基因,构建过表达载体pCMV-EGFP-ScAKT2,将其转染至CPB细胞系中构建ScAKT2过表达细胞系,用荧光显微镜检测转染效率,用qRT-PCR法及Western blot法分别测定ScAKT2 mRNA水平和蛋白水平的表达,以鉴定ScAKT2过表达细胞系是否构建成功.将ISKNV接种至ScAKT2过表达细胞系中,用qPCR法及Western blot法分别测定ISKNV病毒拷贝数及ISKNV-MCP蛋白的表达,用qRT-PCR 法测定ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA水平的表达情况.[结果]PCR扩增获得1 400 bp的AKT2 ORF片段,成功构建了原核表达质粒,诱导表达出72 ku的重组蛋白.成功制备了ScAKT2多克隆抗体,抗体效价达1 ∶ 256 000,纯化后质量浓度约为10 mg/mL.成功构建了pCMV-EGFP-ScAKT2过表达载体和过表达ScAKT2的CPB细胞系,过表达ScAKT2 CPB细胞可极显著抑制ISKNV的增殖,能明显上调ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA的表达水平.[结论]ScAKT2通过上调先天免疫因子的表达抑制ISKNV的增殖,为鳜ISKNV防控提供了新的潜在靶点.

摘要： 目的 建立树鼩脊髓来源的微血管内皮细胞体外分离培养技术,用71型肠道病毒(enterovirus 71,EV71)感染该细胞,探讨其感染特性,为EV71损伤中枢神经系统机制的研究提供基础.方法 采用Ⅱ型胶原酶、分散酶、DNase Ⅰ三酶联合两次消化树鼩脊髓组织后,获取微血管内皮细胞,并进行纯化和鉴定.用EV71感染树鼩脊髓微血管内皮细胞,测定感染不同时间点的细胞及其培养上清液中病毒载量.采用间接免疫荧光法检测细胞中EV71标志蛋白的表达,以确定EV71对树鼩脊髓微血管内皮细胞的感染性.结果 分离培养获得的树鼩脊髓微血管内皮细胞呈典型的分支状和串珠状,经过嘌呤霉素纯化培养后的传代细胞主要是不规则的多角状细胞;细胞免疫荧光鉴定结果显示,微血管内皮细胞标志蛋白CD31和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)表达都呈阳性.用感染复数为1的EV71感染树鼩脊髓微血管内皮细胞,可见典型的细胞病变,且病毒滴度可达3.2×106 TCID50/mL,表明EV71可成功感染树鼩脊髓微血管内皮细胞并有效增殖;而且在48h内,细胞培养上清液中病毒载量呈线性升高,而细胞中病毒载量在12 h到达顶峰.间接免疫荧光法在EV71感染后12 h的树鼩脊髓微血管内皮细胞质中可检测到病毒颗粒.结论 成功建立了树鼩脊髓微血管内皮细胞体外分离培养方法,确定了 EV71对树鼩脊髓微血管内皮细胞的感染性和病毒增殖特性,为开展EV71入侵中枢神经系统的机制研究提供了一定基础.

摘要： 以病毒增殖的微课教学设计为例,探讨医学微生物学微课设计的一种理念,即将医学微生物学的课程内容、科学精神和医学生的知识技能深度融合开展微课教学设计.采用语音、文字、图片和视频等多元信息的整合生动表达教学内容.使科研情景、知识结论、知识应用、知识与实践的联系、思考后的小结有序呈现.由此让微课教学在提高医学微生物学教学质量中发挥积极作用.

摘要： 为了提高牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的培养滴度,延长牛传染性鼻气管炎病毒液的保存时间,本研究对牛传染性鼻气管炎病毒增殖工艺进行了优化研究.研究结果表明:吸附或不吸附的接毒方式对病毒液的滴度没有明显的差异,而病毒液滴度与接毒前细胞数、病毒液收获时间呈正比;最佳的接毒剂量0.01％,收获病毒液的时间为细胞100％病变时,病毒液的滴度最高;使用保护剂2能够有效延长半成品病毒液的保存期(至12个月).

摘要： [目的]探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据.[方法]采用RT-PCR扩增pCyclin和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株.设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA) CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率.流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响.将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度.[结果]pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1 299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2.荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达.构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的pCyclinA、pCDK2基因的mRNA表达量均极显著降低(P＜0.01).pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P＜0.01或P＜0.05).pCyclinA低表达能极显著降低ST细胞G0/G1期的比例(P＜0.01)、极显著增加S期和G2/M期的细胞比例(P＜0.01);pCDK2低表达能显著增加ST细胞G0/G1期的比例(P＜0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P＜0.05).PPV在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中的滴度均极显著低于对照细胞(P＜0.01).低表达细胞ST-pGPU6-GFP/CycA894中PPV滴度极显著增加(P＜0.01),而ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的PPV滴度无显著变化(P＞0.05).[结论]pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例.

摘要： 为探讨猪瘟病毒(CSFV)感染PK-15细胞后的病毒增殖特点,以CSFV Shimen株细胞毒和PK-15细胞为研究材料,通过建立病毒感染细胞模型,将已感染靶细胞连续传至3代,采用IDEXX CSFV抗原检测试剂盒、反转录PCR(RT-PCR)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测CSFV复制水平和感染情况.结果表明,成功建立细胞感染模型且无细胞病变产生;CSFV抗原检测试剂盒和RT-PCR检测结果显示,随细胞传代次数的增加,CSFV复制水平明显提高;同代次细胞随培养时间的延长,CSFV复制水平也逐渐提高,且靶细胞的培养方式对CSFV的增殖效果有明显影响;IPMA检测结果表明,相同条件下,靶细胞对CSFV敏感性存在明显不同,随培养时间的延长,阳性细胞数量逐渐增加并且感染程度逐渐加强.以上结果表明,病毒感染时间、阳性细胞数量、培养方式及细胞敏感性是影响CSFV体外增殖效果的重要因素,研究结果为进一步提高CSFV体外增殖滴度奠定了基础.

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征的致病病原,目前PRRS已成为危害世界养猪业的重要疫病之一.本研究基于高致病性PRRSV细胞致弱株HuN4-F112的反向遗传操作平台,运用SOE PCR技术,将萤火虫荧光素酶基因插入其基因组ORF1b和ORF2之间,并在ORF2前,荧光素酶基因后插入一个TRS6cassette,构建成功重组质粒pA-Fluc,对其进行病毒拯救获得重组病毒vA-Fluc.对vA-Fluc进行病毒生物学特性分析，遗传稳定性分析，结果发现表达萤火虫荧光素酶基园的重组PRRSV，vA-Fluc与亲本病毒vHuN4-F112在病毒N蛋白表达、细胞病变(CPE)情况、病毒多步生长曲线、空斑形态等生物学特性方面无显著差异。

摘要： 为了获得优质高滴度的猪圆环病毒抗原液,探究接种剂量、接种方式和收获时间对病毒增殖的影响,本研究对猪圆环病毒2型SD株以不同的接毒剂量、不同接种方式和不同的收毒时间进行了疫苗抗原液生产工艺的研究比较,确定了猪圆环病毒2型疫苗抗原液的最佳生产工艺.

摘要： 本研究的目的是建立猪血管内皮细胞的miRNA库，以发现新的miRNA，并探讨miRNA对猪瘟病毒增殖的调节作用，为揭示猪瘟病毒的感染的机理提供科学资料。试验结果提示在机体内miRNA可能参与了猪瘟病毒的复制和感染过程。

摘要： 本课题组从24个猪场的46份样品中检测到PRRSV，并分离出3株H-PRRSV。探讨细胞不同培养条件及病毒增殖条件对PRRSV湖北株TCID50的影响，确定适合PRRSV湖北增殖的Marc145细胞培养的最佳条件，为今后开展进一步的免疫学研究及综合防控技术研究提供理论依据和技术支持。

摘要： 马立克氏病和网状内皮组织增殖病是一种传染性致肿瘤性免疫抑制性疾病，对我国养鸡业造成了巨大损失。本研究，构建了真核表达质粒pBud-env，把env表达盒通过Red/ET同源重组插入到已经构建好的重组马立克病毒rCV1988，形成重组马立克病毒rCV1988-env，并且研究了rCV1988-env体内外增殖情况。研究表明，成功的构建了能够表达env基因的rCV1988并且rCV1988-env体内外增殖速度都有所降低。

摘要： 目的：针对分离鉴定的PCV2-WH株通过四种不同的方法进行病毒增殖优化培养，使培养的病毒滴度达到理想状态。 方法：①细胞与病毒同步接种并用300 mm的D-氨基葡萄糖处理；②同步接种不用D-氨基葡萄糖处理；③不同步接种并用D-氨基葡萄糖处理；④不同步接种不用D-氨基葡萄糖处理。 结果：通过传统PCR和荧光定量PCR检测病毒增殖结果表明：同步接种并用D-氨基葡萄糖处理的病毒含量比其他三种培养工艺所获病毒量分别提高了12.8%，14.7%，56.7%。第二代中，同步接种并用D-氨基葡萄糖处理的病毒含量比其他三种培养工艺所获病毒量分别提高了55.8%，85_3%，73.3%。 结论：因此，在体外培养条件下，获得最大PCV2滴度的方法就是采取同步接种并用D-氨基葡萄糖处理的工艺。

摘要： 本试验以AIV A/chicken/Hebei/108/2002(H5N1)感染并诱导MDCK细胞凋亡，初步探讨钙信号与细胞凋亡和病毒增殖之间的关系，为禽流感发病机制及相关药物的研究提供科学依据。

摘要： 采用水培试验方法,研究了不同镁营养水平下(12,24,36,48 mg/l),烟草幼苗生长及感染TMV、CMV后发病情况及病毒在体内增殖情况的影响.结果表明:镁浓度为24mg/l处理后的烟草幼苗生长状况较好,并且该处理后的烟草在感染病毒后发病较轻,病毒在体内含量较低,从而表明该处理对烟草自身抗病性有明显的促进作用.

摘要： 为了解鸭瘟病毒(DPV)在鸭胚脐带间充质干细胞上的适应性和增殖情况.本实验将DPV接种鸭胚脐带间充质干细胞,连续传代致第10代,通过CPE观察、病毒粒子电镜观察、核酸检测、间接免疫荧光检测等方法分析其生物学特性,并测定了连续10代的病毒滴度(TCID50).第一代DPV即在鸭胚脐带间充质干细胞上产生了明显的CPE,并且在连续传代的过程中CPE能够稳定出现.电镜观察显示,初步提纯的病毒悬浮液在电镜下可见到结构清晰的子代病毒.PCR检测结果显示,F1～F10代DPV均能扩增出大小为416bp的UL6基因片段.间接免疫荧光又进一步证实DPV的阳性血清能够对染毒病灶产生特异性荧光染色.而且连续测定10代的病毒滴度(TCID50)均不低于10-6.43.说明DPV能在鸭胚脐带间充质干细胞上稳定增殖.本研究有望为获得高纯度鸭瘟病毒及细胞源疫苗研究提供理论基础.

摘要： 为了解鸭瘟病毒(DPV)在鸭胚脐带间充质干细胞上的适应性和增殖情况.本实验将DPV接种鸭胚脐带间充质干细胞,连续传代致第10代,通过CPE观察、病毒粒子电镜观察、核酸检测、间接免疫荧光检测等方法分析其生物学特性,并测定了连续10代的病毒滴度(TCID50).第一代DPV即在鸭胚脐带间充质干细胞上产生了明显的CPE,并且在连续传代的过程中CPE能够稳定出现.电镜观察显示,初步提纯的病毒悬浮液在电镜下可见到结构清晰的子代病毒.PCR检测结果显示,F1～F10代DPV均能扩增出大小为416bp的UL6基因片段.间接免疫荧光又进一步证实DPV的阳性血清能够对染毒病灶产生特异性荧光染色.而且连续测定10代的病毒滴度(TCID50)均不低于10-6.43.说明DPV能在鸭胚脐带间充质干细胞上稳定增殖.本研究有望为获得高纯度鸭瘟病毒及细胞源疫苗研究提供理论基础.

摘要： 本发明涉及基因工程学和病毒学，尤其涉及一种含人类B亚群11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途。该腺病毒可以是11型腺病毒，也可以是用11型腺病毒纤毛蛋白的编码序列取代非11型腺病毒的纤毛蛋白编码序列而构成的杂合腺病毒。该腺病毒通过对其增殖必须基因进行的有效控制或突变而具有选择性增殖能力。作为具有更广的感染谱和改良感染能力的条件增殖型的重组病毒，本发明的重组溶瘤腺病毒可以用于基因治疗尤其是肿瘤的基因治疗。

摘要： 本发明涉及副黏病毒科副黏病毒亚科中的哺乳动物负链RNA病毒，偏肺病毒(MPV)的改良毒株。本发明还涉及没有胰蛋白酶存在时增殖哺乳动物MPV的方法。可利用本发明方法和组合物制备抗，例如MPV感染的疫苗。

摘要： 在右式中，R

摘要： 本发明涉及一种膜联蛋白A2/S100A10异源四聚体抑制剂A2ti‑1在体外抑制伪狂犬病毒复制增殖的方法及应用，所述抑制剂A2ti‑1可以用于抑制伪狂犬病毒体外复制增殖的相关抗病毒药物的开发。本发明在PK‑15细胞上验证了A2ti‑1在不低于62.5μM的使用浓度下，与对照组相比，PRV感染后的DNA含量、病毒滴度和结构蛋白的表达水平均显著降低，说明A2ti‑1可用于抑制伪狂犬病毒的体外复制增殖。

摘要： 本发明公开了一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用，属于生物医药技术领域。为了克服传染性支气管炎病毒分离株、疫苗株不能在体外细胞中有效增殖复制的缺陷。本发明提供一种适应鸡胚成纤维细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒株，提供一种适应非洲绿猴肾细胞系复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒株，通过在体外原代细胞和传代细胞系中连续传代、筛选获得能够有效感染体外细胞并在细胞中大量增殖复制的鸡传染性支气管炎病毒。体外细胞适应传染性支气管炎病毒可作为传染性支气管炎病毒感染细胞的研究模型探索病毒侵染细胞相关机制，同时可用于鸡传染性支气管炎疫苗、诊断制剂等所需病毒的体外增殖候选毒株，具有重要的实际应用价值。

摘要： 本发明公开了一种适合犬瘟热病毒和禽流感病毒增殖的MDCK‑KOmavs细胞系及应用，所述细胞系的全基因组中mavs基因位于第24号染色体，所述第24号染色体的一个染色体上mavs基因的第二段外显子序列上插入两个碱基GC，其插入位点位于第24号染色体的17520583位点处；第24号染色体的另一个染色体上mavs基因的第二段外显子序列上插入两个碱基GC，其插入位点位于第24号染色体的17520583位点处；同时，在第24号染色体的17520587位点上mavs基因的第二段外显子的碱基C突变成了碱基T。本发明所构建的MDCK‑KOmavs细胞系具有犬瘟热病毒和禽流感病毒感染后细胞病变快、病毒增殖滴度高、更适合犬瘟热病毒和禽流感病毒病毒增殖等特点。

摘要： 本发明涉及动物病毒学、免疫学、表观遗传学和新型免疫增强剂开发领域，提供了一种抗J亚群禽白血病病毒增殖的内源性反转录病毒RNA及其制备方法和应用。该RNA来源于鸡1号染色体基因组中内源性反转录病毒ALVE1衍生的反义长链非编码RNA，采用RACE和PCR克隆技术鉴定后，将其命名为lnc‑ALVE1‑AS1，其cDNA具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明通过构建lnc‑ALVE1‑AS1过表达载体质粒，体外实验显示lnc‑ALVE1‑AS1可激活细胞抗病毒干扰素应答反应并抑制J亚群禽白血病病毒增殖。本研究发明不仅提供了抵抗禽白血病病毒的新手段，也为禽白血病病毒的防控提供了新思路。

摘要： 本发明公开了一种适合犬瘟热病毒和禽流感病毒增殖的MDCK‑KOmavs细胞系及应用，所述细胞系的全基因组中mavs基因位于第24号染色体，所述第24号染色体的一个染色体上mavs基因的第二段外显子序列上插入两个碱基GC，其插入位点位于第24号染色体的17520583位点处；第24号染色体的另一个染色体上mavs基因的第二段外显子序列上插入两个碱基GC，其插入位点位于第24号染色体的17520583位点处；同时，在第24号染色体的17520587位点上mavs基因的第二段外显子的碱基C突变成了碱基T。本发明所构建的MDCK‑KOmavs细胞系具有犬瘟热病毒和禽流感病毒感染后细胞病变快、病毒增殖滴度高、更适合犬瘟热病毒和禽流感病毒病毒增殖等特点。

摘要： 本发明涉及动物病毒学、免疫学、表观遗传学和新型免疫增强剂开发领域，提供了一种抗J亚群禽白血病病毒增殖的内源性反转录病毒RNA及其制备方法和应用。该RNA来源于鸡1号染色体基因组中内源性反转录病毒ALVE1衍生的反义长链非编码RNA，采用RACE和PCR克隆技术鉴定后，将其命名为lnc‑ALVE1‑AS1，其cDNA具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明通过构建lnc‑ALVE1‑AS1过表达载体质粒，体外实验显示lnc‑ALVE1‑AS1可激活细胞抗病毒干扰素应答反应并抑制J亚群禽白血病病毒增殖。本研究发明不仅提供了抵抗禽白血病病毒的新手段，也为禽白血病病毒的防控提供了新思路。

摘要： 本发明公开了一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源RIPK3基因缺失细胞株的构建方法及其产品和应用，涉及生物技术领域。构建该细胞株的载体的构建方法包括：gRNA1‑F和gRNA1‑R退火形成双链1，双链1再与经BbsⅠ酶切的CRISPR/Cas9载体连接，得到pX459‑gRNA1；gRNA2‑F和gRNA2‑R退火形成双链2，双链2再与经BbsⅠ酶切的辅助载体连接，得到EZ‑gRNA2；以HindIII和XhoI对获得的pX459‑gRNA1和EZ‑gRNA2分别进行双酶切，回收线性化酶切产物后连接，得到所述载体。利用本发明的载体构建的猪源RIPK3基因缺失细胞株能够促进伪狂犬病毒的增殖。