PK-15细胞

摘要： 【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体,筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株,Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后,坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株,与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力,为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。

摘要： PK15细胞是一种被广泛应用于兽用疫苗生产的细胞,然而现今生物制品行业快速发展,传统贴壁培养PK15细胞已经不能满足生产需要。目前通过全悬浮培养技术来培养细胞、病毒已经是发展趋势,但是由于生产用细胞多数为贴壁细胞,难以实现悬浮培养,所以,目前该项技术在疫苗生产上还未广泛应用,技术也还未成熟。故本文探讨PK15细胞在无血清全悬浮培养条件下的生长和产毒情况,以期能将贴壁培养工艺转化为全悬浮工艺,方便生产放大,提高生产产能。

摘要： 旨在分析乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染猪肾上皮细胞PK15后的lncRNA差异表达谱,探究宿主lncRNA在JEV感染和宿主防御中的潜在功能。本研究中利用JEV感染PK15细胞,感染36 h,收集细胞,同时设立未感染对照组,每组3个生物学重复。提取细胞总RNA,构建cDNA文库后进行高通量测序,筛选出差异表达lncRNA。通过对差异表达lncRNA与mRNA的位置关系以及序列相似性预测顺式和反式作用的靶基因,将预测的靶基因进行GO和KEGG分析。最后随机选出9个差异表达lncRNAs,利用实时荧光定量PCR(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)技术进行表达验证。结果表明,本研究中共鉴定出856个差异表达lncRNAs,其中452个lncRNAs显著上调表达,404个lncRNAs显著下调表达。GO分析发现,lncRNA的靶基因主要富集于先天性免疫反应;KEGG通路分析发现lncRNA的靶基因显著富集于肿瘤坏死因子、Toll样受体和NF-κB等信号通路。通过qRT-PCR验证发现,定量结果和测序结果基本一致。本研究为进一步探究lncRNA参与宿主免疫反应调控JEV复制奠定了理论基础。

摘要： 为改进猪圆环病毒2型的培养工艺,驯化了一株可无血清培养的全悬浮PK15细胞用于培养猪圆环病毒2型,并对病毒的敏感性、接毒时间、接毒量、收获方法进行了试验。结果表明,用该细胞培养猪圆环病毒2型,如果采用批次收获,接毒时细胞密度为0.5×10^(6)/mL,接毒量为0.1 MOI,接毒72 h后收毒,病毒滴度能达到10^(6.4)TCID_(50)/mL;如果采用连续收获,接毒和带毒传代时均使细胞密度为0.5×10^(6)/mL,接毒量为0.04 MOI,收毒时间为接毒后72 h,连续收获三次,病毒滴度分别为10^(6.0)TCID_(50)/mL、10^(6.25)TCID_(50)/mL、10^(6.5)TCID_(50)/mL,病毒滴度和收获液体积较为理想,可为大规模培养猪圆环病毒2型提供参考。

摘要： 【目的】建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗的工艺,提高PCV2疫苗生产效率,降低PCV2疫苗生产成本。【方法】首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化,并在无血清悬浮培养体系下,采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数(MOI)(0.10、0.05、0.01和0.001)和不同PK-15细胞接种密度(CDI)(1.0×10^(6)、3.0×10^(6)、5.0×10^(6)/mL)对PCV2增殖的影响,同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养,且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^(-1)增加到0.6 d^(-1);悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代,连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^(-1)附近波动,且细胞活率始终>90%;以1.0×10^(6)/mL接种,第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10^(6)/mL,并可维持1 d,第4天前活率均>90%,此后快速下降;病毒增殖最佳工艺参数为:感染复数为0.05,细胞接种密度为1.0×10^(6)/mL,最终收获时病毒滴度可达10^(6.2)TCID_(50)/mL;对细胞感染前后的代谢分析发现,病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前,且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累,之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株,PK-15细胞可用于PCV2增殖,结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。

摘要： 猪圆环病毒2型(PCV2)细胞内增殖滴度的提高是开发PCV2全病毒灭活苗的瓶颈问题.为克服该困难,探究高病毒滴度PCV-2规模化增殖工艺,采用PK-15细胞单层接毒、同步接毒与带毒传代3种增殖工艺对PCV2进行增殖,并应用细胞孵育剂D-氨基葡萄糖对各增殖工艺进行优化,最后通过间接免疫荧光试验对比分析不同的增殖工艺组病毒增殖滴度.结果表明,单层接毒、同步接毒以及带毒传代工艺生产的PCV2病毒滴度均符合规程要求(TCID50/mL>105.5),带毒传代(第5代)生产效果显著优于前两种工艺(P<0.01);D-氨基葡萄糖的添加可将同类工艺下PCV2的病毒滴度提高1.6～3.16倍.

摘要： [目的]筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺(病毒种毒来源、MOI及收获时间),为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据.[方法]使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90％长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆.3株克隆(PK15-1C8、2F11、1E5)按照1×106细胞/mL的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37°C,5％二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒(来源于贴壁细胞或悬浮细胞),摸索感染MOI(0.1、0.2、0.5)及收获时间(48、72、96、120h),确定PCV2最佳生产工艺.[结果](1)贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×106/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×106/mL,活率在95％以上,倍增时间为20h左右;(2)3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到106.4TCID50/mL,克隆PK15-2F11(105.5TCID50/mL)、PK15-1E5(105.6TCID50/mL),3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆(104.7TCID50/mL),但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;(3)使用贴壁细胞来源的种毒(106.4TCID50/mL)感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×106/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为106 5TCID50/mL.以来源于悬浮细胞的种毒(106.3TCID50/mL)感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达107.3TCID50/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×106/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获.[结论]通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达107.3TCID50/mL,可用于工厂化疫苗生产.

摘要： 前期研究数据表明组织蛋白酶S(cathepsin S,CTSS)在猪初乳中表达水平显著高于常乳,且CTSS有抑制病毒复制的作用,本研究旨在探究猪源CTSS对O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus serotype O,FMDV-O)复制及对FMDV诱导的抗病毒细胞因子的影响.FMDV-O感染PK-15细胞,利用RT-qPCR和Western blot分别在转录和翻译水平探究FMDV-O感染对内源性CTSS表达的影响;使用CTSS活性检测试剂盒测定FMDV-O感染对CTSS酶活性的影响;根据GenBank公布的CTSS基因序列(XM_021089893.1)构建CTSS真核表达质粒,利用脂质体方法转染PK-15细胞,通过Western blot检测CTSS表达情况,并在此基础上通过Western blot和RT-qPCR检测过表达CTSS对FMDV-O复制及FMDV-O诱导的抗病毒细胞因子mRNA水平的影响;进一步针对CTSS设计合成3对特异性siRNA,利用Western blot和RT-qPCR检测CTSS和FMDV-O的变化.结果 表明,FMDV-O感染PK-15细胞能显著上调猪源CTSS表达并增强CTSS酶活性;过表达CTSS能抑制FMDV-O在PK-15细胞中复制,这种抑制作用可能是通过促进FMDV-O诱导的抗病毒细胞因子产生而发挥功能的;干扰序列siRNA-2947下调内源性CTSS表达进而促进FMDV-O的复制.猪源CTSS促进宿主抗病毒细胞因子产生可能是抑制FMDV-O复制的原因之一,本研究为深入探究宿主CTSS在抗FMDV天然免疫应答中的作用及机制提供依据.

摘要： 为探究猪核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族端酶募集(CARD)结构域-5(NLRC5)在PK15细胞中的表达情况及其对猪白细胞抗原I类分子(SLA I)表达的调控作用,本研究利用不同终浓度(1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL)Poly I:C刺激PK15细胞后24 h,通过荧光定量PCR(qPCR)和western blot方法分别检测NLRC5 mRNA转录水平和蛋白的表达水平;设计NLRC5的3条siRNA和对照siRNA分别转染PK15细胞48 h后,分别采用qPCR和western blot检测PK15细胞中NLRC5 mRNA转录水平和蛋白表达水平,从而筛选出最优敲低NLRC5表达的siRNA;将筛选出的最优siRNA和对照siRNA分别转染PK15细胞48 h后,采用qPCR分别检测PK15细胞中NLRC5和SLA I类分子mRNA的转录水平,采用western blot检测PK15细胞中NLRC5蛋白表达水平,通过流式细胞术检测PK15细胞表面SLA I类分子的表达.构建重组质粒pCAGGS-HA-NLRC5并鉴定正确后转染PK15细胞,48 h后,采用qPCR分别检测PK15细胞中NLRC5和SLA I类分子mRNA的转录水平,采用western blot检测PK15细胞中NLRC蛋白表达水平,通过流式细胞术检测PK15细胞表面SLA I类分子表达水平.结果显示,与正常PK15细胞相比,经不同浓度Poly I:C刺激后PK15细胞中NLRC5 mRNA转录水平和蛋白水平均显著升高(p<0.01).siRNA的筛选结果显示,NLRC5-sus-3为最优siRNA;将其转染PK15细胞后的qPCR和流式细胞术检测结果显示,与转染对照siRNA的PK15细胞相比,敲低NLRC5的PK15细胞中SLA I类分子的mRNA转录水平(p<0.01)和细胞表面SLA I类分子的表达水平均显著降低(p<0.01);重组质粒pCAGGS-HA-NLRC5转染PK15细胞后的结果显示,NLRC5 mRNA转录水平和蛋白水平均显著增高(p<0.01),表明NLRC5在PK15细胞中获得了过表达.qPCR和流式细胞术结果显示,过表达NLRC5后的PK15细胞中SLA I类分子mRNA的转录水平(p<0.01)和其在细胞表面的表达量均升高(p<0.05).综上所述,经Poly I:C刺激可促进PK15细胞中NLRC5的表达,且NLRC5对SLA I类分子的表达具有正调控作用.本实验是首次在猪源细胞中进行了NLRC5对SLA I类分子表达的调控研究,为进一步探究机体在病原感染过程中的免疫防御机制提供了新思路.

摘要： 试验旨在研究T-2毒素对猪肾细胞(PK15)的毒性作用及其氧化应激反应.用不同浓度的T-2毒素处理细胞,通过MTT法检测细胞活性、测定细胞内乳酸脱氢酶(LDH)释放率及苏木素伊红(HE)染色观察细胞形态变化评估T-2毒素对细胞的毒性作用;通过检测细胞内的活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽(GSH)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性,评估不同剂量T-2毒素对细胞氧化应激水平的影响;检测Nrf2-ARE信号通路相关基因Nrf2、Keap1、GPx-1、Nqo1及Hmox1 mRNA的表达水平,分析T-2毒素对该信号通路的影响.结果 表明,PK15细胞活性呈毒素剂量依赖性下降(P＜0.05),LDH释放率呈毒素剂量依赖性上调(P＜0.05);随T-2毒素剂量升高,细胞间隙逐渐增加,细胞固缩,细胞数量也随之减少.细胞内ROS阳性细胞率呈剂量依赖性升高,且T-2毒素为100 nmol/L时,ROS阳性细胞率显著高于其他剂量组(P＜0.05);细胞内MDA含量与GPx活性呈毒素剂量依赖性升高(P＜0.05),而GSH含量呈毒素剂量依赖性下降(P＜0.05).20、50及100 nmol/L的T-2毒素可显著上调Keap1、Gpx-1及Nqo1基因mRNA的相对表达量(P＜0.05),且50 nmol/L的相对表达量最高.T-2毒素对K15细胞有毒性作用,可诱导其氧化损伤,且该氧化应激过程受Nrf2-AER信号通路调控.

摘要： 为了研究蜂胶黄酮对猪肾脏细胞(PK-15细胞)感染PPV后产生抗感染因子的影响,试验将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg·mL-1倍比稀释5个浓度,与PPV一起加至长成单层PK-15细胞培养体系中,用ELISA方法测定蜂胶黄酮对PPV感染PK-15细胞后产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子含量的变化.结果表明:与病毒对照组比较,在感染PPV后2h、12h的前期,只有较高浓度的蜂胶黄酮可以显著提高PK-15细胞产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子含量的能力.PK-15细胞在感染病毒后24h、48h和72h的后期,蜂胶黄酮对提高PPV感染PK-15细胞后产生抗感染因子能力比较弱.说明蜂胶黄酮提高PPV感染PK-15细胞产生抗感染因子主要集中在感染的早期.

摘要： 为了研究蜂胶黄酮对猪肾脏细胞(PK-15细胞)感染PPV后产生抗感染因子的影响,试验将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg·mL-1倍比稀释5个浓度,与PPV一起加至长成单层PK-15细胞培养体系中,用ELISA方法测定蜂胶黄酮对PPV感染PK-15细胞后产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子含量的变化.结果表明:与病毒对照组比较,在感染PPV后2h、12h的前期,只有较高浓度的蜂胶黄酮可以显著提高PK-15细胞产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子含量的能力.PK-15细胞在感染病毒后24h、48h和72h的后期,蜂胶黄酮对提高PPV感染PK-15细胞后产生抗感染因子能力比较弱.说明蜂胶黄酮提高PPV感染PK-15细胞产生抗感染因子主要集中在感染的早期.

摘要： 为了研究蜂胶黄酮对猪肾脏细胞(PK-15细胞)感染PPV后产生抗感染因子的影响,试验将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg·mL-1倍比稀释5个浓度,与PPV一起加至长成单层PK-15细胞培养体系中,用ELISA方法测定蜂胶黄酮对PPV感染PK-15细胞后产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子含量的变化.结果表明:与病毒对照组比较,在感染PPV后2h、12h的前期,只有较高浓度的蜂胶黄酮可以显著提高PK-15细胞产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子含量的能力.PK-15细胞在感染病毒后24h、48h和72h的后期,蜂胶黄酮对提高PPV感染PK-15细胞后产生抗感染因子能力比较弱.说明蜂胶黄酮提高PPV感染PK-15细胞产生抗感染因子主要集中在感染的早期.

摘要： 为了研究蜂胶黄酮对猪肾脏细胞(PK-15细胞)感染PPV后产生抗感染因子的影响,试验将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg·mL-1倍比稀释5个浓度,与PPV一起加至长成单层PK-15细胞培养体系中,用ELISA方法测定蜂胶黄酮对PPV感染PK-15细胞后产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子含量的变化.结果表明:与病毒对照组比较,在感染PPV后2h、12h的前期,只有较高浓度的蜂胶黄酮可以显著提高PK-15细胞产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子含量的能力.PK-15细胞在感染病毒后24h、48h和72h的后期,蜂胶黄酮对提高PPV感染PK-15细胞后产生抗感染因子能力比较弱.说明蜂胶黄酮提高PPV感染PK-15细胞产生抗感染因子主要集中在感染的早期.

摘要： 为了研究猪肾细胞(PK15)中ABCA1mRNA与miRNA-758表达量之间的关系,试验利用miR-758模拟物(mimic)、miR-758抑制物(inhibitor)及其各自的阴性对照分别转染PK15细胞,利用qRT-PCR技术检测转染24小时后细胞内ABCA1mRNA与miR-758相对表达量并讨论其之间的关系.结果表明:在PK15细胞中转染miR-758mimic、miR-758inhibitor及其各自的阴性对照后,ABCA1mRNA表达量均极显著升高(P＜0.01).转染miR-758mimic的PK15细胞miRNA-758表达量极显著高于空白对照组(P＜0.01)直至30000多倍,而其他转染组miR-758表达量均低于对照组,但差异不显著.说明miR-758mimic、miR-758inhibitor及其各自的阴性对照均可导致PK15细胞内ABCA1mRNA表达量升高;miR-758mimic可促进PK15细胞miR-758表达量上升30000多倍,而对ABCA1mRNA表达量并未表现出抑制作用,说明PK15细胞中ABCA1mRNA的表达量不受miR-758mimic影响或受影响小;miR-758inhibitor确实能够抑制miR-758表达量,并使ABCA1mRNA表达量升高.

摘要： 为了研究猪肾细胞(PK15)中ABCA1mRNA与miRNA-758表达量之间的关系,试验利用miR-758模拟物(mimic)、miR-758抑制物(inhibitor)及其各自的阴性对照分别转染PK15细胞,利用qRT-PCR技术检测转染24小时后细胞内ABCA1mRNA与miR-758相对表达量并讨论其之间的关系.结果表明:在PK15细胞中转染miR-758mimic、miR-758inhibitor及其各自的阴性对照后,ABCA1mRNA表达量均极显著升高(P＜0.01).转染miR-758mimic的PK15细胞miRNA-758表达量极显著高于空白对照组(P＜0.01)直至30000多倍,而其他转染组miR-758表达量均低于对照组,但差异不显著.说明miR-758mimic、miR-758inhibitor及其各自的阴性对照均可导致PK15细胞内ABCA1mRNA表达量升高;miR-758mimic可促进PK15细胞miR-758表达量上升30000多倍,而对ABCA1mRNA表达量并未表现出抑制作用,说明PK15细胞中ABCA1mRNA的表达量不受miR-758mimic影响或受影响小;miR-758inhibitor确实能够抑制miR-758表达量,并使ABCA1mRNA表达量升高.

摘要： 为了研究猪肾细胞(PK15)中ABCA1mRNA与miRNA-758表达量之间的关系,试验利用miR-758模拟物(mimic)、miR-758抑制物(inhibitor)及其各自的阴性对照分别转染PK15细胞,利用qRT-PCR技术检测转染24小时后细胞内ABCA1mRNA与miR-758相对表达量并讨论其之间的关系.结果表明:在PK15细胞中转染miR-758mimic、miR-758inhibitor及其各自的阴性对照后,ABCA1mRNA表达量均极显著升高(P＜0.01).转染miR-758mimic的PK15细胞miRNA-758表达量极显著高于空白对照组(P＜0.01)直至30000多倍,而其他转染组miR-758表达量均低于对照组,但差异不显著.说明miR-758mimic、miR-758inhibitor及其各自的阴性对照均可导致PK15细胞内ABCA1mRNA表达量升高;miR-758mimic可促进PK15细胞miR-758表达量上升30000多倍,而对ABCA1mRNA表达量并未表现出抑制作用,说明PK15细胞中ABCA1mRNA的表达量不受miR-758mimic影响或受影响小;miR-758inhibitor确实能够抑制miR-758表达量,并使ABCA1mRNA表达量升高.

摘要： 为了研究猪肾细胞(PK15)中ABCA1mRNA与miRNA-758表达量之间的关系,试验利用miR-758模拟物(mimic)、miR-758抑制物(inhibitor)及其各自的阴性对照分别转染PK15细胞,利用qRT-PCR技术检测转染24小时后细胞内ABCA1mRNA与miR-758相对表达量并讨论其之间的关系.结果表明:在PK15细胞中转染miR-758mimic、miR-758inhibitor及其各自的阴性对照后,ABCA1mRNA表达量均极显著升高(P＜0.01).转染miR-758mimic的PK15细胞miRNA-758表达量极显著高于空白对照组(P＜0.01)直至30000多倍,而其他转染组miR-758表达量均低于对照组,但差异不显著.说明miR-758mimic、miR-758inhibitor及其各自的阴性对照均可导致PK15细胞内ABCA1mRNA表达量升高;miR-758mimic可促进PK15细胞miR-758表达量上升30000多倍,而对ABCA1mRNA表达量并未表现出抑制作用,说明PK15细胞中ABCA1mRNA的表达量不受miR-758mimic影响或受影响小;miR-758inhibitor确实能够抑制miR-758表达量,并使ABCA1mRNA表达量升高.

摘要： 为了实现PK15细胞的无血清培养,试验采用逐步降低培养液中血清量的方法对PK15细胞进行无血清培养驯化,并在驯化成功的PK15细胞上培养PCV2(猪圆环病毒2型).结果表明,血清浓度在0.1％时的细胞可正常生长并且对PCV2的增殖性能和病毒滴度没有改变.

摘要： 为了实现PK15细胞的无血清培养,试验采用逐步降低培养液中血清量的方法对PK15细胞进行无血清培养驯化,并在驯化成功的PK15细胞上培养PCV2(猪圆环病毒2型).结果表明,血清浓度在0.1％时的细胞可正常生长并且对PCV2的增殖性能和病毒滴度没有改变.

摘要： 本发明涉及一种适应PK‑15全悬浮生长的无血清培养基及其制备方法和应用于pK‑15细胞的全悬浮驯化方法，该培养基包含氨基酸、吐温、亚油酸、维生素E、豆蔻酸、硬脂酸、维生素A、β‑巯基乙醇、氯化钠、葡萄糖、氯化镉、亚油酸、氯化胆碱、肌醇和偏钒酸铵等物质。本发明提供的无血清培养基，能够实现PK‑15细胞全悬浮生长，从而省略微载体成本及消化过程，解决PK‑15细胞微载体悬浮培养过程中难以消化放大的技术问题。

摘要： 本发明涉及一种用于PK15细胞培养的无血清培养基，包含无血清基础培养基和添加物，所述添加物为KGF活性短肽（氨基酸序列为KGHLLMF）和花生蛋白酶解物。所述添加物可显著促进悬浮培养PK15细胞的生长、高存活率以及保持培养的猪圆环病毒高滴度。本发明所述培养基可实现PK15细胞全悬浮无血清培养，且无需微载体，即可以实现大规模高密度培养，使用所述培养基可获得高滴度的猪圆环病毒。

摘要： 本发明涉及一种PK15细胞的低血清培养方法、通过该方法获得的PK15细胞及其应用；所述PK15细胞的低血清培养方法，包括：1)取贴壁培养的PK15细胞进行复苏，然后消化传代；2)将细胞置于含3％牛血清的MD611细胞培养液中进行传代；3)将细胞以体积比1:2.5的比例进行传代至细胞铺满单层；4)将细胞以体积比1:3的比例进行传代至细胞铺满单层，得到适应低血清培养的PK15细胞；所述应用为通过PK15细胞进行TGEV华毒株的增殖培养，包括：准备PK15细胞；接入毒株；收集病毒液；本发明使TGEV华毒株能在低血清条件下连续至少传代培养5代，均能使PK15细胞产生明显病变。

摘要： 本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种适应无血清悬浮培养的LLC‑PK1Sa细胞驯化方法和应用。本发明涉及的细胞悬浮驯化方法主要指逐步降血清和逐步增加悬浮培养基相结合的方法，最终获得无血清悬浮培养型LLC‑PK1Sa细胞，同时本发明提供了无血清悬浮培养LLC‑PK1Sa细胞在生产猪丁型冠状病毒中的应用。应用该细胞增殖的病毒滴度高，稳定性好，可显著降低生产成本，有利于规模化生产，具有良好的市场前景。

摘要： 本发明公开了一种使PK‑15细胞形成团块和传代培养的方法，具体步骤为：先对PK‑15细胞进行复苏，再进行细胞传代，然后配制特定的悬浮培养基，将PK‑15细胞与悬浮培养基混合倒入摇瓶中，再将摇瓶置于摇床进行悬浮培养，悬浮培养一段时间后再取样观察细胞生长状况，进行细胞计数，再进行细胞传代，得到团块状细胞，继续对团块状细胞进行细胞传代；连续传代并观察PK‑15细胞状态，得到成球形团块状的PK‑15细胞。本发明的培养方法在在不进行细胞驯化和基因改造的情况下，能直接悬浮PK‑15细胞，使得PK‑15细胞形成球形团生长，球形团块直径为20～80μm，还能够连续传15代以上。

摘要： 本发明公开了一种全悬浮无血清型PK‑15细胞的驯化方法，属于兽用生物制品领域。本发明提供的驯化方法包括以下步骤：贴壁型PK‑15细胞的培养—全悬浮型PK‑15细胞的驯化—全悬浮无血清型PK‑15细胞的驯化，其中在培养基中含9‑11％新生牛血清的条件下将贴壁型PK‑15细胞驯化为全悬浮型PK‑15细胞，并在全悬浮无血清型PK‑15细胞的驯化步骤中逐渐降低培养基中的血清浓度至血清浓度为0％，能够驯化获得可稳定传代培养的全悬浮无血清型PK‑15细胞。利用该全悬浮无血清型PK‑15细胞可大规模悬浮培养获得TCID50达10‑7/0.1ml以上的塞内卡病毒培养液。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体涉及抗PK34单克隆抗体和杂交瘤细胞系及其制备与测序方法。所述杂交瘤细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C202226。制备方法包括：PK34作为免疫原免疫小鼠，通过ELISA法确定抗血清对PK34的效价；制备滋养细胞、骨髓瘤细胞和脾细胞，再将细胞电融合，筛选得到特异性针对PK34的融合细胞株；进行细胞亚克隆，筛选得到较高特异性的单克隆细胞株。本发明制备出抗PK34单克隆抗体及其杂交瘤细胞系，完成杂交瘤抗体全长测序。后续可通过基因工程体外获得重组抗体，极大规避了杂交瘤细胞退化阳性丢失的风险。若未来PK34抗菌肽能运用于结核病临床治疗中，则该抗体可用于疾病的分析与病情监测。

摘要： 本发明涉及一种用于PK15细胞培养的无血清培养基，包含无血清基础培养基和添加物，所述添加物为KGF活性短肽（氨基酸序列为KGHLLMF）和花生蛋白酶解物。所述添加物可显著促进悬浮培养PK15细胞的生长、高存活率以及保持培养的猪圆环病毒高滴度。本发明所述培养基可实现PK15细胞全悬浮无血清培养，且无需微载体，即可以实现大规模高密度培养，使用所述培养基可获得高滴度的猪圆环病毒。

摘要： 本发明公开了稳定表达Cas9蛋白的LLC‑PK1细胞系及其构建方法，所述LLC‑PK1细胞是猪近端肾小管上皮细胞LLC‑PK1为宿主细胞，转染含Cas9的慢病毒表达载体，经过5μg/mL的嘌呤霉素筛选得到的能够稳定表达Cas9蛋白的转化体，构建方法包括以下步骤：步骤一，pLentiCRISPRv2‑Blast无内毒素质粒制备；步骤二，慢病毒包装；步骤三，细胞转染；步骤四，多细胞克隆筛选；步骤五，单细胞克隆筛选；本发明所筛选出的LLC‑PK1‑Cas9过表达阳性多克隆细胞株包含完整的Cas9基因序列，LLC‑PK1‑Cas9EDG120过表达单克隆细胞株成功表达Cas9蛋白，本发明构建的LLC‑PK1细胞系既可以用于筛选特异基因缺失或插入的基因组编辑细胞系，还可以为研究特异基因功能或解析微生物与宿主细胞相互作用的信号通路提供新手段。

摘要： 本实用新型涉及细胞培养领域，具体是涉及一种PK细胞培养的二氧化碳培养箱，包括：培养箱体，锁紧机构，用于密封培养箱体，锁紧机构设置于培养箱体的外侧，动态培养机构，用于PK细胞的动态培养，动态培养机构设置于培养箱体的内部，培养存放机构，用于放置PK细胞，培养存放机构设置于动态培养机构上，控温丝，用于调节培养箱体内的温度，控温丝设置于培养箱体的内部里侧，二氧化碳供应机构，用于培养箱体内导入二氧化碳气体，二氧化碳供应机构设置于培养箱体的外侧，本实用解决了传统的培养箱二氧化碳供应不足，以及无法动态培养细胞的问题，提高了PK细胞的培养效果，以及使PK细胞能够在不同状态下进行培养。