拷贝数

摘要： 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术对重组毕赤酵母基因组中左聚糖蔗糖酶基因(SacB)的拷贝数及信使核糖核酸(mRNA)转录水平进行检测分析,并用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定菌株不同诱导时间下左聚糖蔗糖酶水解活力。结果表明,在BMMY液体培养基中经甲醇诱导24 h时,样品转录水平皆达到最大值,此时多拷贝菌株转录水平(2.13)为单拷贝菌株(0.42)的5.1倍;左聚糖蔗糖酶活力在甲醇诱导24 h后均随诱导时间不断上升,多拷贝菌株酶活(13.96 U/mL)较单拷贝菌株(5.48 U/mL)提高1.5倍。重组毕赤酵母整合的左聚糖蔗糖酶基因在1~3个拷贝范围内,随着拷贝数增加,多拷贝菌株较单拷贝菌株的mRNA转录水平及相应的蛋白表达量均显著增加(P<0.05),说明毕赤酵母是表达基因SacB的良好宿主。

摘要： 【目的】为验证转As6G-FFT烟草的基因功能,筛选稳定遗传的阳性株系材料,以建立基于SYBR Green的实时荧光定量PCR的转基因拷贝数检测方法。【方法】利用PCR检测、实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术及生理指标分析鉴定转As6G-FFT基因阳性烟草植株,并利用基于SYBR Green的实时荧光定量PCR鉴定阳性转基因烟草中As6G-FFT基因的拷贝数。【结果】(1)基于PCR检测,14个转基因烟草叶片均能扩增出目的片段,表明14个株系中均已成功转入目的基因As6G-FFT;(2)14个转基因株系中As6G-FFT基因表达量呈极显著(P<0.01)或极其显著上升(P<0.001),其中6个株系的表达量呈极其显著升高(P<0.001);且其表达量与野生型相比最高提高215.13倍;(3)基于生理指标,测定转As6G-FFT基因烟草的果聚糖含量,发现14个转基因株系中果聚糖含量呈极显著(P<0.01)或极其显著上升(P<0.001),其中13个株系的果聚糖含量极其显著升高(P<0.001);且其果聚糖含量与野生型相比最高提高10.47倍;(4)基于SYBR Green实时荧光定量PCR构建As6G-FFT和Nt ACT基因的标准曲线,分别为y=-0.2907x+3.0145和y=-0.2813x+8.0141,R^(2)均为1;在检测的14个转基因株系中As6G-FFT基因拷贝数为1~3,其中1、2和3拷贝的单株数分别占总数的35.7%、50.0%和14.3%。【结论】本研究从DNA、RNA和生理水平综合进行阳性转基因烟草的鉴定,鉴定结果更为准确。此外,还建立了基于SYBR Green实时荧光定量PCR的转基因烟草中外源As6G-FFT基因拷贝数检测方法,可用于快速、高效地估算转基因烟草中外源基因拷贝数,为后续获得稳定遗传材料提供筛选依据。

摘要： 研究人员常用单细胞转录组学分析法研究人类肿瘤。然而想通过该方法将肿瘤微环境中的正常细胞与恶性细胞区分开,并找出肿瘤内的克隆亚结构仍具有挑战性。为了解决这些挑战,近日美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心等机构的研究人员开发了一种称为非整倍体肿瘤的拷贝数染色体核型分析(CopyKAT)的集成的贝叶斯分割方法,该方法可以深度读取高通量单细胞RNA测序(scRNA)的数据以评估基因组拷贝数的情况(平均基因组分辨率为5 Mb)。

摘要： 为探究猪痘病毒作为载体表达猪圆环病毒2型(PCV2)-Cap蛋白,插入外源基因P28-ORF2的拷贝数与PCV2-Cap蛋白表达量的关系.本试验以猪痘病毒为载体,通过双酶切连接及无缝克隆方法构建重组质粒,并纯化到了8株含不同拷贝数(1～8拷贝)P28-ORF2的重组猪痘病毒,基于荧光斑大小、电镜观察病毒粒子及Western blotting结果进行判断.纯化到的8株重组病毒的荧光斑直径为317.41～384.96μm,大小无明显差异.重组猪痘病毒粒子形态与亲本病毒一致.Western blotting结果为插入1拷贝P28-ORF2的重组蛋白表达量最低;随着P28-ORF2拷贝数的增加,PCV2-Cap表达量也随之增加;至插入4拷贝P28-ORF2时,PCV2-Cap表达量达到峰值;随后减少.8株重组猪痘病毒荧光斑大小无明显差异,表明猪痘病毒基因组中插入不同拷贝数P28-ORF2对重组病毒在PK15细胞内的增殖无影响.重组猪痘病毒粒子的形态未发生变化说明多拷贝外源基因的插入并未对猪痘病毒的结构造成影响.本研究结果表明,猪痘病毒为载体表达外源蛋白时,单启动子启动多拷贝外源序列能明显提高外源蛋白的表达量,插入4拷贝的外源序列为较合适的拷贝数.

摘要： [目的]探明大青叶蝉不同发育历期和组织器官中Sulcia muelleri和Sodalis sp内共生菌的分布,为利用内共生菌对大青叶蝉进行生物防治提供参考.[方法]设计内共生菌S.muelleri和Sodalis sp.的16S rDNA的特异引物,检测在大青叶蝉不同发育历期的感染情况;同时利用绝对定量PCR对大青叶蝉不同发育历期和成虫组织器官中2种内共生菌的拷贝数进行检测.[结果]大青叶蝉的卵、若虫、雌雄成虫均感染了S.muelleri和Sodalis sp,感染率均为100％;S.muelleri拷贝数在5龄若虫中最高,而Sodalis sp.的拷贝数在雌虫中最多,S.muelleri和Sodalis sp.拷贝数在卵中均最少.S.muelleri和Sodalis sp.拷贝数在菌胞组织中均较高,在雄虫和雌虫的唾液腺中较少.

摘要： [目的]检测5种芦竹属菌草绿洲成熟期根样本内生固氮菌的丰度及nifH基因的表达,为nifH基因的快速定量检测及实时监测提供技术手段.[方法]采用实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)分析根样本内生固氮菌nifH基因的拷贝数及相对表达量.[结果]5种芦竹属菌草成熟期根样本内生固氮菌nifH基因表达量及拷贝数均有较大的差异.其中,绿洲2号nifH基因相对表达量最高,呈过表达水平,且绿洲2号样本差异达显著水平(P＜0.05),其余各样本差异不显著;固氮基因nifH的拷贝数呈逐步递减,其中绿洲1号样本nifH基因的拷贝数最高,达8.84×1011/g;绿洲5号最低,达1.54×1011/g,各样本的差异均达到显著水平.[结论]基于实时荧光定量PCR对固氮基因nifH的定量及定性分析,可为nifH基因的定量检测及表达情况提供理论依据.

摘要： 目的 利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术,对猪基因组中猪内源逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)拷贝数测定方法进行优化,建立PERV拷贝数的检测方法.方法 采用TaqMan探针双重ddPCR方法,分别以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFRC)为内参基因,确定对PERV拷贝数检测反应最适合退火温度和反应循环数.另外,通过对浓度梯度稀释的标准品质粒和猪细胞基因组进行检测,以确定最适模板浓度.采用ddPCR和qPCR两种方法测定来自猪源细胞系和巴马小型猪组织中PERV的拷贝数,比较两种检测方法的稳定性.结果 基于ddPCR技术检测PERV拷贝数的最适退火温度为59.9°C,最佳反应循环数为50;模板基因组的最适浓度在1.25～7.5 ng;检测同一样品来源基因组中PERV的拷贝数的变异系数在0.44％～8.29％.结论 本研究建立了基于ddPCR技术的PERV拷贝数的检测方法并系统的探索了最佳实验条件,与传统的qPCR相比,该方法具有更高的准确性和可重复性,为异种移植研究中供体动物基因组PERV拷贝数的测定提供了灵敏的方法和可靠依据.

摘要： 目的探讨荧光定量PCR检测结核杆菌DNA的拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度的相关性。方法选取可疑结核病患者1 012例,取TB-DNA标本1 012份,同时应用荧光定量PCR检测和涂片抗酸染色镜检,根据图片抗酸染色镜检结果进行分类,统计分析荧光定量PCR检测结核杆菌DNA的拷贝数。结果 1 012份标本中包括阳性标本241份,阴性标本771份;771份阴性标本中189份荧光定量PCR检测结果为阳性,结核杆菌DNA拷贝数大多为102~103数量级;241份阳性标本中223份荧光定量PCR检测阳性,结核杆菌DNA拷贝数大多为103~104数量级,与涂片阳性程度表现为正相关。结论荧光定量PCR检测结核杆菌DNA的拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度存在较为明显的相关性,可作为结核杆菌检测的有效方法。

摘要： 目的：本文通过分析线粒体DNA 4977bp缺失的比例和拷贝数来观察其是否与线粒体病的临床表现及其临床表现的复杂程度相关;rn 方法：采集2003年12月至2013年12月160例临床诊断为线粒体病但排除热点突变的住院患者和101例正常对照人群的外周静脉血,提取总DNA.所有人按年龄分为2组,即组1(低年龄组)在0至10岁之间,组2(高年龄组)在10到20岁之间.线粒体病人临床表现主要包括癫痫，肌病，发育倒退，发育迟缓，乳酸酸中毒，视力下降，听力下降，呕吐或腹泻，精神心理障碍。本课题定义患者临床表现的种类越多，疾病越复杂。用Taqman探针实时定量聚合酶链反应(real-time qPCR)检测外周血线粒体DNA 4977bp的缺失比例。缺失比例=mtDNA4977bp缺失的拷贝数/总mtDNA拷贝数。所有数据经相应的对数转换后，符合正态分布。用独立T-Test、方差分析和Spearman相关分析进行统计；rn 结果：1.ΔmtDNA4977，缺失比例随年龄的增加而增加;2.线粒体病组ΔmtDNA4977缺失比例和平均每个细胞的ΔmtDNA4977的拷贝数比正常对照组高(组1:2.66±0.63 vs 1.86±0.65,p<0.001;组2:3.09±0.74 vs 2.36±0.50,p<0.001);3线粒体病组的总mtDNA的拷贝数在低年龄组中高于正常对照组(2.07±0.39 vs 1.76±0.51，p<0.001)，而在高年龄组中则低于正常对照组(1.96±0.50 vs 2.21±0.46,p=0.003)，但总体趋势是随着年龄的增加而降低的;4.ΔnmtDNA4977缺失比例和平均每个细胞的ΔmtDNA4977的拷贝数与线粒体病的复杂程度呈正相关(组1:比例为r=0.519,p<0.001;拷贝数为r=0.389，p<0.001;组2:比例为r=0.772，p<0.001；拷贝数为r=0.607，p=0.001)，同时ΔmtDNA4977缺失比例也和临床表现中的发育倒退，乳酸酸中毒，视力减退，呕吐/腹泻和精神心理障碍成正相关，平均每个细胞ΔmtDNA4977的拷贝数和临床表现中的发育倒退，乳酸酸中毒和视力减退呈正相关，而总的mtDNA的拷贝数则和线粒体病的复杂程度呈负相关(组1: r=-0.260,p=0.002；组2:r=-0.430,p=0.032)，与发育倒退，乳酸酸中毒和呕吐/腹泻呈负相关；rn 结论：mtDNA 4977bp缺失可能与线粒体病相关，ΔmtDNA4977比例，拷贝数和总mtDNA拷贝数是无热点突变的线粒体病患者的临床表现复杂程度的参考指标之一。

摘要： 本研究的目的是建立猪内源性反转录病毒(porcine endogenousretrovirus，PERV)在基因组中整合拷贝数的检测方法。设计并合成了检测PERV pol基因的引物，采用基于SYBR Green I的实时荧光定量PcR方法，检测小型猪基因组DNA中多聚酶基因(pol)的拷贝数，估算出单细胞基因组中PERV整合的拷贝数，从而建立起PERV整合拷贝数的检测方法，并对该方法进行特异性、敏感性、重复性分析。结果表明，该检测方法特异性较高，敏感性高于普通PCR方法。五指山猪与巴马小型猪基因组中均可检测到pol基因的存在，五指山猪单细胞基因组中PERV的拷贝数为1.38±0.33至14.23±3.31之间，巴马小型猪单细胞基因组中PERV的拷贝数为2.96±0.76至58.46±3.50之间。统计学分析表明五指山猪与巴马小型猪单细胞基因组中PERV的拷贝数具有显著性差异，五指山猪基因组中整合的PERV拷贝数较低。五指山猪基因组中PERV的基因序列负荷较低，因此有希望通过选择性育种获得PERV低拷贝猪，在此基础上则易于进一步筛选出无完整PERV前病毒的小型猪个体，也易于通过基因敲除去除PERV，从而为异种移植提供合适供体。此外，基于SYBRGreen Ⅰ的PERV拷贝数的定量PcR检测方法，简便易行，可在短时间内检测大量样品，费用低廉，利于对猪群进行大规模筛选，既可用于实验用猪的病原安全性评价，也可用于异种移植后PERV存在与表达状况的监测。

摘要： 微型反向重复转座元件(miniature inverted repeat transposable element,MITE)是20世纪90年代在禾本科植物中发现的一类特殊的DNA转座子,也是基因组中的一种重要的功能基因,其在结构上与非自主DNA转座子相似,但具有反转录转座子的高拷贝数特点.它能够通过自身的位置转移、增加拷贝数等行为影响基因组的大小和基因的功能实现.

摘要： 本发明FRS2基因的拷贝数扩增及其应用、检测拷贝数扩增的特异性引物对，属于生物技术领域。所述拷贝数扩增的倍数为3倍以上。在拷贝数扩增的膀胱癌样本中新生血管密度大。在体外培养的膀胱癌细胞系中利用特异性siRNA干扰FRS2的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力和膀胱癌细胞诱导血管内皮细胞成小管的能力。所述的FRS2基因的拷贝数扩增在制备检测膀胱癌试剂盒中的应用。本发明具有以下优点：本发明的拷贝数扩增可以作为分子探针或靶向引物的生物检测指标之一，用来开发膀胱癌筛查试剂盒。

摘要： 本发明提供一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法，采用Real‑Time实时荧光定量PCR技术，选取合适的物种标准化基因(即内参基因)，与外源基因进行相对定量的检测，通过二者的扩增曲线，计算外源基因拷贝数，再结合传统的Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。按照对转基因作物不同拷贝数的需求，通过本方法，可以快速、高通量的检测和筛选到转基因作物中所需的拷贝植株。

摘要： 本发明提供了一种检测拷贝数扩增的方法和装置及建立检测拷贝数扩增的动态基线的方法和装置。建立动态基线的方法包括：利用同一批次多个样本各自的测序数据检测得到各样本对应的拷贝数V0；根据各样本对应的拷贝数V0，确定阳性样本和极值样本；从同一批次多个样本中去除阳性样本和极值样本，得到阴性样本；利用阴性样本的测序数据建立同一批次多个样本的批次参考基线，记为动态基线。该动态基线因采用同批次样本构建所得，故能去除上游实验、操作误差对于基线的影响，进而避免了测序批次、实验操作、实验试剂改变造成的基线误差问题，从而准确确定样本的拷贝数，进而利于准确检测其扩增状态，避免了对样本错检或漏检的现象。

摘要： 本发明FRS2基因的拷贝数扩增及其应用、检测拷贝数扩增的特异性引物对，属于生物技术领域。所述拷贝数扩增的倍数为3倍以上。在拷贝数扩增的膀胱癌样本中新生血管密度大。在体外培养的膀胱癌细胞系中利用特异性siRNA干扰FRS2的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力和膀胱癌细胞诱导血管内皮细胞成小管的能力。所述的FRS2基因的拷贝数扩增在制备检测膀胱癌试剂盒中的应用。本发明具有以下优点：本发明的拷贝数扩增可以作为分子探针或靶向引物的生物检测指标之一，用来开发膀胱癌筛查试剂盒。

摘要： 一种荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的方法，通过分别选取人核基因组DNA和线粒体基因组中的一个单拷贝基因，设计引物和探针，然后将序列片段转入PMD‑18T载体中，经转化后提取质粒得到其拷贝数并作为参考标准品；在实际检测时，以参考标准品的Cq值制作标准曲线比较得到待测样品中的核基因组DNA的拷贝数和线粒体基因组DNA的拷贝数。本发明为定量分析人不同组织细胞中线粒体基因组拷贝数提供了方法，特异性高，操作简单，只需荧光定量PCR仪就能完成线粒体基因组拷贝数的快速检测。

摘要： 本发明提供一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法，采用Real-Time实时荧光定量PCR技术，选取合适的物种标准化基因(即内参基因)，与外源基因进行相对定量的检测，通过二者的扩增曲线，计算外源基因拷贝数，再结合传统的Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。按照对转基因作物不同拷贝数的需求，通过本方法，可以快速、高通量的检测和筛选到转基因作物中所需的拷贝植株。

摘要： 本发明公开了一种基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法，一种利用PCR技术对基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法，本方法通过对同一组织DNA样本分别实施某些多拷贝基因和某已知单拷贝基因的PCR扩增并纯化产物，测定各基因PCR纯化产物的质量浓度后根据其核酸序列，将质量浓度换算成摩尔浓度，再分别以梯度稀释后的PCR产物以及组织DNA样本为模板通过同一RT-PCR反应制作这些基因的标准曲线同时获得各基因在DNA样品中的浓度，由于在同一抽提效率下，多拷贝基因的拷贝数就是在相同体积下多拷贝基因的数量除以单拷贝基因的数量，由此可以利用一次96孔RT-PCR反应测定同一生物个体中7个不同多拷贝基因的拷贝数；也可以利用一次384孔RT-PCR反应测定11个不同多拷贝基因的拷贝数，实现快速批量的测定效率。

摘要： 本发明公开了一种基于梯状回收的基因拷贝数鉴定和各拷贝序列获得的方法，克服了目前判断基因拷贝数所采用的Southern杂交、竞争性PCR、实时定量PCR均不能确定每个拷贝的核苷酸序列的缺陷。其技术方案是：基因组DNA充分酶切→酶切产物电泳→梯状回收→PCR扩增→判断基因拷贝数→PCR产物克隆测序→获得每个拷贝的核苷酸序列。本发明可成功的判断脱水素基因在无核白葡萄中的拷贝数，结果与Southern杂交结果相同，并且获得了不同拷贝脱水素基因的部分核苷酸序列。可用于判断内源和外源基因的拷贝数，是以较低的成本判断基因拷贝数以及获得每个拷贝的核苷酸序列。其原理及操作简单，成本低廉，具有广阔的开发应用前景。

摘要： 本申请公开了一种单细胞拷贝数变异探测方法、装置、设备及介质，所述方法包括根据基底细胞癌的单细胞ATAC测序数据，将染色体划分为互不相交的预设长度的窗口，统计每个细胞在每个窗口内的测序数量，得到读数矩阵；根据没有拷贝数变异的非肿瘤细胞计算每个窗口的读数基准，得到非肿瘤细胞在每个窗口内的读数基准值；根据所述读数矩阵以及非肿瘤细胞在每个窗口内的读数基准值，采用BIC准则将染色体进行分割，合并连续的拷贝数变异窗口，得到存在拷贝数变异的染色体片段和不同片段之间的断点。根据该方法，可以提高肿瘤单细胞拷贝数变异检测的精确度，尤其在数据集中存在多个细胞类型或数据稀疏、噪音大的情况下具有较高的应用前景。

摘要： 本发明涉及一种检测FGF19基因拷贝数和/或扩增的试剂盒及检测方法、用途。RPP30基因作为内参基因在检测FGF19基因拷贝数和/或扩增中的用途；试剂盒包括：检测RPP30基因序列的第一引物对和/或第一探针；以及检测FGF19基因序列的第二引物对和/或第二探针，该试剂盒用于检测FGF19基因拷贝数和/或扩增。本发明采用RPP30基因作为内参基因，用于检测FGF19基因拷贝数和/或扩增，可避免出现假阳性现象，具有检测方便、准确性高等优点。