绝对定量

摘要： 【目的】利用SYBR Green I荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证。【结果】建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应。检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×10^(1) copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403%。【结论】成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测。

摘要： 数字PCR(digital PCR,dPCR)技术是基于“有限稀释”和“泊松分布”原理迅速发展的第三代PCR技术,无需标准品即可实现样品的绝对定量,灵敏度高、操作简单,在疫病检测、转基因鉴定、食品检测等方面得到快速发展,而在动物疫苗研究领域也被越来越多用于质控、筛查和定量。本文从动物疫苗研究的角度,阐述了数字PCR在动物疫苗基因变异检测、基因定量、效价测定、疫苗效果评价等方面的发展潜力。该技术将有助于解决动物疫苗研究过程中的病毒生长曲线和疫苗效价测定以及基因变异分析等重点难点问题,未来将成为疫苗研发的有力工具。

摘要： 巴氏德醋杆菌(Acetobacter pastcurianum)在低温沼气发酵过程中能够提高牛羊粪沼气产量,同时也可增加发酵残渣纤维素含量。为探究其在低温沼气发酵过程中的作用,使用荧光定量PCR的方法对不同处理发酵过程中添加的巴氏德醋杆菌(Acetobacter pastcurianum)进行定量分析。试验结果表明,巴氏德醋杆菌(Acetobacter pastcurianum)质粒标准曲线方程为y=-3.024x+30.73,误差为0.0680。处理2、4、7中巴氏德醋杆菌(Acetobacter pastcurianum)基因拷贝数分别为1.83 fg·μL^(-1)、33.77 fg·μL^(-1)和31.93 fg·μL^(-1),巴氏德醋杆菌(Acetobacter pastcurianum)基因拷贝数分别比对照组高出90%、54%和45.6%,且3个处理的产气量也相对较高。建立低温沼气发酵中添加巴氏德醋杆菌的荧光定量检测体系,可以更加快速灵敏地进行添加菌的相关性变化规律分析,为北方地区冬季低温沼气发酵促进菌剂的筛选奠定相关理论基础。

摘要： 本研究旨在建立对肠道主要共生菌的快速定量方法。根据细菌16S rRNA基因的保守序列并参考相关研究,设计针对总肠道菌群的通用引物和探针,以及针对双歧杆菌属、肠球菌属和肠杆菌科的特异性引物和探针,采用引物设计工具(Primer-BLAST)以及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增以验证引物和探针的特异性。通过分子克隆技术,构建各目标菌属目的基因的重组质粒作为qPCR检测的标准模板,选择标准模板进行重复性实验,并计算组内和组间重复变异系数。用所建立的方法对不同年龄段的临床粪便标本进行3类细菌的检测,并初步分析这些菌群与增龄的关系。结果显示,引物和探针具有较高的特异性;各目的细菌标准曲线在一定范围内线性关系良好,总菌群或各目标菌属的线性范围分别为:总菌群2.9×103~2.9×10^(12)copies/μL、双歧杆菌3.1×10^(2)~3.1×10^(9)copies/μL、肠球菌5.9×10^(2)~5.9×10^(9)copies/μL、肠杆菌6.3×10^(2)~6.3×10^(9)copies/μL,决定系数R2≥0.995;检测的最低拷贝数为总菌群7.5×10^(2)copies/μL、双歧杆菌46 copies/μL、肠球菌37 copies/μL、肠杆菌51 copies/μL;重复性实验变异系数在1.32%以下,具有良好的可重复性。对不同年龄段临床粪便标本检测的结果显示,肠球菌和肠杆菌含量随增龄呈增长趋势,且老年组含量显著高于青年组,但在高龄老年人中未发现肠球菌数量增加。双歧杆菌含量随增龄减少,且各组间差异显著,在高龄老年人中也未观察到双歧杆菌显著减少。结果提示,本研究建立了一种可供临床推广的菌群绝对定量方法,能够同时检测3类细菌和菌群总量,对于菌群定量研究具有实际意义。

摘要： 数字聚合酶链式反应(dPCR)是继实时定量聚合酶链反应之后发展起来的不依赖于标准曲线的高灵敏度和高特异性核酸绝对定量分析技术。dPCR的PCR反应体系被分成大量独立的反应分子池,在其进行PCR扩增时,核酸拷贝数根据泊松分布校正,最终,实现低浓度样品的绝对定量分析。近年来,基于微流控技术的发展数字聚合酶链式反应检测技术准确性和特异性明显提高。本文详细介绍了数字聚合酶链反应技术的原理,阐述了其在临床疾病诊断方面的应用概况和技术发展。

摘要： 重组人血清白蛋白(HSA,Human serum albumin)基因工程水稻是我国自主研发的可规模化生产水稻重组人血清白蛋白(OsrHSA)的转基因品系,具有极高的推广价值和应用前景,但是目前缺乏对其进行精准定量检测的方法。微滴数字PCR(ddPCR,droplet digital PCR)是近年来新兴的前沿PCR技术,不依赖标准物质即可实现对DNA分子的绝对定量,在转基因产品定量领域被广泛应用。本研究基于ddPCR平台建立了适用于重组人血清白蛋白基因工程水稻(114-7-2品系)的二重ddPCR精准定量检测方法。通过对引物探针的特异性进行验证、对引物探针工作浓度和反应退火温度进行优化,获得最佳反应条件。进而对该方法检测限、定量限和结果重复性做了测定。最后通过对不同含量的重组人血清白蛋白转基因水稻样品进行定量检测,分析比较传统实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和二重ddPCR的优劣,结果表明本研究建立的转基因水稻HSA/PLD二重ddPCR方法稳定性更好、灵敏度高、成本低廉,精准可靠,适用于不依赖标准物质的精准定量HSA转基因水稻转化体含量分析,可取代qRT-PCR方法进行HSA转基因水稻的绝对定量检测,完善了我国转基因水稻成分精确定量检测技术体系。

摘要： 数字PCR技术是一种能够进行绝对定量的核酸检测技术,与实时荧光定量PCR技术相比,该技术敏感性更高、定量不依赖于标准曲线、对反应抑制物的耐受能力也更高。目前,该技术在转基因检测、物种鉴定、疾病诊断、病原微生物鉴定和精确定量分析等领域具有较广阔的应用前景。论文对数字PCR的发展历史、原理、优缺点及在动物疫病诊断中的应用进行了综述,以期为提高动物疫病诊断能力的提供借鉴。

摘要： 数字PCR对核酸分子进行定量检测时不依赖于标准曲线和标准物质,在转基因定量检测中可直接计算出模板中外源基因的拷贝数浓度值和转基因含量.本文概述了数字PCR在转基因定量检测中的应用,将数字PCR与实时荧光定量PCR的技术参数从检测特异性、线性动态范围、准确度、灵敏度、稳健性等方面进行了对比分析,以利其在转基因生物安全管理及转基因标识制度发挥技术支撑作用.本文还阐述了影响数字PCR检测结果的因素,探讨了数字PCR结果溯源至SI单位的可能性,为数字PCR在转基因定量检测以及其它领域核酸精确定量的应用提供参考.

摘要： 数字PCR技术是一种能够进行绝对定量的核酸检测技术,与实时荧光定量PCR技术相比,该技术敏感性更高、定量不依赖于标准曲线、对反应抑制物的耐受能力也更高.目前,该技术在转基因检测、物种鉴定、疾病诊断、病原微生物鉴定和精确定量分析等领域具有较广阔的应用前景.论文对数字PCR的发展历史、原理、优缺点及在动物疫病诊断中的应用进行了综述,以期为提高动物疫病诊断能力的提供借鉴.

摘要： 科学家已经研究获得了大量的蛋白质/多肽潜在生物标志物,这些生物标志物需要经过验证和确证才能进一步转化到临床应用.针对蛋白质/多肽的绝对定量研究在标志物验证和确证过程中起到关键作用.传统的蛋白质定量方法,如酶联免疫吸附试验(ELISA)技术存在蛋白质抗体难以获得、不同抗体批次之间存在差异、基于抗体的检测存在交叉反应等问题.近年来,随着质谱仪器性能的提升,质谱法已经广泛应用于蛋白质大分子以及代谢物小分子定量研究领域,基于质谱法的蛋白质/多肽定量方法也得到发展,其中靶向蛋白质组学技术,如SRM/MRM、PRM和MRM3技术结合标准品可对目标蛋白质/多肽进行精确多重定量.因此,基于靶向质谱法的蛋白质/肽段绝对定量的策略应运而生.根据标准品不同,质谱绝对定量方法包括基于合成肽段、基于合成完整蛋白以及基于标记试剂.本文详细介绍了基于质谱法的蛋白质/多肽绝对定量策略的研究进展,对比各种策略的优势和限制,总结其在生物医学研究领域的应用.同时,还总结了目前蛋白质绝对定量面临的挑战,并根据已有研究报道对提高定量的精确度,促进蛋白质/多肽定量技术向临床转化提出建议,包括对标准品肽段的选择、处理、储存,标准曲线的建立,以及对整个流程严格的质控方法.

摘要： 微滴数字PCR技术是数字PCR技术的一种,是近年来分子生物学领域的新型革命性技术,其特点是高度灵敏、绝对定量及高效方便等.目前,该技术在微生物检测、转基因检测、疾病检测以及质检领域的研究和应用中已凸显优势,随着微滴数字PCR仪的普及,该技术必将被广泛应用于生命科学的各个领域.

摘要： 数字PCR具有更高的灵敏度、精确度和重复性，无需外部参照的绝对定量，易于操作，数据解读简便，直观等优点，针对其应用建议：区分＜2-fold靶标序列浓度差异；定量检测低浓度样本；定量检测高丰度野生型背景中的稀有突变序列；等位基因差异表达，RNA剪接体定量，连锁分析。

摘要： 目的：探究CCl4诱导的大鼠急性肝损伤模型和对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤模型中,血清中microRNAs(miR-122、miR-451、miR-92a、miR-192)的绝对定量伴随肝损伤进展的变化情况,以及探究血清中microRNAs绝对定量与对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤组织病理评分之间相关性. 方法：建立CCl4(1.5ml/kg)诱导的大鼠急性肝损伤模型和对乙酰氨基酚(APAP,160mg/kg)诱导的小鼠急性肝损伤模型,收集建模过程中各时间点的血清,通过MiRbayTM SV miRNA检测试剂盒对血清中microRNAs的含量进行绝对定量,探究血清中microRNAs的变化情况.同时收集对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤模型中各时间点的肝损伤组织,进行组织病理染色、组织病理评分.随后对小鼠血清中microRNAs的含量与肝损伤组织病理评分进行相关性分析. 结果：在两种急性肝损伤模型中,均发现血清中miRNA-122和miRNA-192含量随着肝损伤进展在早期就出现非常明显的升高,在24小时左右维持在最高的水平,72小时逐渐下降至正常水平.miRNA-92a在CCl4诱导的大鼠急性肝损伤模型中,出现波动性的变化,无明显的变化规律,miRNA-451则出现了轻微下降的趋势.miRNA-92a和miRNA-451在小鼠对乙酰氨基酚诱导的肝损伤进展中,均有逐渐下降的趋势,在48小时到达最低点,随后开始恢复.随后相关性分析发现小鼠血清中miRNA-122和miR-192与APAP诱导的肝损伤组织病理评分(DILI-PSS)呈现良好的正相关(分别为R=0.7413,R=0.7883). 结论：血清中microRNA-122和microRNA-192的绝对定量能够反映急性肝损伤进展,并且与对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤组织病理评分具有良好的相关性.

摘要： 随着科学技术的不断发展,各种新的技术被不断的应用于蛋白质组学的研究中.相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术结合多维液相色谱与串联质谱的方法以重复性高、标记简单和定量性好等优点被广泛的应用于蛋白质组学的研究中.iTRAQ技术可以同时对4个或8个不同的蛋白质样品进行相对或绝对定量研究，是目前在蛋白质组学研究中应用非常广泛的标记技术之一。iTRAQ技术不仅可以应用于了解致病微生物的致病机制、癌细胞的癌变机制，为疾病的治疗和药物的研发提供良好的技术平台。还可以应用于分析复杂环境样品中的微生物总蛋白质的定量信息，从而去了解环境中的微生物群落与生态系统之间的关系。

摘要： 本文将ALV-J NX0101毒株接种1日龄和7日龄SPF雏鸡并设阴性对照组，采用实时荧光定量逆转录PCR方法，定期检测病毒在体内的复制情况。根据Genebank发表的ALV-J env基因保守序列(AY897227)设计一对特异性引物扩增目的基因；根据鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列(K01458)，在保守区内设计一对引物扩增内参基因，分别转入质粒作为标准品制作标准曲线，采用SYBR Green I染料建立荧光定量PCR法，并对方法的特异性，敏感性，重复性进行评价.结果表明：标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在线性关系；最低可检测到60个拷贝/反应的病毒数，比常规PCR灵敏度高1000倍。检测结果分别采用绝对定量法和相对定量法进行分析，均达到了良好的效果。通过对病毒含量变化的检测发现，在雏鸡4周龄时，两个接毒组ALV-J病毒突然呈对数式增长。据此分析ALV-J 病毒在体内经过3-4用的潜伏后，突然呈爆发式增长，这种情况可能和临床表现的免疫抑制直接相关；结果还显示，7日龄接毒比1日龄的病毒扩增更加显著。本研究建立了一种特异性强、敏感性高、可定量分析ALV-J病毒增殖的方法，为进一步相关研究奠定了基础。

摘要： 根据不同的实验目的，实时定量PCR对模板的定量有相对定量和绝对定量两种方法，相应的数据分析方法也有不同，本文就各种数据分析方法从适用范围和优缺点等方面进行了归纳总结。

摘要： 一种用于质谱分析的靶向定量系统当在观察模式下操作时可以获取观察模式质谱，所述观察模式质谱包含从添加到包括靶分析物的样品中的多个内标变体产生的离子的质量峰。所述多个内标变体中包含的每个内标变体包含所述靶分析物的独特同位素体并以独特的量添加到所述样品中。所述靶向定量系统可以基于所述观察模式质谱来生成校准曲线。所述靶向定量系统当在定量模式下操作时可以获取定量模式质谱，所述定量模式质谱包含从所述样品中包含的所述靶分析物产生的离子的质量峰。所述靶向定量系统可以基于所述校准曲线和第二质谱来确定所述样品中包含的所述靶分析物的浓度。

摘要： 本发明属于分子检测技术领域。一种用于检测植物内生耐冷假单胞菌的绝对荧光定量PCR特异引物，包括引物16s1和引物16s9；所述引物16s1包括正向引物16s1‑F和反向引物16s1‑R，所述正向引物16s1‑F的序列如SEQID：1所示，所述反向引物16s1‑R的序列如SEQID：2所示；所述引物16s9包括正向引物16s9‑F和反向引物16s9‑R，所述正向引物16s9‑F的序列如SEQID：3所示，所述反向引物16s9‑R的序列如SEQID：4所示。本发明作为绝对实时荧光定量PCR测定核桃等植物内生拮抗菌在病原物不同侵染时期基因表达量的特异引物，用于区别植物内生耐冷假单胞菌与其他内生细菌。

摘要： 一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物，属于分子生物学技术领域。具体检检测方法：采集样本；中华小长臂虾微孢子虫DNA的提取；合成扩增片段大小为141bp的上下游引物；绝对荧光定量PCR方法的建立；标准曲线的绘制；绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验。本发明建立快速，灵敏的中华小长臂虾微孢子虫分子检测方法，与传统的PCR检测方法相比，具有省事、高效、灵敏、定量的特点。

摘要： 本发明公开了一种用于定量耐酸乳杆菌的分子标记及一种绝对定量黄酒发酵过程中细菌群落组成的方法，属于生物工程技术领域。能够有效解决黄酒由于其复杂的微生物群系，确定原始内标复杂而一直无法运用的技术问题，本发明提供了一种SEQ ID NO：3所示的分子标记作为鉴定和特异性定量耐酸乳杆菌的标志物的应用，以内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物可以在黄酒发酵系统中检测和定量内标。针对内标的分布范围进行统计，结果显示内标广泛分布在黄酒发酵系统中。通过对内标的绝对定量，能够对不同的菌群含量进行计算，具有操作方便、应用范围广的特点。

摘要： 本发明涉及宏基因组测序技术领域，具体公开一种宏基因组血液样本绝对定量的产品、方法及其应用，本发明方法通过选择自研标签序列，通过拟合曲线实现血液样本中病原菌的拷贝数定量。

摘要： 本发明公开了一种绝对定量细胞内DNA双链断裂数量的方法及应用。该方法将带有末端修饰的外源核苷酸片段插入至固定细胞基因组DNA双链断裂处，然后将基因组片段化并连接衔接接头，针对外源核苷酸片段和衔接接头设计特异性PCR引物和特异性荧光探针，结合细胞内参基因，构建数字液滴PCR体系，定量细胞内DNA双链断裂数量。本发明使得检测DNA双链断裂摆脱了序列依赖性，广泛适用于绝对精准定量动植物内因疾病、辐射、药物或者基因编辑等各种原因造成的DNA双链断裂数量，可用作检测射线损伤、化学药物损伤、基因编辑脱靶效率等问题的有效工具，在分子生物学和临床诊断中具有非常广阔的应用前景。

摘要： 本发明涉及微生物学技术领域，尤其涉及应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进行检测和绝对定量的方法。所述方法包括检测经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本中VC1376、thyA或recA中一种或多种基因的拷贝数，根据检测结果判断所述霍乱弧菌VBNC状态细胞的量。本发明针对霍乱弧菌VC1376、thyA或recA三个基因进行检测，结合数字PCR可以有效反映出霍乱弧菌VBNC状态细胞的数量，具备较高的检测率和稳定性，同时检测限较低，这在VBNC状态细胞检测领域具有重要意义。

摘要： 本发明公开了一种基于绝对定量鉴定酿酒酵母中L/M核酸片段的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种鉴定酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA的SYBR Green I荧光定量方法，此方法为先将一定浓度梯度的重组质粒进行SYBR Green I荧光定量，建立质粒浓度与CT值的标准曲线，再提取样本微生物RNA逆转录为cDNA进行SYBR Green I荧光定量，以标准曲线公式为依据，直接计算得到酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA片段的浓度，以达到快速绝对定量的目的。本发明旨在快速、准确检测发酵微生物中酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA的含量，进而为揭示其在白酒发酵过程中的影响、作用和演替规律，同时为提高白酒的品质奠定基础，具有较高的实际应用价值。

摘要： 本发明公开了一种大体积液体样品中病原微生物的快速绝对定量方法，属于微生物检测技术领域。所述方法包括：(1)利用纳米孔径膜过滤待测液体样品，使目标微生物被截留在滤膜表面；(2)在截留了目标微生物的滤膜表面贴合上密封小室，加入环介导等温扩增反应体系，密封；反应体系中含有水凝胶单体，交联成胶使得反应体系呈胶态覆盖滤膜表面的目标微生物；(3)环介导等温核酸扩增反应；(4)利用荧光成像技术分析计数荧光点，计算目标微生物的绝对浓度。本发明利用径迹蚀刻膜截留和水凝胶反应体系对目标微生物双重纳米限域，使得细菌、病毒在初始位置扩增且其扩增产物不会扩散，形成形状鲜明的扩增荧光点，实现微生物的定量定位检测。

摘要： 本发明公开了一种液滴类型数字化PCR系统及使用其实现绝对定量化的分析方法，系统基于分割思维的数字化PCR方法，将液滴生成步骤、扩增步骤与平铺检测步骤设置为非连续化步骤，再将不同类型容器设置为具有强度特征的宽条结构，使得平铺步骤中和其他步骤中系统可以使用相同的转移机构，如此在对于系统的自动化操作上能够最大限度地简便，进一步利用移液器产生液滴生成部的驱动力，可以在系统设计中最大化地利用不同结构模块的功能，从而保证设计出的液滴类型数字PCR系统具有成本较低、较容易实现且具有更高自动化程度的一体机结构。