植物表达载体

摘要： 番茄是广泛种植的果蔬类作物,病害发生是导致番茄产量和品质降低的重要原因,AtIWS1 (Arabidopsis thaliana interact with SPT6)基因可以提高拟南芥抗病性.文章通过病原菌接种克隆番茄SlIWS1基因,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和Western Blot检测.实验结果表明,番茄SlIWS1基因在病原丁香假单胞菌接种时表达水平升高,参与番茄抗病防御应答.利用SlIWS1基因所构建的植物表达载体,在烟草中获得预期大小SlIWS1蛋白表达产物,可用于后续番茄SlIWS1蛋白质相互作用和基因功能分析.

摘要： 运用植物基因工程手段构建琉璃苣BoD6D转化载体,为提高油料作物油份中γ-亚麻酸含量奠定基础.以琉璃苣基因组DNA为模板克隆BoD6D,构建酵母表达载体并转化酿酒酵母,对酵母进行诱导表达,提取脂肪酸后进行甲酯化反应,利用气相色谱分析脂肪酸含量;同时构建植物双元表达载体,经农杆菌介导通过蘸花法转化拟南芥,最后对转基因拟南芥通过抗性筛选及PCR进行鉴定.结果 表明,BoD6D编码区不舍有内含子,可以直接用于后续的功能研究;成功构建了酿酒酵母表达载体pYES2-BoD6D,气相色谱检测结果表明BoD6D在酵母中能够成功的将亚油酸催化生成γ-亚麻酸;成功构建了植物双元表达载体pBI121-BoD6D,卡那霉素抗性筛选和PCR鉴定结果表明已经成功获得BoD6D的拟南芥转化植株.通过以琉璃苣基因组DNA为模板比较方便的获得有功能的BoD6D用于转基因植物研究.

摘要： 以绒毛白蜡幼苗为试材,Illumina HiSeq 2000高通量测序技术获得的绒毛白蜡转录组Unigene数据为基础,采用RT-PCR方法克隆绒毛白蜡A20/AN1型锌指蛋白基因FvSAP1编码区序列,并通过双酶切等技术构建pCAMBIA2300-FvSAP1植物表达载体.结果表明,从绒毛白蜡中成功克隆出1个A20/AN1型锌指蛋白基因FvSAP1的编码区序列,且成功构建了pCAMBIA2300-FvSAP1植物表达载体.基因编码区长度为846bp,可编码281个氨基酸,分子量为31.0kDa,等电点为8.34,原子总数为4269个,分子式为C1332H2106N400O407S24.蛋白质序列分析表明,FvSAP1具有两个AN1锌指结构,其序列模式为C-X4-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C.Blast分析表明 FvSAP1 与芝麻(Sesamum indicum,XP_011075237.1)SiSAP16序列的相似性最高,序列一致性为78％.将FvSAP1与同类型的锌指蛋白进行多重序列比较,结果显示该类蛋白序列在不同物种之间具有较高的保守性.

摘要： [目的]克隆白屈菜Cm TLP基因并进行植物表达载体构建,为进一步研究CmTLP基因的功能及探索耐寒抗寒药用植物分子育种奠定基础.[方法]基于白屈菜转录组数据,分析得到白屈菜TLP基因开放阅读框,以18S RNA为内参基因,采用qRT-PCR法检测CmTLP基因在不同温度(20(CK),10,0,-7,-20°C)下白屈菜植株中的相对表达量.用RT-PCR法克隆该基因并构建植物表达载体,电击法转化根癌农杆菌.[结果]qRT-PCR结果表明,CmTLP基因在-7°C、12 h时,相对表达量最高;-7°C、24 h时,相对表达量最低.克隆白屈菜TLP基因,命名为CmTLP.该基因开放阅读框长度为696 bp,编码由231个氨基酸组成的肽链;分子质量为24.66 ku,为酸性蛋白.系统发育树表明,CmTLP基因与博落回、月季、胡桃的氨基酸序列有较高的同源性.构建了植物表达载体pRI201-AN-CmTLP,并成功转化根癌农杆菌.[结论]克隆了白屈菜CmTLP基因,构建植物表达载体pRI201-AN-CmTLP,并成功转化根癌农杆菌.

摘要： 甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT)基因编码参与植物油脂生物合成的酶.为了提高油菜籽含油量,促进油菜增产增油,改善菜籽油脂肪酸组分,克隆甘蓝型油菜Napin启动子与三酰甘油合成相关基因BnGPAT9,构建pBI121-Napin-BnGPAT9植物过表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,采用气相色谱法分析种子中脂肪酸组分,通过索式抽提法测定种子中油脂含量,研究在种子中过表达BnGPAT9基因对种子油脂合成的影响.Napin启动子在线分析表明,克隆到的启动子具有大量TATA-box、CAAT-box以及ABRE、GCN4等特征元件,完全具备种子特异性表达功能;种子中脂肪酸组分分析显示,拟南芥种子中油酸(C18:1)含量提高0.70～1.01百分点,亚油酸(C18:2)和芥酸(C22:1)含量降低;拟南芥种子含油量测定结果显示,种子中含油量显著增加1.91～2.56百分点.综上,甘蓝型油菜BnGPAT9基因对植物油脂合成具有重要作用,利用Napin启动子在拟南芥种子中过表达BnGPAT9基因可提高种子含油量并改善脂肪酸组成成分,为BnGPAT9基因应用于油菜油脂改良方面打下一定基础.

摘要： 植物细胞高度分隔成不同的膜亚细胞结构,在不同的地点适当地装配相关的蛋白来执行特定的细胞反应.细胞核是细胞的控制中心,以高度协调的方式进行蛋白质表达和运输.细胞核定位信号(nuclear localization signal,NLS)能够促进蛋白定位于细胞核中,对研究蛋白的细胞生物学功能有重要作用.基于目前NLS植物表达载体存在局限性,本研究用无缝克隆技术,将NLS与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein gene,GFP)融合,插入植物双元表达载体pRI101-AN中,获得一个新的pRI101-NLS-GFP植物表达载体.利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导瞬时表达体系在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中表达pRI101-NLS-GFP,以未融合NLS的pRI101-GFP为对照,荧光观察表明NLS-GFP融合蛋白主要聚集在细胞核,而pRI101-GFP荧光遍布整个细胞.同时利用马铃薯晚疫病致病疫霉菌(Phytophthora infestans)分泌的精氨酸-某氨基酸-亮氨酸-精氨酸(arginine-x-leucine-arginine,RXLR)效应蛋白PITG_04314(PITG:Phytophthora infestans T30-4 gene,GenBank No.XM_002905913)进一步研究该载体是否将融合蛋白成功导入细胞核中.前期研究证明PITG_04314定位于细胞核,伴有细胞质的背景,而细胞核是其毒性功能的主要场所.为进一步证实PITG_04314的细胞定位,通过无缝克隆技术将PITG_04314融合到pRI101-NLS-GFP和pRI101-GFP中.发现与前期研究结果一致,GFP-PITG_04314定位于细胞核,伴有细胞质的背景,而NLS-GFP-PITG_04314聚集于细胞核中.瞬时超量表达GFP-PITG_04314和NLS-GFP-PITG_04314都能促进晚疫病的侵染,表明细胞核是PITG_04314发挥毒性的场所.研究结果表明,基于无缝克隆技术的NLS-GFP融合基因植物表达载体系统可以使目标蛋白定位于细胞核中.该载体有望在病原菌蛋白细胞生物学功能研究中得到广泛应用.

摘要： 为构建从江香猪源干扰素γ(IFNγ)植物表达载体,通过农杆菌真空渗透法在新鲜生菜中实现瞬时表达.参考GenBank登录的猪IFNγ 基因序列设计1对特异性IFNγ 引物,采用RT-PCR方法从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ 基因序列,将其克隆至植物表达载体PBI121,转化根癌农杆菌LBA4404,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定;携带重组质粒根癌农杆菌真空渗透法感染生菜,GUS染色检测感染的生菜叶片,ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ 蛋白,分析重组质粒在生菜中表达效果;采用细胞病变抑制实验检测生菜中从江香猪源IFNγ 蛋白抗病毒活性.结果表明:本研究成功地从贵州从江香猪源肝脏组织扩增获得IFNγ 基因序列并构建了从江香猪源IFNγ 植物表达载体PBI121-IFNγ;GUS染色感染的生菜叶片可见蓝色物质;ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ 蛋白含量为169.397、170.657、170.37 pg/mL;生菜中表达从江香猪源IFNγ 经4-6稀释在Marc145细胞上仍能够抑制100 TCID50的PRRSV的致细胞病变作用.本实验成功构建从江香猪源IFNγ 植物表达载体PBI121-IFNγ,生菜中瞬时表达蛋白具有免疫反应性和抗病毒活性,为从江香猪源IFNγ 药用植物蛋白的研究开发提供参考依据.

摘要： 为探明基因BnaC03g45680D的生物学功能,以甘蓝型油菜(鼎油杂4号)为试验材料,采用RT-PCR技术并进一步利用农杆菌介导法转化植物进行研究.结果表明:甘蓝型油菜叶片RNA扩增出介于678 bp的基因片段,其与Genbank报道的甘蓝型油菜基因BnaC03g45680D预测序列的同源性为100％;构建了含有2×CaMV35S启动子的植物表达载体PCAMBIA1300S-BnaC03g45680D.

摘要： 将洋葱(Allium cepa)的蔗糖-果糖基转移酶基因SST与甜菜根部特异性启动子MLL重组,以pBI121为起始载体,构建pBI121-MLL -SST,通过农杆菌介导法转化甜菜(Beta vulgaris)品种 STFD4,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,简称PCR)鉴定转化植株,并用逆转录PCR(reverse transcription PCR,简称RT-PCR)技术检测SST基因的表达.利用干旱胁迫处理进行抗旱性分析,结果表明,与对照(CK)相比,转SST植株叶片萎蔫较迟且程度较轻,其叶片相对含水量和光系统Ⅱ相对量子产率的降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的提高幅度均低于对照甜菜植株.以上结果表明,SST基因可明显提高甜菜的抗旱性,为进一步研究该基因在甜菜中的功能奠定了基础.

摘要： 本研究构建了玉米UBI启动子驱动Bt CryIA(c)基因的高效植物表达载体pUBTC,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,获得89株抗性植株,经过PCR扩增检测,得到71株阳性植株,对其中7株进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功的整合到甘蔗基因组中,并得到有效的表达.

摘要： 抗坏血酸过氧化物酶(APX)是植物为防御氧化胁迫而建立的清除活性氧体系——抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环中的关键酶。有研究表明APX在高等植物中清除活性氧时对底物抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)有极高的专一性，且能够在较低水平的AsA下发挥作用。为了进一步研究枣树ZjAPX在植物体内的功能，构建了ZjAPX的植物表达载体，并将其导入拟南芥，进行了功能验证和分析。

摘要： 抗坏血酸过氧化物酶(APX)是植物为防御氧化胁迫而建立的清除活性氧的体系-抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环中的关键酶。有研究表明：APX在高等植物中清除活性氧时，对底物抗坏血酸(ASA)有极高的专一性，且能够在较低水平的ASA下发挥作用。为了进一步研究枣树ZiAPX在植物体内的功能，本文构建了ZiAPX的植物表达载体，并将其导入拟南芥，进行了功能验证和分析。

摘要： 根据GenBank登录的牡丹ACS基因DNA全长序列(FJ769773),设计一对特异性引物,在优化的PCR扩增体系的基础上,用高保真DNA聚合酶KOD-Plus从‘洛阳红’牡丹叶片总DNA中扩增出牡丹ACC合成酶基因片段PsACS-4,测序结果表明克隆序列长970 bp,不包含牡丹ACS基因内含子序列,与目标序列同源性达100％;用SacⅠ和smaⅠ对重组质粒和空载体pBI121双酶切、连接,将PsACS-4基因片段定向克隆到植物表达载体pBI121的35S启动子下游,成功构建了牡丹ACS反义基因植物表达载体.

摘要： 蔗糖磷酸合成酶（以下简称SPS）是植物体内控制蔗糖合成的关键酶。本研究通过搜索NCBI数据库获得迄今植物中所有的蔗糖磷酸合成酶基因序列共77条，其中全长序列43条；对全长序列进行进化分析表明，植物SPS基因分为A、B、C、D四个家族，同一植物体内有多个分别属于不同家族的SPS基因；比对A家族中进化关系很近的甘蔗SofSPSII、水稻OsSPS4、黑麦草LpSPS、竹子BoSPS基因序列，并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗A家族SPS基因（SofSPSA）2553bp序列，在此序列基础上，通过5’-RACE和3’-RACE方法获得甘蔗SofSPSA基因全长cDNA序列3906bp；该序列的ORF为3180bp，编码1060个氨基酸，起始密码子(ATG)位于转录起始位点后359bp处，终止密码子(TAA)后还有一段364bp的非编码序列，并带有真核生物典型的polyA尾巴(GenBank accession number:HM854011)；SofSPSA与SofSPSII、OsSPS4、LpSPS、BoSPS的氨基酸相似性分别为99.3%、91.8%、91.6%、91.9%，一致性分别为99.2%、87.9%、87.5%、87.8%；设计引物扩增SofSPSA基因ORF并连到pBI121上获得由组成型表达启动子35S驱动的植物表达载体pBI-SofSPSA，为进一步研究甘蔗SPS基因的表达调控及利用甘蔗SPS基因改良作物品种奠定了基础。

摘要： 为满足植物功能基因组学研究及转基因安全性需要,本研究根据一些国内外引进或商业化的植物表达载体及其相关元件,构建了3个适合于植物,尤其是单子叶植物转化的表达载体,即pAH006、pWMB022和pWMB025.pAH006载体包含由玉米泛素ubi启动子调控的GUS基因和bar基因的完整T-DNA区域,此区段能够被酶切回收,可用于单子叶植物农杆菌介导转化效率评价及基因枪介导线状DNA转化效果研究;pWMB022载体携带由双35S启动子调控的玉米色素基因Lc和C1,可用作基因枪介导的共转化筛选标记,直观筛选含目标基因转基因材料;pWMB025载体携带由ubi启动子调控的、商业化转基因植物中广泛利用的EPSPS基因,可用于禾谷类作物农杆菌或基因枪介导的遗传转化,载体多克隆位点可通过酶切方式更换目标基因.酶切鉴定结合农杆菌或基因枪介导的小麦幼胚愈伤组织或叶片转化验证此3个载体,表明,载体构建正确,其标记基因、可视化基因和报告基因均能正常表达.这3个载体的构建对于小麦等植物转化效率提升、安全型转基因作物获得和植物功能基因组学研究等具有重要意义.

摘要： 本研究构建了玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,共获得67株抗性植株,经PCR扩增检测,得到22株阳性植株,并对其进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中,且得到了有效的表达.

摘要： 以海岛棉Giza75第一链cDNA为模板，利用网上已公布的陆地棉GhHOX4序列设计适当引物，用PCR方法，首次在海岛棉中克隆出GbHOX4的基因全长cDNA序列，经胶回收、连接到T-efls—Y载体，获得重组质粒T—easy—GbHOX4，测序鉴定后，证明该基因cDNA包含一个2277 bp的完整的开放阅读框，编码758个氨基酸。用BamH I限制性内切酶酶切经改良的pBI121载体，构建了由35S驱动的绿色荧光蛋白(GFP)融合的植物表达载体pBI121-GbHOX4-GFP。

摘要： 利用PCR技术扩增大豆细菌性斑点病菌hrZPsg12基因,将hrpZPsg12基因同质粒pBI121进行连接,构建pBI121-hrpZPsg12植物表达载体.采用热激法将重组质粒pBI121-hrpZPsg12转入到大肠杆菌DH5α中,经酶切测序验证后,通过冻融法转入土壤农杆菌LBA4404中.由根癌农杆菌介导,采用叶盘转化法,以烟草叶片为外植体经过预培养、侵染、共培养及选择培养,获得了103株转基因抗卡那霉素烟草植株;提取转基因烟草叶片的DNA用于PCR检测,PCR检测结果显示103株转hrpZPsg12基因烟草中86株呈阳性.本研究为进一步研究hrpZPsg12基因功能及培育抗病烟草品种奠定了基础.

摘要： 多基因遗传转化是植物转基因研究与利用的重要发展方向,但如何将众多单基因重组成多基因的双元载体,迄今仍是一个难度较大的问题.本研究以豌豆凝集素基因PsLECTIN,早期结瘤素基因PsENOD12A、PsSYM10和PsSYM35等为对象,在农杆菌中利用同源重组方式将外源基因添加进T-DNA,实现了T-DNA延伸,得到19895 bp大小的双元载体.该方法为构建含有大规模基因和大分子量T-DNA的植物基因双元表达载体奠定了基础.

摘要： 本发明涉及生物工程领域，具体涉及在工程植物中表达多种蛋白的表达盒和表达载体及制备工程植物和生产可溶性糖的方法。本发明提供了一种用于在工程植物中表达多种蛋白的表达盒、一种表达载体、一种制备工程植物的方法以及一种使用如上所述的表达盒生产可溶性糖的方法和一种生产可溶性糖的方法。采用本发明的方法进行可溶性糖的生产，能够有效提高可溶糖的产量。

摘要： 本发明采用体外基因重组方法，将人酸性成纤维细胞生长因子(Human acidic fibroblast growth factors haFGF)与油体蛋白基因融合合成，构建成一种植物油体表达载体，建立一种油体蛋白遗传转化表达体系，用根瘤农杆菌转化了拟南芥、红花、大豆、黑豆、油菜，并获得了转基因植株，转基因红花、油菜的分子生物学检测证明外源基因的整合和表达，经活性检测，获得的重组蛋白具有生物活性，其生物活性与人aFGF标准品活性相当。本发明还提供一种方法在植物种子中表达酸性成纤维细胞生长因子，这种方法可以提供一种经济的方法生产酸性成纤维细胞生长因子，可开发出一种医类新药。

摘要： 本发明采用体外基因重组方法，将人表皮生长因子(humanEpidermal growth factor，hEGF)与油体蛋白基因融合，构建成一种植物油体表达载体，用根瘤农杆菌转化了拟南芥、红花、大豆、黑豆、油菜，建立了一种油体蛋白基因与目的基因融合表达的遗传转化体系，并获得了转基因植株，转基因红花、油菜的分子生物学检测证明外源基因的整合和表达，经活性检测，获得的重组蛋白具有生物活性，其生物活性与人hEGF标准品活性相当。本发明还提供一种在植物种子中表达人表皮生长因子的方法，这种方法可以提供一种经济的方法生产人表皮生长因子，可开发出一种新药。

摘要： 本发明涉及生物工程领域，具体涉及在工程植物中表达多种蛋白的表达盒和表达载体及制备工程植物和生产可溶性糖的方法。本发明提供了一种用于在工程植物中表达多种蛋白的表达盒、一种表达载体、一种制备工程植物的方法以及一种使用如上所述的表达盒生产可溶性糖的方法和一种生产可溶性糖的方法。采用本发明的方法进行可溶性糖的生产，能够有效提高可溶糖的产量。

摘要： 本发明采用体外基因重组方法，将人表皮生长因子(human Epidermal growth factor，hEGF)与油体蛋白基因融合，构建成一种植物油体表达载体，用根瘤农杆菌转化了拟南芥、红花、大豆、黑豆、油菜，建立了一种油体蛋白基因与目的基因融合表达的遗传转化体系，并获得了转基因植株，转基因红花、油菜的分子生物学检测证明外源基因的整合和表达，经活性检测，获得的重组蛋白具有生物活性，其生物活性与人hEGF标准品活性相当。本发明还提供一种在植物种子中表达人表皮生长因子的方法，这种方法可以提供一种经济的方法生产人表皮生长因子，可开发出一种新药。

摘要： 本发明采用体外基因重组方法，将人酸性成纤维细胞生长因子(Human acidic fibroblast growth factors haFGF)与油体蛋白基因融合合成，构建成一种植物油体表达载体，建立一种油体蛋白遗传转化表达体系，用根瘤农杆菌转化了拟南芥、红花、大豆、黑豆、油菜，并获得了转基因植株，转基因红花、油菜的分子生物学检测证明外源基因的整合和表达，经活性检测，获得的重组蛋白具有生物活性，其生物活性与人aFGF标准品活性相当。本发明还提供一种方法在植物种子中表达酸性成纤维细胞生长因子，这种方法可以提供一种经济的方法生产酸性成纤维细胞生长因子，可开发出一种医类新药。

摘要： 本发明公开了一种植物表达载体、蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用，用于构建dsRNA植物表达载体，dsRNA序列与番茄花叶病毒的起始组装序列相连，因此转录的RNA分子能够被ToMV的外壳蛋白（CP）所包装；所述的植物表达载体还包含了ToMV的CP基因的表达框架，其编码的CP能包装含OAS的RNA分子，dsRNA编码序列和CP基因序列均置于一个韧皮部优势表达的启动子之下，使dsRNA和CP蛋白能在转基因植物的筛管中积累。本发明载体中，dsRNA的转录是由韧皮部特异性启动子驱动的，使dsRNA主要在筛管中积累，其潜在的害虫防治对象为用刺吸式口器取食的蚜虫、粉虱、介壳虫等。

摘要： 本发明提出了一种植物表达载体pCAMBIA1304-hpa1xoo的构建方法，构建过程中，采用间接载体进行构建，具体为通过对pCAMBIA1304载体和pCAMBIA2301载体进行重组成pCAMBIA1304-2301中间载体，再将所述中间载体以及含有目标基因片段的载体进行酶切和重组，构建pCAMBIA1304-hpa1xoo表达载体，方法简便，便于推广与应用，得到的表达载体便于筛选与后期实验。

摘要： 本发明公开了一种植物表达载体、蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用，用于构建dsRNA植物表达载体，dsRNA序列与番茄花叶病毒的起始组装序列相连，因此转录的RNA分子能够被ToMV的外壳蛋白（CP）所包装；所述的植物表达载体还包含了ToMV的CP基因的表达框架，其编码的CP能包装含OAS的RNA分子，dsRNA编码序列和CP基因序列均置于一个韧皮部优势表达的启动子之下，使dsRNA和CP蛋白能在转基因植物的筛管中积累。本发明载体中，dsRNA的转录是由韧皮部特异性启动子驱动的，使dsRNA主要在筛管中积累，其潜在的害虫防治对象为用刺吸式口器取食的蚜虫、粉虱、介壳虫等。

摘要： 本发明涉及植物生产重组蛋白领域，特别涉及序列的应用、重组载体及其提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法。发现CP基因3`端至少50bP的序列对提高目的基因的表达有明显的作用，序列详见表1。在目的基因开放阅读框后保留CP基因3`端50bp的序列，能显著提高目的基因的表达。