感染性克隆

摘要： 为了获得背景明确清晰的禽白血病病毒K亚群(ALV-K)毒株,对地方性ALV-K毒株HB2018003采用酶切和同源重组两种方法进行感染性克隆构建及病毒拯救。使用PCR方法获得目的基因,经酶切、连接和同源重组后成功构建重组质粒Topo-003-ABC和Topo-003-K12,测序结果表明无任何突变,进而将重组质粒转染进鸡胚成纤维细胞(DF-1)中,经群特异性抗原P27 ELISA、PCR和间接免疫荧光(IFA)鉴定,结果均表明成功拯救出病毒,将其命名为R-rHB2018003(同源重组法)和E-rHB2018003(酶切法)。本研究为深入探讨ALV-K的致病机制奠定了基础。

摘要： 本试验旨在获得临床上逐渐增多的猪圆环病毒2d基因型毒株(PCV2d),并对其引入生物素标记。首先从陕西咸阳某临床发病猪场采集了2头发病仔猪和15头未发病仔猪的组织样本,对其进行猪圆环病毒2型(PCV2)检测,并对阳性样本进行测序及序列比对,将获得的PCV2d基因型毒株基因组orf 2中226~246 bp序列替换为生物素受体肽(BAP)编码序列并克隆入质粒载体,同时稳定构建表达原核生物素连接酶(BirA)的PK15细胞系,将替换有BAP的PCV2d基因组酶切并环化后转染稳定表达BirA的PK15细胞,连续盲传5代后鉴定获得的重组病毒。结果显示,检测的组织样本中共有5头仔猪的样本为PCV2阳性,其中1份样本为PCV2d基因型,4份样本为PCV2b基因型;在获得BAP序列替换的PCV2d,构建重组质粒T-PCV2d-BAP和稳定表达BirA的PK15细胞系后,将环化的PCV2d-BAP转染稳定表达BirA的PK15细胞并盲传5代,经PCR和Western blot检测均为PCV2阳性,且能被链酶亲和素识别。本试验成功获得的生物素标记重组PCV2d基因型毒株为后续探究PCV2d基因型毒株免疫逃避机制提供一个非常有效的工具。

摘要： 鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染鸡引起免疫抑制性疾病,严重危害养禽业。为了构建CIAV Cux-1株的感染性克隆,本试验通过PCR扩增CIAV全基因组序列,与pcDNA3.1载体同源重组,得到重组质粒pcDNA3.1-Cux-1。进一步通过对pcDNA3.1-Cux-1酶切、环化得到CIAV Cux-1环状DNA。将环状DNA电转染导入MSB1细胞并连续传代,用Western blot和间接免疫荧光进行重组病毒的鉴定。结果显示,本试验成功拯救出CIAV重组病毒rCux-1(recombinant Cux-1),重组病毒rCux-1携带有特定的遗传标记,并且与亲本株复制能力和蛋白表达水平基本一致。本试验成功构建的CIAV Cux-1株感染性克隆为进一步研究CIAV的致病机理和研制新型疫苗提供了试验基础。

摘要： 鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)是研究冠状病毒的模式病毒,但传统的病原学研究方法局限于自然界分离的病毒,不利于研究的开展。反向遗传操作系统可快速获得研究所需的重组病毒,为研究MHV及其他冠状病毒的基因组功能开辟了新途径。本研究通过反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)将MHV的原始毒株A59全长基因组分成6个片段进行扩增,分别克隆到质粒载体,经酶切、体外连接和转录获得全长基因组RNA,然后电转细胞并进行病毒扩增。结果显示,重组病毒rA59与原始毒株的复制特性相似,其为研究MHV的生物学特性提供了实验工具。为方便检测病毒的复制水平,在病毒基因组开放阅读框4(open reading frame 4,ORF4)内分别插入绿色荧光蛋白ZsGreen(Zoanthus sp.green fluorescent protein)和荧光素酶Nluc(NanoLuc luciferase)报告基因,获得rA59-ZsGreen和rA59-Nluc重组报告病毒。结果显示,报告病毒所携带的报告基因并不影响病毒复制,可很好地反映病毒的复制特性。使用这两种病毒验证瑞德西韦(remdesivir)的抗病毒活性,分别检测药物处理后病毒的荧光亮度和荧光素酶活性。结果表明,rA59-ZsGreen和rA59-Nluc重组报告病毒适用于高通量药物筛选,具有重要的应用前景。综上所述,本研究成功建立了MHV A59毒株六质粒反向遗传操作系统,为研究MHV的生物学特性和测试抗病毒药物等提供了有力的工具。

摘要： 【目的】为探明引起禽白血病病毒K亚型(ALV-K)两不同毒株之间致瘤性差异的原因,进一步探索ALV-K的致病机理,实现两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救。【方法】以前期构建的ALV-K毒株HB2018003和HB2015032的感染性克隆为模板,PCR扩增分别获取两毒株单独的5′-端长末端重复序列(5′-LTR)基因片段和剩余目的基因片段。切胶回收目的片段后将两毒株的5′-LTR互换,通过同源重组的方法获得连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布Amp抗性平板过夜培养,挑取PCR鉴定为阳性的菌落提取重组质粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并送检测序。将PCR和测序鉴定正确的重组质粒转染至易感细胞DF-1中盲传3代,使用群特异性抗原P27 ELISA、多重PCR和间接免疫荧光等方法对拯救的病毒进行检测。【结果】测序和重组感染性克隆PCR鉴定的结果表明成功构建了5′-LTR互换的重组质粒,多重PCR结果显示在目的片段大小处出现ALV-K预期条带,未出现ALV-A和ALV-J条带,间接免疫荧光试验结果显示接种拯救病毒的DF-1细胞出现明显的亮绿荧光,阴性对照则没有出现荧光。综合以上结果,说明两株重组病毒拯救成功,并将其分别命名为rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。【结论】本研究采用同源重组的方法构建了5′-LTR互换的感染性克隆TOPO-003-032和TOPO-032-003,并成功拯救出病毒rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。

摘要： 为了解目前广东地方品种鸡K亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV-K)的分子特征,于2020-2021年,从广东7家(A~G)正在进行外源性ALV净化的、外观健康的规模化种禽场核心群采集抗凝血样品共8042份。通过血浆接种DF-1细胞、ELISA检测p27抗原,共检出357份阳性,并对ELISA结果S/P值0.2~0.6的150份阳性样品进行PCR鉴定和env基因测序,共分离到32株ALV-K,进一步选取16株进行全基因组扩增及测序分析。结果显示,这16株ALV-K全长为7481~7496 bp,基因组符合5′-LTR-UTR-gag-pol-env-UTR-LTR-3′典型的反转录病毒结构,不含已知致癌基因;其gp85基因与ALV-K参考株位于同一进化分支上且相似性最高(>94.0%);其pol、gp37基因均比较保守,与ALV各亚群相似性均较高(>94.0%);其LTR与内源性ALV及大多数ALV-K参考株相似性最高(91.4%~99.5%),且LTR U3区与内源性ALV LTR有相同的转录调控元件;此外,观察到31.3%(5/16)的分离株在gag基因373-384位核苷酸存在12 bp的缺失,进一步以缺失株GD20 JM10为亲本,通过PCR分段扩增和同源重组的方法分别构建了缺失株(rGD20 JM10)和回补株(rGD20 JM10 A12)的cDNA克隆,将其转染DF-1细胞,ELISA和IFA结果表明,病毒拯救成功;体外复制动力学结果显示,两者差异不显著(P>0.05)。本研究所调查的广东7个种禽场的ALV-K流行株均携带内源性LTR,且分子特征较为稳定,故采用更敏感的检测技术在开展ALV净化时尤为重要,此外,gag基因373—384位核苷酸的规律性缺失对病毒的体外复制能力无显著影响。

摘要： 以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗所用毒株CDV-3为模板,构建犬瘟热病毒感染性cDNA克隆,为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究提供理论基础.设计13对引物对其全基因组序列测定,分析单一酶切位点,将CDV-3的全长分5个片段进行RT-PCR扩增.经酶切拼接,将5个片段顺次插入到酶切位点改造后的真核载体pcDNA3.2的多克隆酶切位点处,同时在Fl首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列,获得CDV-3株的全长cDNA质粒(pcDNA3.2-CDV-3).构建表达CDV-3 N、P、L蛋白的3个辅助质粒.利用转染试剂LipofectamineTM 2000将全长质粒和3个辅助质粒共转染293T细胞,3d后,将上清接种到Vero细胞.观察犬瘟热病毒典型合胞体病变,对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定.最后,比较wtCDV-3和rCDV-3的生长特性.全长质粒和辅助质粒的酶切鉴定和序列测序均正确.拯救的重组病毒能在Vero细胞上形成典型的合胞体病变,经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察鉴定,证明成功拯救出重组病毒rCDV-3株.rCDV-3的病毒滴度最高达到107.667 TCID50/mL,比wtCDV-3的滴度106.667 TCID50/mL高出约10倍.rCDV-3感染Vero细胞后,迅速大量增殖,于感染后36 h达到最高病毒滴度.而wtCDV-3增殖平缓,感染后72 h时病毒含量达到最大.文中建立的高效CDV-3株反向遗传操作平台,为犬瘟热病毒新型疫苗研制和致病机理研究奠定基础.

摘要： 诺如病毒是导致人类急性胃肠炎的主要食源性致病原,由于变异快且缺乏稳健的体外细胞培养体系及小动物感染模型,限制了我们对该病原体的深入研究.近年来,可培养鼠源诺如病毒的发现、人源诺如病毒肠道细胞培养体系的开发,以及诺如病毒反向遗传操作体系的构建为系统研究该病原提供了有力工具,加深了我们对其复制机制、致病机理、病毒-宿主相互作用等的了解.本文主要综述了反向遗传学技术用于诺如病毒研究的工作进展,并讨论了该技术在诺如病毒分子病毒学研究、药物筛选和疫苗制备中的应用及发展前景,以期为诺如病毒防控策略的制定及药物靶点的挖掘提供有益参考,推进我国食品安全风险防控工作.

摘要： 以pEGFP-N1和pAdTrack-CMV质粒为模板,通过PCR扩增分别获得GFP基因序列和Kan基因序列;以胶回收的目的序列为模板,通过Overlap PCR扩增获得GFP-Kan基因序列.回收GFP-Kan基因序列,插入至pCI-neo载体上,酶切和测序鉴定正确的重组载体命名为pCI-GFP/Kan.再将设计合成的linker基因序列通过酶切、连接克隆至pCI-GFP/Kan载体上,涂布Kan抗性平板进行阳性克隆筛选,酶切和测序鉴定正确的重组载体命名为pCI-infect,即为新城疫病毒全长cDNA双启动子克隆载体.酶切和测序鉴定结果显示,pCI-infect载体构建成功.

摘要： 细小病毒感染的动物宿主广泛,包括猫科、犬科、猪科、牛科、鸭科和鼬科等动物,是动物的一种重要病原.病毒反向遗传学技术是在获得病毒全基因组序列的基础上,构建感染性克隆,通过DNA重组、定点突变、插入、缺失等遗传修饰手段创造突变体,并研究突变体所造成的表型效应,从而研究基因的生物学功能.论文对ssDNA细小病毒反向遗传学技术的研究进行综述,为细小病毒同科病毒反向遗传学操作平台的建立提供参考.

摘要： 新型鸭呼肠孤病毒是一种引起鸭传染病的重要致病因子,为10节段的现链RNA病毒,目前缺乏反向遗传操作平台以研究其发病机理、宿主谱改变等.本文建立10质粒全长系统,其中引入M2节段1189-1194位引入酶切位点HindⅢ(AAGCTG→AAGCTT),在脂质体介导下,与能表达T7RNA聚合酶的痘病毒共转染细胞,收集转染细胞液,在鸡胚上连续传代,获得拯救病毒.结果显示:拯救病毒经测序及分子标记验证,表明获得稳定的拯救病毒;通过细胞病变观察及蚀斑实验证实,拯救病毒能引起与亲本病毒一致的细胞病变和蚀斑形态;Western Blotting和间接免疫荧光实验表明,拯救病毒成功.体外实验研究证实成功构建并获得NDRV的感染性克隆,为从基因水平深入研究该病毒的致病机制及疫苗开发等提供了反向遗传操作平台.

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种危害全球养猪业的重要病原.近年来,PRRSV NADC30-1ike在我国出现并快速传播,造成猪场PRRS疫情暴发.同时,该毒株在流行过程中快速演化与变异,并且与我国高致病性毒株等发生重组出现新的毒株.本研究以NADC30-1ike毒株CHsx1401为对象,利用反向遗传操作技术成功构建出该毒株的感染性克隆.基于CHsx1401的全基因组序列，分四段设计引物，采用RT-PCR扩增基因组全长，其扩增cDNA片段长度分别为3156 bp、4164 bp、4283 bp和3439bp，将其分别克隆到pjETl.2载体。对4个片段的克隆分别进行测序鉴定，并与原始毒株序列进行比对，发现其中存在4个碱基的突变，用定向点突变方法对其进行回复突变，经序列测定证实后将4个克隆依次连接并克隆到改造的低拷贝质粒载体pWSK29（在原有载体的基础上在5’端引入CMV启动子，在3’端引入丁型肝炎病毒核酶），获得该毒株全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401。在全长cDNA克隆的C与D片段之间通过同义突变(T11582G)引入ASC I酶切位点，作为遗传标记用于与亲本毒区分，并在序列的3’端引入了poly (A) 38序列。利用脂质体LTX将构建的全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401转染MARC-145细胞，96h后收获细胞培养液进行传代，观察细胞病变。结果表明，第2代即可观察到典型的PRRSV细胞病变。经间接免疫荧光和RT-PCR以及测序鉴定表明，构建的全长cDNA克隆具有感染性，并可成功拯救出病毒（命名为RvCHsx1401）。拯救病毒在MARC-145细胞和原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）上的增殖动态与亲本病毒相似，但在各时相的病毒滴度略低于亲本病毒。综上所述，NADC30-like毒株CHsx1401的感染性克隆的成功构建为进一步研究其变异与致病的分子机制奠定了必要的技术平台。

摘要： 丙型肝炎病毒感染是慢性肝病及肝细胞癌的主要致病因素之一.JFH-1是第一个被报道能在细胞水平上产生感染性颗粒的cDNA克隆,它的成功构建极大促进了丙肝领域的基础研究.此后,其它基于JFH-1的基因型内或型间的重组克隆多为共有序列克隆.为了探索能否从临床分离株出发直接构建感染性克隆,设计了一个功能性克隆筛选策略:以JFH-1的cDNA作为起始的分子骨架,从一株基因型2a的临床分离株PR63的准种序列中筛选有功能的Core-NS3、NS3-NS5A及NS5B片段,然后把这些片段组合起来,通过进一步的优化及细胞内适应,得到了全长的PR63感染性克隆PR63cc.PR63cc是第一例源自中国丙肝患者血清的感染性克隆,它可以在Huh7来源的肝癌细胞系中高效扩增,最高感染性滴度达到1.6×105ffu/mL,也可以被HCV-E2抗体中和.和JFH-1相比，PR63cc对IFN-β和NS5B的抑制剂2-CMA的敏感性相似，但PR63cc对NS5A的抑制剂Daclatasvir高度耐受。反向遗传学分析表明NSSA第31位的甲硫氨酸残基是PR63c。对Daclatasvir不敏感的原因，这说明构建更多的感染性克隆对HCV抑制剂开发的重要性。综上所述，开发了一种从临床分离株出发直接构建感染性克隆的方法，将得到的PR63cc，从感染性、被E2抗体中和的能力及对一些HCV抑制剂的耐受性方面都和JFH-1做了一一对比。这种构建HCV全长感染性克隆的方法，不仅能应用于其他临床分离株，还可能为今后丙型肝炎患者的个性化治疗带来便利。

摘要： 以鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)FJ/2011分离株基因组为模板,构建带遗传标记的双拷贝串联基因组感染性克隆(pEGFP-2DuCV).应用分子生物学技术,以GenBank数据库中本实验室测得的DuCV全基因组序列(登录号KF726087)为模板,以DuCV ORF1中的EcoRI酶切位点(GAATTC代替GAGTTC)为上下游引物5'端,经PCR反应得到DuCV全基因组,克隆构建于pMD 18-T载体中得到pMD-DuCV.以pMD-DuCV为模板,分别设计两对引物(引物位置不变,引物一的上下游分别含有XhoI和EcoRI位点,引物二的上下游分别含EcoRI和HindⅢ位点),分别经PCR反应得到两个DuCV全基因组,PCR产物分别用自带酶切、pEGFP-C1载体由XhoI和HindⅢ酶切后,三片段回收连接后得到双拷贝DuCV串联基因组感染性克隆pEGFP-2DuCV.经鸡胚成纤维细胞系(DF-1)与鸡马立克病毒肿瘤淋巴细胞系(MDCC-MSB1)体外转染试验验证,转染后12h均可观察到EGFP发出较强的绿色荧光.体外转染后验证病毒蛋白的表达、病毒传代以及超微形态学观察等是下一步进行病毒拯救研究重点.

摘要： 在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)SD16感染性克隆的基础上,在SD16基因组N基因和3'UTR之间插入PRRSV ORF6的转录调控序列(TRS6)和猪源GM-CSF或者IL-4,以及用甘氨酸和FMDV 2ALinker串联的猪源GM-CSF和IL-4,通过转染Marc-145细胞进行病毒拯救,将拯救的重组病毒在Marc-145细胞上连续代分析其生物学特性和遗传稳定性.结果显示,将不同重组全长质粒分别转染Marc-145细胞后可以观察到典型的细胞病变,IFA和western blot检测结果显示,引入的猪源GM-CSF和IL-4成功得到了表达,且拯救的重组病毒可以被PRRSV N蛋白特异性单抗识别,初步表明4株重组病毒被成功拯救,且重组病毒与亲本毒株具有基本一致复制动力学曲线,外源猪GM-CSF以及IL-4的插入并未影响病毒复制.遗传稳定性分析结果证明,重组病毒传代至第6代时,仍旧可以检测到猪源GM-CSF以及IL-4的表达.

摘要： 目的：构建EV71 C4亚型SHZH98株全长cDNA感染性克隆,并利用感染性克隆拯救得到的SHZH98株病毒对微生物发酵液进行抗EV71病毒活性的筛选,以期发现具有治疗EV71感染潜力的微生物天然产物.方法：应用反向遗传学技术,以Trizol提取的病毒基因组RNA为模板,在逆转录酶M-MLV的作用下合成病毒基因组的cDNA。然后以病毒基因组cDNA为模板,在DNA聚合酶的作用下分段扩增病毒的基因组序列,并通过引物引入5’端的T7启动子序列和3’端的PolyA尾序列.扩增得到的基因组片段顺次连入pBR322载体中，构建EV71SHZH98株的全长cDNA感染性克隆。将感染性克隆体外转录得到的病毒基因组RNA转染到Vero细胞中，即可拯救出EV71的病毒颗粒。通过Western blot分析、RT PCR鉴定、间接免疫荧光试验及电镜观察对拯救病毒的感染性和生物学特性进行检测。接种Vero细胞至96孔板，以药物对细胞CPE的抑制程度作为衡量抗病毒效果的指标，用SHZH98株拯救病毒对微生物发酵液进行抗EV71病毒活性的筛选。结果：测序结果表明SHZH98株全长cDNA克隆中含有完整的病毒基因组序列，全长7404nt。基因组的5’末端为含有741个碱基的非编码区(5'-UTR)，3’末端为含有81个碱基的非编码区(3'-UTR)。两者之间有一个完整的开放阅读框(ORF)，编码一条长为2193个氨基酸的多聚蛋白。转染病毒基因组RNA的细胞中和感染拯救病毒的细胞中均可检测到病毒基因组的复制和病毒特异性蛋白的表达，宿主细胞可出现剧烈而典型的CPE，说明感染性克隆体外转录的RNA和RNA拯救病毒均具有感染性。结论:本研究成功构建得到EV71 C4亚型SHZH98株的全长cDNA感染性克隆，为研究中国乃至亚太地区的EV71流行株的致病机理和EV71病毒疫苗的研发奠定了基础。利用拯救病毒筛选得到的具有抗病毒活性的微生物天然产物为抗EV71感染药物的开发提供了有益的参考。

摘要： BYD病毒为我国新发生的一种能引蛋鸭、鹅等产蛋下降和脑炎为主要特征的急性、高度传染性疾病，目前已广泛分布于我国主要水禽养殖地区。该病毒属黄病毒科黄病毒属的Ntaya病毒群。本研究利用RT-PCR分7段扩增出BYD-JXSP株的全基因组cDNA，克隆至低拷贝质粒pWSK29，构建出全长质粒pWSK29-BYDV-AN，经体外转录和转染BHK-21细胞拯救病毒。结果表明，构建的全长cDNA克隆具有感染性，在BHK-21细胞上可拯救出病毒。拯救病毒(命名为BYDV-AN)在BHK-21细胞上的生长特性与其亲代病毒BYDV-JXSP株一致，并保持了对小鼠的致病性。BYDV病毒的感染性克隆的成功构建为深入开展该病毒的分子致病机制研究奠定了良好的基础。

摘要： 将本实验室保存的一株La Sota病毒用有限稀释法接种鸡胚进行纯化,连续传代五次后筛选到一株高血凝效价的纯培养克隆株,命名为La Sota C5,并对其进行全基因组测序;参照La Sota C5株全基因序列单酶切位点,用RTPCR的方法将基因组分8段扩增,并按照病毒基因组的结构顺序,将克隆片段定向插入到TVT转录载体中,至此含有病毒全长cDNA的转录载体TVT-La Sota C5成功构建。将TVT-La Sota C5与构建的辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCIL按照5:3:2:1的比例共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了具有感染性的La Sota1株新城疫病毒。病毒的成功拯救为后续基因功能和疫苗载体开发等方面的研究提供了平台。

摘要： 本文以一株猪源GI JEV HEN0701株及其传代致弱珠10S3为基础，建立JEV的反向遗传系统，为深入研究GI JEV的遗传特征和毒力变异奠定基础。结果表明，本文成功建立了强毒株HEN0701及其弱毒株10S3的感染性克隆，并在弱毒株克隆中引入了SacI位点标记，拯救病毒具有与亲本毒株相同的体外生长特性和对小鼠的致病特性。以感染性克隆为基础，对强毒株核糖体移码信号序列进行突变，成功消除了病毒基因组翻译时的核糖体移码而不产生NS1’蛋白。

摘要： 为了解鸭坦布苏病毒安徽分离株AH-F10的分子特征及构建该病毒的感染性克隆,本文利用RT-PCR方法对其全基因组序列进行了测定,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与参考毒株进行序列比对及系统进化分析。结果表明,AH-F10株的全基因组序列长10,990nt,含有一个大的阅读框架,两侧各有一个非编码区(Untranslation region,UTR).序列比对结果表明,AH-F10株与13株参考毒株的基因编码区具有较高的氨基酸序列同源性。其中,与JS2010株的同源性最高,达98％,提示安徽和江苏省流行的鸭坦布苏病毒可能来自同一祖先。相比之下,鸭坦布苏病毒的5'UTR的序列表现一定程度的变异,AH-F10株与参考株的核苷酸序列同源性在94％-97％之间。本文研究结果为了解鸭坦布苏病毒的遗传变异及构建该病毒的反向遗传学操作系统奠定了基础。

摘要： 本发明提供了猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法及其应用，本发明属于生物技术领域。该构建方法包括：以猪流行性腹泻病毒的基因组RNA反转录产物为模板，扩增F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7片段；基于酵母内同源重组机制，将线性化的pYES1L载体和F1～F7片段混合、转化如酵母感受态细胞，从而实现病毒cDNA片段与原载体的一步无缝连接得到猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆质粒；基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，将病毒ORF3编码区替换成绿色荧光蛋白基因，构建表达绿色荧光蛋白的重组猪流行性腹泻病毒。本发明所述方法快速简便、成功率高，可用于拯救猪流行性腹泻病毒及其它冠状病毒，为研究该病毒的复制机制、致病机理以及开发新型疫苗提供可靠的技术平台。

摘要： 本发明公开了一种携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆及制备方法和应用。一种携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.1所示。该感染性克隆成功制备出携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒。本发明成功获得的稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒，在神经元标记、脑结构分析、核磁共振成像、水疱性口炎病毒神经毒性分析等方面具有广泛的应用价值。

摘要： 本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，将猪流行性腹泻G2株在Vero‑CCL81细胞上传至P3代，随后对该分离株进行了鉴定，包括RT‑PCR检测、病毒含量检测、特异性试验。将分离G2型PEDV株进行基因组序列分析，找出G2型PEDV毒株S基因编码氨基酸序列中特有的氨基酸突变区域，利用成熟的基因克隆和载体构建技术，将PEDV感染性克隆受体结合域替换成AscI酶切位点，按照提取的pBAC‑PEDV(mut)质粒及pBAC‑PEDV阳性对照质粒转染Vero‑CCL81细胞进行病毒拯救，为该疫苗进入靶动物试验和临床试验阶段奠定了坚实的基础。

摘要： 本发明公开了一种减毒型水泡性口炎病毒突变体全长感染性克隆及其应用，该全长感染性克隆成功制备出携带绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒突变体，具有可复制增殖、细胞毒性小和在大脑中不跨突触传播特点，可作为转移载体转导目的基因在细胞水平上表达，也可用于研究脑神经环路。

摘要： 本发明公开了一种携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆及制备方法和应用。一种携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.1所示。该感染性克隆成功制备出携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒。本发明成功获得的稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒，在神经元标记、脑结构分析、核磁共振成像、水疱性口炎病毒神经毒性分析等方面具有广泛的应用价值。

摘要： 本发明属于生物技术领域，涉及猪源副流感病毒5型(PIV5)全长感染性克隆及其制备方法和应用，本发明利用一株分离自中国湖北腹泻猪的PIV5毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆pPIV5‑HuB/YC，并能成功拯救出病毒，这是国内首次构建猪源PIV5全长感染性克隆。同时，将EGFP基因插入PIV5感染性克隆病毒基因组中，成功拯救出能表达该绿色荧光蛋白的重组PIV5病毒。在此基础之上，将猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的S基因替换EGFP基因，并成功拯救出能表达PDCoV S的重组PIV5病毒。本发明为深入开展PIV5的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。

摘要： 本发明公开了一种犬细小病毒弱毒株感染性克隆及其应用。本发明将一株CPV‑2c流行毒株的基因组DNA克隆到线性化的低拷贝质粒pKQLL中，构建了犬细小病毒全长基因组感染性克隆质粒pX‑CPV；以pX‑CPV为操作平台构建了多株在病毒的NS1蛋白磷酸化位点发生突变的毒株；通过生物学特性的分析和比较，鉴定出低细胞毒性的毒株，结果表明突变毒株，例如CPV‑2T598A/T601A可作为弱毒疫苗的候选毒株，具有良好的应用前景。

摘要： 本发明涉及一种携带HA标签的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的制备方法及其应用，属于分子生物学领域。为了克服黄病毒NS2A研究过程中缺乏针对NS2A的特异性抗体的技术不足，本发明提供一种携带HA标签的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的制备方法，并公开了其应用。本发明通过在NS1与NS2A之间插入HA标签，通过HA标签来指示NS2A，同时为避免影响NS2A荧光信号的观察，对NS2A第30个氨基酸进行点突变，以干扰NS2A的茎环结构，消除病毒复制过程的‑1核糖体移码。本发明所述的携带HA标签的乙型脑炎病毒全长感染性克隆对于黄病毒的研究具有重要的价值。

摘要： 本发明公开了一种基因I型与基因III型日本脑炎病毒感染性克隆及其构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过设计四对保守引物，分四段一次扩增出涵盖基因I型与基因III型JEV基因组全长的片段，基于DNA片段末端的同源性，利用酵母菌中的转化偶联重组技术，将分段的病毒基因组片段与线性化载体进行同源重组，一次性分别构建出携带基因I型与基因III型JEV基因组全长的重组质粒。重组质粒线性化处理后，利用T7启动子经体外转录出病毒RNA，RNA转染BHK‑21细胞后即可获得感染性克隆病毒。本发明可在酵母菌中稳定传代10代以上，不存在基因组本身序列的突变、缺失或外源序列的插入。

摘要： 本发明提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法及应用，属于病毒技术领域。本发明通过分段扩增的方法将新型鹅细小病毒SD株的完整基因组克隆至质粒pBluescript II SK，获得重组质粒；同时利用重叠PCR技术将基因组中NcoⅠ位点突变，作为鉴定野毒与拯救病毒的遗传标记；然后将重组质粒与转染试剂混合，通过卵黄囊与尿囊腔途径接种SPF鸭胚，获得拯救病毒。本发明建立的新型鹅细小病毒反向遗传操作系统，可用于新型鹅细小病毒毒力分析、跨种传播机制等方向的研究，同时也为研究鸭短喙与侏儒综合征的新型疫苗奠定了基础。