一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法

摘要

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，将猪流行性腹泻G2株在Vero‑CCL81细胞上传至P3代，随后对该分离株进行了鉴定，包括RT‑PCR检测、病毒含量检测、特异性试验。将分离G2型PEDV株进行基因组序列分析，找出G2型PEDV毒株S基因编码氨基酸序列中特有的氨基酸突变区域，利用成熟的基因克隆和载体构建技术，将PEDV感染性克隆受体结合域替换成AscI酶切位点，按照提取的pBAC‑PEDV(mut)质粒及pBAC‑PEDV阳性对照质粒转染Vero‑CCL81细胞进行病毒拯救，为该疫苗进入靶动物试验和临床试验阶段奠定了坚实的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是一种危害极大的接触性肠道传染病，此疫病的快速传播，给养猪行业带来前所未有的挑战。该疫病由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪的高致死率为重要特征，不同年龄和不同品种的猪群都有易感性，但对于哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的危害要更大，尤其是以哺乳仔猪受害状况最为严重，发病率高达100％，死亡率为30％～80％。除此之外，其他日龄的猪只，虽然易感，但是会随着猪只日龄的增长，死亡率呈下降趋势。

猪流行性腹泻的预防大致可以从以下四个方面开展：1、被动免疫途径：母猪经免疫PED疫苗后获得的母源抗体，可以从仔猪口腔感染途径给与预防，抗体一般可以持续不超过2周。2、主动免疫途径：主要是通过疫苗接种方式进行免疫。灭活疫苗和弱毒疫苗是主要的PEDV疫苗形式。但是现有临床数据显示，原有的旧毒株G1群(PEDV CV777株)所生产的疫苗已经不能给近年来市场上出现的猪流行腹泻新的变异株(变异毒株(G2群))提供足够的保护。3、有研究发现混合单克隆抗体和卵黄抗体具有微弱的保护作用，干扰素用于猪只上可以一定程度减少体重损失，但该病没有特异性疗法。通过母猪注射疫苗，利用母源抗体可以来保护仔猪，是较好的一种保护方式。4、养殖环境控制：良好的养殖环境越来越受到养殖户的认可，可以通过严格的消毒程序和全进全出等养殖措施提高PEDV的预防效果。但是现在由于国内复杂的养殖环境，严格措施还不能得到有效的实施。

现在，猪流行性腹泻疫苗在临床中得以应用，包括灭活疫苗和弱毒苗。由于猪流行性腹泻病毒在细胞中不易增殖，导致疫苗的生产效果一直不理想。灭活疫苗只能够产生抗体，防治病毒，却不能去除和消灭病毒；活疫苗由于使用传统的毒株疫苗(PEDV CV777株)已经不能有效的满足客户的需要，客户迫切的需要一种安全、对当前流行性毒株能有效防治的猪流行性腹泻疫苗。另一方面，理想的猪流行性腹泻疫苗应该兼具高安全性与高免疫效力，中国养猪面积幅员辽阔，在不同地区PEDV的流行毒株不完全一致，尤其现在对PEDV毒力起着决定作用的S基因上，发生了很多突变。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法。

本发明以实验室前期构建的PEDV感染性克隆为基础，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将原始pBAC-PEDV质粒的RBD替换成RBD高频位点改造的突变体，构建流行毒株高保护PEDV疫苗，免疫小鼠后检测改造病毒诱导中和抗体的水平。

本发明的目的采用以下技术方案来实现：

第一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，选择G2型PEDV毒株(GenBank登录号：KU558701)作为研究对象；

步骤2，分析G2型PEDV毒株的基因组序列特征，找出G2型PEDV毒株S基因编码氨基酸序列中特有的氨基酸突变区域；

步骤3，利用基因的克隆和载体构建技术，将PEDV感染性克隆受体结合域(Receptor Binding Domain，RBD)替换成AscI酶切位点；

步骤4，使用人工细菌染色体技术(BAC)，获取pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质；

步骤5，将提取得到质粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)用AscI酶切线性化；

步骤6，线性化产物使用乙醇沉淀回收，回收产物与RBD突变体连接得到RBD突变质粒pBAC-PEDV(mut)，完成猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建。

优选地，步骤1中，将分离出的猪流行性腹泻G2株在Vero-CCL81细胞上传至P3代。

优选地，步骤1中，将感染有G2型PEDV毒株的仔猪的空肠肠道组织样品剪碎后匀浆，3000r/min离心5分钟，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌，接种生长良好的T-25单层Vero细胞，孵育1h后，弃去病毒液，用PBS清洗三次细胞后，加入10μg/ml胰酶的MEM培养基，置于37℃、含5％CO2的恒温培养箱中培养7日，观察是否出现细胞病变，如此盲传至细胞出现病变，收集培养物，冻融三次并命名，置-80℃以下超低温冰箱中保存。

优选地，步骤3中，利用反向遗传技术，实现了对PEDV的感染性克隆。

优选地，步骤3中，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将原始pBAC-PEDV质粒的RBD替换成一个AscI酶切位。

优选地，所述步骤3中，将RBD上游GG与下游CC之间的序列替换成CGCG形成一个AscI酶切位点，替换后的序列如下：GCTTTTGACCTTGACGATGGCGCGCCAAGTATACTATCTATGGCT。

优选地，步骤4中，以pTargetF质粒为模板，用AscI-N20-F/AscI-N20-R引物进行PCR扩增sgRNA，以pBAC-PEDV质粒为模板，分别用AscI-updonor-F/AscI-updonor-R和AscI-downdonor-F/AscI-downdonor-R引物扩增上游供体和下游供体，得到一个新的质粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)；

优选地，所述步骤6中，将连接产物转化TG1，涂布于LB+壮观霉素平板，37℃培养过夜，再通过感受态制备和质粒电转化操作。

优选地，从上述培养过作的平板上挑取大小中等形态正常的大肠杆菌单克隆至LB+Spe液体培养基，37℃220r/min培养，等菌液培养至肉眼可见混浊时用AscI-N20-F/AscI-downdonor-R引物进行菌液PCR验证。

第二方面，构建方法制备得到的猪流行性腹泻病毒感染性克隆。

本发明的有益效果为：

本发明利用反向遗传技术，实现了对PEDV的感染性克隆，感染性克隆中，我们使用人工细菌染色体技术(BAC)，成功获取了pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质粒，完成了PEDV的感染性克隆。

本发明以实验室前期构建的PEDV感染性克隆为基础，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将原始pBAC-PEDV质粒的RBD替换成RBD高频位点改造的突变体，构建流行毒株高保护PEDV疫苗。

理想的猪流行性腹泻疫苗应该兼具高安全性与高免疫效力。中国养猪面积幅员辽阔，即使同属于G2型PEDV毒株，在不同地区PEDV的流行毒株不完全一致，尤其现在对PEDV毒力起着决定作用的S基因上，发生了很多突变。市场上对PEDV高致病性变异毒株有效的疫苗非常渴望，本发明以现有国内发病率最高的G2型PEDV毒株为亲本，构建了PEDV基因组cDNA克隆，并完成了对病毒的拯救，同时研制了新型疫苗小样，并且完成了阶段性的动物试验，证明了重组病毒能够激发小鼠产生中和抗体，为该疫苗进入靶动物试验和临床试验阶段奠定了坚实的基础。

本发明的创新点在于，利用反向遗传技术，完成了PEDV的感染性克隆；对于PEDV来说，由于其对小猪的高发特点，我们在改造的过程中，更多的保留主流行毒株的S蛋白，另外通过感染性克隆技术手段替换其他蛋白，从而使PEDV致弱。弱毒疫苗可以在母猪身上诱发出高效的中和抗体，类似于人类的母乳喂养的孩子更加健康一样，母猪通过母乳把PED抗体传递给仔猪，从而达到理想的抗PEDV保护效果。

附图说明

利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。

图1是RT-PCR扩增Vero细胞培养物的电泳图(其中，M：DNA Marker 2000；1：第5代的Vero细胞培养物，2：疫苗毒CV777对照；3：阴性对照)；

图2、图3和图4均为本发明PEDV感染性克隆RBD突变体替换演示图；

图5是本发明pCas质粒图谱；

图6是本发明pTargetF质粒图谱；

图7是本发明PCR扩增PCR扩增上游供体和下游供体结果(其中，M:DL2000Marker；1：sgRNA；2：updonor；3：downdonor)；

图8是本发明pTargetF质粒用SpeI/HindIII进行双酶切结果(其中，M:DL5000Marker；1:pTargetF SpeI/HindIII酶切)；

图9是本发明pTarget-AscI-donor/TG1菌液PCR结果(其中，M:DL5000 Marke)；

图10是本发明pTarget-AscI-donor/TG1菌液提取质粒后PCR结果(其中，M:DL5000Marker；1/2/3/4：pTarget-AscI-donor/TG1菌液提取质粒后PCR)；

图11是本发明RBD敲除并替换成AscI试验结果(其中，1、2、3、6、12、13:RBD敲除并替换成AscI的克隆；4、5、7、8、9、10、11、12、14：RBD未成功敲除的克隆)；

图12是本发明菌液PCR验证正确的克隆再次进行PCR的结果(其中，M:DL5000Marker)；

图13是本发明pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质粒提取PCR结果(其中，M:DL15000Marker；1-2：pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质粒)；

图14是本发明RBD突变体扩增结果(其中，M:DL5000 Marker；mut1-mut5:合成RBD突变体)；

图15是本发明pBAC-PEDV(mut)/TG1菌液PCR验证结果(其中，M:DL5000 Marker)；

图16是本发明pBAC-PEDV(mut)/TG1菌及pBAC-PEDV/TG1阳性对照菌质粒提取结果(其中，M:DL15000 Marker；Mut1-mut5:pBAC-PEDV(mut)/TG1质粒；1：pBAC-PEDV/TG1阳性对照菌质粒)；

图17是本发明pBAC-PEDV(mut)与RBD序列比对；

图18是本发明pBAC-PEDV(mut)与mut-coe-AJ序列比对；

图19是本发明fPEDV LC-AJ-M3和fPEDV LC出现的典型PEDV病变图(其中，从左至右依次为：fPEDV LC-AJ-M3，24h；fPEDV LC-AJ-M3，48h；fPEDV LC，24h；fPEDV LC，48h)；

图20是本发明RT-PCR扩增病毒电泳图(其中，M：DL2000 Marker；1：fPEDV LC-AJ-M3；2：fPEDV LC；3：阴性对照)。

具体实施方式

为了更清楚的说明本发明，对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

PEDV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属I群成员。PEDV的病毒粒子被囊膜包裹，外观为多形性，大多呈球形，病毒直径为95～190nm，平均直径(包括纤突在内)约130nm。病毒囊膜上含有从核心向外放射状排列的纤突糖蛋白(S)、膜糖蛋白(M)和包膜糖蛋白(E)。位于病毒粒子内部的是病毒的核衣壳蛋白(N)，N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒的核衣壳。

基本原理：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将原始pBAC-PEDV质粒的RBD替换成一个AscI酶切位点，得到一个新的质粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)，提取得到质粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)用AscI酶切线性化，线性化产物乙醇沉淀回收，回收产物与RBD突变体连接即可得到RBD突变质粒pBAC-PEDV(mut)。

本发明将猪流行性腹泻G2株在Vero-CCL81细胞上传至P3代，随后对该毒株进行了鉴定，包括RT-PCR检测、病毒含量检测、特异性试验。将G2型PEDV株进行基因组序列分析，找出G2型PEDV毒株S基因编码氨基酸序列中特有的氨基酸突变区域，利用成熟的基因克隆和载体构建技术，将PEDV感染性克隆受体结合域(Receptor Binding Domain,RBD)替换成AscI酶切位点，经过RBD突变体的连接、验证及其质粒提取，按照提取的pBAC-PEDV(mut)质粒及pBAC-PEDV阳性对照质粒转染Vero-CCL81细胞进行病毒拯救。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

本试验所用试剂：

primeSTAR max premix、Solution I连接酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；2*T5super pcr mix，购自北京擎科新业生物技术有限公司；T4 DNA连接酶、DNA限制性内切酶均购自NEB有限公司；氯霉素、壮观霉素、卡那霉素、氨苄霉素均购自Amresco公司；质粒DNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自ThermoFisher公司；引物合成、测序均由北京擎科新业生物技术有限公司提供；MEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自PAN公司；Attractene Transfection Reagent购自QIAGEN公司；Opti-MEM购自Gibco公司；闪电克隆试剂盒购自ThermoFisher公司；L-阿拉伯糖购自郑州九庭化工产品有限公司；微孔滤膜(0.22微米)购自密理博科技有限公司；BAC/PAC质粒提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司。

本试验所用主要仪器：

纯水仪，购自成都优普仪器设备有限公司；恒温培养箱，购自武汉格莱莫检测设备有限公司；恒温培养摇床，购自浙江赛德仪器设备有限公司；微型生物反应器，购自Sartorius Stedim Biotech；ElgaNano drop2000，购自英国ELGA公司；漩涡混合器，购自海门其林贝尔公司；恒温水浴，购自西安夏溪电子有限公司；AE100电子式制冰机，购自SANYO制冰系统有限公司；PCR仪，购自美国伯乐公司；分析天平，购自梅特勒公司；紫外可见分光光度计，购自上海吉奇公司；凝胶成像系统购自美国伯乐公司；核酸电泳系统，购自北京海天公司；超低温冰箱，购自美国Thermo公司；小型mini离心机，购自北京海天友诚科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，购自山东新华公司；DYY-Ⅲ-6B型稳压稳流电泳仪；购自北京六一仪器厂；高速冷冻离心机，购自湖南湘仪实验仪器开发有限公司；5415D型离心机，购自德国eppendorf；pH计，购自梅特勒-托利多公司；CO2培养箱，购自Esco公司；真空干燥箱，购自上海一恒科技有限公司。

本试验所涉及到的引物见表1：

表1本试验所涉及到的引物及用途

结合以下实施例对本发明作进一步描述。

实施例

一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

一、病毒分离：

组织病料：从河北某养殖场选取健康的仔猪若干头，然后使用猪流行性腹泻G2株感染仔猪，在仔猪腹泻症状5日龄后，取其空肠肠道组织；

细胞：Vero细胞，由实验室制备、鉴定、供应；

血清：猪流行性腹泻病毒特异性阳性血清，猪流行性腹泻阴性血清均由中国兽医药品监察所提供。

猪流行性腹泻病毒的分离：将组织样品剪碎后匀浆，3000r/min离心5分钟，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌，接种生长良好的T-25单层Vero细胞，孵育1h后，弃去病毒液，用PBS清洗三次细胞后，加入10μg/ml胰酶的MEM培养基，置于37℃、含5％CO2的恒温培养箱中培养7日，观察是否出现细胞病变，如此盲传至细胞出现病变，收集培养物，冻融三次并命名，置-80℃以下超低温冰箱中保存。

病料接种Vero细胞后，盲传3代，置37℃，含5％CO2的培养箱中培养96小时后，产生细胞病变，表现为合胞体、细胞呈灶状脱落等。再继续传至第5代，收获培养物，标记为猪流行性腹泻病毒G2株F5代，置-70℃以下保存。

RT-PCR检测：病毒RNA的提取按照试剂盒的说明进行RNA的提取，提取物立即进行反转录或贮存于-80℃以下备用。

反转录程序：反应条件为37℃10分钟，42℃反转录1小时，冰浴2分钟。

PCR体系

PCR反应程序：94℃3min，94℃30s，60℃45s，72℃45s，35个循环，72℃7minc，4℃保存。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

病毒序列分析：提取病毒总RNA，用随机引物反转录后的cDNA产物进行病毒测序，并使用MEGA5.5软件进行全基因组序列比对。

病毒的RT-PCR检测结果

传统毒株扩增产物的电泳可见条带大小为645bp，根据现有的成熟的RT-PCR检测方法对提取的细胞培养物总RNA，进行检测。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳可见大小约为645bp基因片段的目的条带，详见图1。结果显示猪流行性腹泻病毒分离毒株的检测结果与传统毒株扩增产物的电泳可见条带大小一致。

二.试剂配制

1.培养基配置：

Luria-Bertani(LB)液体培养基将10g蛋白胨、5g酵母粉、10gNaCl依次加入蒸馏水至1000ml，搅拌均匀，121℃灭菌，20min。

Luria-Bertani(LB)固体培养基将10g蛋白胨、5g酵母粉、10gNaCl、10g琼脂粉依次加入蒸馏水至1000ml，搅拌均匀，121℃灭菌，20min。

2.标准溶液的配制：

(1)50×TAE缓冲液将242gTris碱、18.612g EDTA、57.1ml乙酸依次加入加蒸馏水至1000ml，调pH至8.0。

(2)5×SDS-PAGE电泳缓冲液量取1M Tris-HCl(pH6.8)0.6ml、50％的甘油5ml、10％的SDS溶液2ml、1％的溴酚兰1ml，加入去离子水定容至10ml。

(3)TE缓冲液取1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml、0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml加超纯水到100ml。

(4)染色液称取考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)R-250 0.2g、无水甲醇90ml、冰醋酸20ml，加蒸馏水定容到200ml。

(5)配制脱色液取250ml 95％乙醇、80ml冰醋酸，加蒸馏水，定容至1000ml。

(6)20％L-阿拉伯糖称取20g固体L-阿拉伯糖加蒸馏水至100ml，0.22μm滤膜除菌，-20℃存放备用。

(7)氨苄青霉素(100mg/ml)的配制取氨苄青霉素100mg溶在l ml无菌纯水中，在-20℃条件下存放。

(8)卡那霉素(100mg/ml)的配制取卡那霉素100mg溶于l ml灭菌蒸馏水中，-20℃存放备用。

(9)氯霉素取氯霉素34mg溶于1ml无水乙醇中，-20℃存放备用。

(10)壮观霉素取壮观霉素50mg溶于灭菌蒸馏水中，-20℃存放备用。

三、基因的克隆及载体构建：

基本原理：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将原始pBAC-PEDV质粒的RBD替换成一个AscI酶切位点，得到一个新的质粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)，提取得到质粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)用AscI酶切线性化，线性化产物乙醇沉淀回收，回收产物。如下图3-1：PEDV感染性克隆RBD突变体替换演示图2、图3和图4所示，将RBD上游GG与下游CC之间的序列替换成CGCG形成一个AscI酶切位点，替换后的序列如下：GCTTTTGACCTTGACGATGGCGCGCCAAGTATACTATCTATGGCT。

引物设计打开应用软件primer premier 5.0，输入目标序列，根据引物设计原则调整相关参数。得到引物序列，送北京擎科新业生物技术有限公司进行合成。

PCR扩增50μl反应体系，参照表2。按表格先后加入对应的组分。

表2PCR反应体系

反应条件：根据不同反应的退火温度而定；延伸时间按照扩增片段大小决定，扩增速度为6kb/min。

反应程序：98℃2min，1个循环；98℃10s，退火温度退火10s，72℃延伸，10s/kb，35个循环；72℃延伸2min；4℃保温。

表3菌液PCR反应

核酸电泳

(l)凝胶的配制用天平称取1g琼脂糖，轻轻加入250ml锥形瓶内，往其中添加100ml1×TAE缓冲液，将其放于微波炉中开始加热直至其中琼脂糖混合液完全溶解，取出缓缓摇匀后倒入插好梳子的电泳板中。室温静置约20min，使其冷却后完全凝固。将电泳板放入电泳槽中，小心拔去梳子。

(2)加样取5μl PCR反应液与1μl DNA混合上样。

(3)电泳电泳时间约30min。

(4)成像轻轻将凝胶平放于伯乐成像系统中获取图像。

凝胶回收把扩增的PCR产物或酶切质粒进行凝胶电泳，根据比对DNA Marker，切下目的条带，通过凝胶回收试剂盒获取目的片段。将目的DNA条带在琼脂糖凝胶中切下，置于无菌的离心管中，称重。将等体积的溶胶液加入到胶块中，65℃水浴环境10min，为确保胶块充分溶解，过程中不断柔和地上下翻转离心管。溶胶融化后待其降至室温，将过程中所得溶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000r/min离心1min，弃掉离心液，向CA2中加入300μl溶胶液，12000r/min离心1min，弃掉离心液，向CA2柱内加入500μl SPW wash buffer,离心1min，重复一次。空离2min，尽量除尽SPW wash buffer,室温放置数分钟，彻底晾干。将CA2放入一个干净的离心管中，将30μl EB buffer向吸附膜中间位置滴加，在室温环境下放置2min，用离心机将其12000r/min离心2min收集DNA。回收得到的线性DNA片段放置在-20℃冰箱保存。

酶切反应体系50μl反应体系参见表4。加入相应的载体或DNA片段，限制性内切酶及缓冲液，37℃酶切。

表4酶切反应体系

上述酶切产物进行核酸电泳，切胶回收。

连接体系遵照下表5添加，样品加好以后，离心混匀，22℃连接1小时，即可转化大肠杆菌感受态细胞。

表5连接反应体系

化学感受态制备

准备物品：(按20个感受态计算)

(1)50ml离心管2个，洗净，灭菌，干燥，预冷。

(2)1.5ml离心管：25个，灭菌，干燥，预冷。

(3)LB液体培养基：50ml液体LB放于500ml三角瓶(洗净)中，灭菌。

(4)LB液体培养基：3ml液体LB放于小试管中，灭菌。用于扩大培养大肠杆菌DH5α)。

(5)LB固体平板2个，无抗性(活化大肠杆菌DH5α)。

(6)DH5α大肠杆菌

(7)氯化钙：0.1M，25ml，灭菌，使用前置于冰浴中预冷。

称取CaCI

(8)氯化钙-氯化镁混合液：(氯化钙20mM，氯化镁80mM)200ml，灭菌，使用前置于冰浴中预冷。称取CaCI

(9)甘油：4ml，灭菌，预冷。(或DMSO 1ml)

(10)颗粒状小冰块。

(11)蓝枪头、黄枪头各一盒，灭菌，预冷。

(12)LB培养基：含胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂粉15g/L(固体培养基)，调节pH至7.0，高压灭菌。

操作步骤：

(1)划线接种DH5α到LB平板上，培养出单菌落。

(2)挑取单菌落至盛有液体LB的小试管中，37℃振荡(200r/min)过夜培养。

(3)将小试管中的菌液按1％接种转移至盛有50ml液体LB的三角瓶中，37℃振荡(200r/min)约1h，至OD

(4)把菌液倒入预冷的50ml离心管中，(每管放25ml)共2管。

(5)4℃，4500r/min离心10min，充分弃上清。

(6)每管加入15ml预冷的氯化钙-氯化镁混合液，重悬细胞，冰浴10min。

(7)4℃，4500r/min离心10min，充分弃上清。

(8)每管加入1ml预冷的氯化钙溶液，重悬细胞，冰浴10min。

(9)每管加入0.25ml预冷的无菌甘油，冰浴10min，分装到20个1.5ml EP管中，每个EP管分装100μl，放于-70℃冰箱中，备用。

Gibson连接在按下表加入0.05-0.1μg载体DNA，插入片段与载体的摩尔比为2:1-5:1。样品加好以后，离心混匀，50℃连接1小时，即可转化大肠杆菌感受态细胞。连接体系见表6。

表6闪电克隆连接反应体系

转化置于冰上解冻刚从-80℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞；100μl感受态细胞中分别加入5μl连接产物(或1μl质粒)；冰浴30min；42℃热击90s；冰浴2-5min；加入500μl LB培养基，置于37℃摇床150r/min培养45min进行活化；取200μl活化菌液涂布到含有相应抗生素的LB固体平板；将涂布好的平板放置于37℃恒温倒置培养过夜。

质粒提取用上述培养获得的单克隆，扩大培养后，质粒提取用速提取试剂盒进行，步骤如下：取其中1.5-5ml过夜培养的菌液，置于1.5ml离心管内，13000r/min离心1min，若一次装不下可分几次离心。尽量吸净上清，加入250μl solution I，细菌沉淀用振荡器或移液枪来彻底悬浮。向离心管内加入250μl solution II，柔和地上下翻转6-8次，使之均匀混合，再加入350μl solution III，及时柔和地上下翻转6-8次，使之均匀混合，此时白色絮状物沉淀会出现，将其置入离心机内，12000r/min离心10min。将上一步离心得到的上清液倒入吸附柱CP3中，尽量不要倒出沉淀。按照12000r/min离心30-60s，倒掉收集管中的废液，而将CP3放回收集管。向CP3中加入600μl DNA wash buffer，12000r/min离心30-60s，重复一次。离心机离心CP3 2min，去除剩余DNA wash buffer。敞开CP3管盖子，在室温下，静置数分钟，完全晾干材料中的DNA wash buffer。将吸附柱放到干净的离心管中，向该吸附柱中滴加35μl洗脱液Elution buffer，室温放置2min，最后12000r/min离心1min得到质粒。

BAC质粒提取：按BAC/PAC质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取,

DNA测序：将得到的待验证的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司测序，并用BLAST将测序结果与目的片段进行比对以验证其是否正确。

PEDV感染性克隆包毒

质粒转染：质粒用新提取的fPEDV、

细胞为Vero-CCL81

转染试剂：Attractene Transfection Reagent

(1)铺Vero单层细胞(六孔板)，长至75％-90％时进行转染；

(2)取1.2ug质粒，补opti-MEM至100uL体积(比如100ng/uL质粒，取12uL，再补88uLopti-MEM)，充分混匀；

(3)加入1.2uL转染试剂，温和的吹打混匀，室温静置15min；

(4)细胞换新鲜的10％FBS-MEM；

(5)将静置后的质粒温和的加入已换好新鲜培养基的六孔板中；

(6)换液

转染24h后换2％血清MEM,观察CPE；

(7)传代

转染后84h还没有CPE反复冻融3次，收毒接F2代，(6孔板中每孔接毒500uL)，

出现CPE，包毒成功。

PEDV感染性克隆RBD替换成AscI酶切位点

pTarget-AscI-donor载体构建,

PCR扩增以pTargetF质粒为模板，用AscI-N20-F/AscI-N20-R引物进行PCR扩增含有20bp与RBD同源的的sgDNA。以构建的pBAC-PEDV感染性克隆质粒为模板，分别用AscI-updonor-F/AscI-updonor-R和AscI-downdonor-F/AscI-downdonor-R引物进行PCR扩增上游供体和下游供体，将PCR产物进行电泳。

胶回收分别切胶回收上述目的片段。

双酶切将pTargetF质粒用SpeI/HindIII内切酶进行双酶切，双酶切体系见表4。酶切产物进行核酸电泳检测。

连接与转化上述SpeI/HindIII酶切回收的pTarget载体骨架与sgDNA、updonor、downdonor用闪电克隆试剂盒共同连接，50℃水浴反应15min，取5μl连接产物通过化学转化法转化TG1化学感受态，涂布于LB壮观霉素(缩写为Spe，下同)平板，37℃培养过夜。

菌液PCR验证从上述培养过作的平板上挑取大小中等形态正常的大肠杆菌单克隆至LB+Spe液体培养基，37℃220r/min培养。等菌液培养至肉眼可见混浊时用AscI-N20-F/AscI-downdonor-R引物进行菌液PCR验证。

菌液PCR验证正确的菌株用终浓度25％的甘油保菌。剩余的菌液提质粒，所提取的质粒核酸电泳检测。将上述所提取的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

体内遗传操作体内遗传操作是PEDV感染性克隆RBD替换成AscI酶切位点的一部分。先构建pTarget-AscI-donor载体，再通过体内遗传操作将PEDV感染性克隆RBD替换成AscI酶切位点。

TG1感受态的制备将大肠杆菌克隆菌株TG1平板划线于LB平板，37度培养过夜，再从过夜培养的平板上挑取单克隆至LB培养基，37度培养过夜。上述培养过夜的菌液取1ml转接至100ml LB培养基培养至OD为0.4-0.6时，制备化学感受态细胞。

pCas/TG1电转感受态制备pCas质粒转化上述制备的TG1化学感受态，涂布于LB+卡那霉素(Kan，下同)平板，30℃培养过夜。从上述平板中挑取单克隆至LB+Kan培养基培养过夜，培养过夜的菌液取1ml转接至100ml LB+Kan培养基培养至OD为0.4-0.6时制备电转感受态。

pCas&pBAC-PEDV/TG1电转感受态制备pBAC-PEDV质粒电转化上述制备的pCas/TG1电转感受态，涂布于LB+卡那霉素(Kan)平板，30℃培养过夜。从上述平板中挑取单克隆至LB+Kan+Cm(氯霉素)培养基，30℃220r/min培养过夜，培养过夜的菌液取1ml转接至100ml LB+Kan+Cm培养基，同时加入1ml的20％L-阿拉伯糖诱导，30℃220r/min培养至OD为0.4-0.6时制备pCas&pBAC-PEDV/TG1电转感受态。

pTarget-AscI-donor质粒电转化取1-3μl的pTarget-AscI-donor质粒电转化上述制备的pCas&pBAC-PEDV/TG1电转感受态，涂布于LB+Kan+Spe+Cm平板，30℃培养过夜。

阳性克隆的初步验证从上述培养过夜的LB+Kan+Spe+Cm平板中挑取大小与形态正常的单克隆至LB+Kan+Spe+Cm培养基，30℃220r/min培养过夜。培养过夜的菌液取1μl进行PCR验证，验证所用引物为RBD-up243-F/RBD-downdonor-R。未敲除RBD片段的pBAC-PEDV阴性对照片段大小约850bp，RBD成功敲除并替换成AscI后的目的片段大小约350bp。

图5和图6中，pCas质粒包含一个温敏型启动子，该启动子在30℃下可以正常复制，在42℃时则不能复制。因此，可以通过提高生长温度来消除该质粒。pCas质粒可以在L-阿拉伯糖的诱导下表达同源重组所需要的重组酶，从而可以提高重组效率。pCas质粒还可以组成型表达Cas9蛋白，该蛋白可以与pTarget-AscI-donor质粒转录的sgRNA形成蛋白-RNA复合物，sgRNA含有一段20bp与RBD同源的片段。当sgRNA与Cas9蛋白形成复合物后可以特异性地识别pBAC-PEDV感染性克隆RBD片段的特定序列，并进行特异性切割，形成双链断裂。断裂后的pBAC-PEDV在pCas质粒表达的重组酶作用下，以pTarget-AscI-donor质粒上带的供体为模板进行同源重组。同源重组后的pBAC-PEDV质粒敲除RBD，并替换成一个AscI酶切位点。未能发生重组的质粒由于不能修复，从而维持被切割成双链断裂的状态，因此不能复制，也不能产生对Cm的抗性。因此在LB+Kan+Spe+Cm平板上生长。因此可以通过Cm抗生素来筛选发生同源重组的阳性克隆。pCas质粒的另一个功能是其含有一个lacI启动子，该启动子在IPTG的诱导下可以转录出一个针对pTargetF质粒的sgRNA，这个sgRNA与pCas质粒自身表达的Cas9蛋白可以形成复合物，该复合物可以特异性地切割pTargetF，使pTargetF质粒形成一个双链缺口，双链缺口使pTargetF质粒不能正常复制，从而可以消除pTargetF质粒。

阳性克隆测序验证

将上述菌液PCR验证正确的克隆再次进行PCR，并核酸电泳检测，并切胶回收PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序验证。

pTarget-AscI-donor质粒的消除

将上述通过测序验证正确的菌株命名为pCas&pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)&pTarget-AscI-donor/TG1。将测序验证正确的pCas&pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)&pTarget-AscI-donor/TG1菌株转接至LB+Kan+Cm培养基，30℃培养至OD约0.6时加入终浓度0.5mM的IPTG诱导用于消除pTarget-AscI-donor质粒。

上述消除pTarget-AscI-donor质粒的pCas&pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)&/TG1菌株分别用枪头沾取少许菌液平板划线于LB+Kan+Cm与LB+Kan+Spe+Cm平板，如果在该菌株在LB+Kan+Cm平板上能正常生长，而在LB+Kan+Spe+Cm平板中不能正常生长，说明菌株不含有Spe抗性，即说明pTarget-AscI-donor质粒已经消除。将成功消除pTarget-AscI-donor后的菌株命名为pCas&pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)&/TG1并用25％的甘油保存正确的克隆。

pCas质粒消除

从上述验证pTarget-AscI-donor成功消除的pCas&pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)/TG1平板上挑取单克隆至LB+Cm液体培养基，42℃220r/min培养过夜。过夜培养的菌液再1％接种至LB+Cm培养基，再次42℃220r/min培养用于消除pCas质粒。上述两次42℃培养的菌液分别划线于LB+Cm和LB+Kan+Cm平板，37℃培养箱培养过夜。如果菌体在LB+Cm平板上能正常生长，而在LB+Kan+Cm平板上不能正常生长，说明菌株不含有Kan抗性，即说明pCas已经消除，得到的菌命名为pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)/TG1.

pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质粒提取

上述验证正确的pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)/TG1菌株转接至150ml LB+Cm液体培养基，37℃220r/min培养过夜。过夜培养的菌液离心后进按Aidlab的BAC/PAC大型质粒提取试剂盒的说明书进行pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质粒提取。

RBD突变体的连接、验证及其质粒提取

pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质粒AscI酶切回收上述提取的质粒用AscI酶切，酶切产物乙醇沉淀回收。

RBD突变体扩增与回收分别用mut-F/mut-Gib-R引物以合成的RBD突变体为模板进行PCR扩增RBD突变体，并进行回收。

RBD突变体的连接AscI酶切回收的pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质粒骨架与上述回收的的5个RBD突变体用闪电克隆试剂盒进行连接，并转化EZ10感受态，涂布于LB+Cm平板，37℃培养。从上述过夜平板中挑取pBAC-PEDV(mut)/TG1单克隆至LB+Cm培养基，37℃培养，并进行菌液PCR验证，验证引物为RBD-up243-F/RBD-down180-R。

pBAC-PEDV(mut)质粒提取上述测序验证正确的5株pBAC-PEDV(mut)/TG1菌及pBAC-PEDV/TG1阳性对照菌分别培养150ml菌液，离心后用BAC/PAC大型质粒提取试剂盒进行质粒提取。

包毒验证上述提取的5个pBAC-PEDV(mut)质粒及pBAC-PEDV阳性对照质粒进行包毒验证，质粒转染方法如下：

质粒用新提取的fPEDV

细胞为Vero-CCL81

转染试剂：Attractene Transfection Reagent

(1)铺Vero单层细胞(六孔板)，长至75％-90％时进行转染；

(2)取1.2ug质粒，补opti-MEM至100uL体积(比如100ng/uL质粒，取12uL，再补88uLopti-MEM)，充分混匀；

(3)加入1.2uL转染试剂，温和的吹打混匀，室温静置15min；

(4)细胞换新鲜的10％FBS-MEM；

(5)将静置后的质粒温和的加入已换好新鲜培养基的六孔板中；

(6)换液：转染24h后换2％血清MEM,观察CPE；

(7)传代：转染后84h还没有CPE反复冻融3次，收毒接F2代，(6孔板中每孔接毒500uL)，

出现CPE，包毒成功。

实验结果检测分析：

1、pTarget-AscI-donor载体构建

以构建的pBAC-PEDV感染性克隆质粒为模板，分别用AscI-updonor-F/AscI-updonor-R和AscI-downdonor-F/AscI-downdonor-R引物进行PCR扩增上游供体和下游供体，结果见图6。由结果可知，sgDNA、上游供体与下游供体扩增结果正常，与预期大小172bp、163bp、150bp相同。

将保存的pTargetF质粒用SpeI/HindIII内切酶进行双酶切，酶切产物进行核酸电泳检测，结果见图7。电泳结果可以看出pTargetF质粒酶切结果正常，目的片段酶切后大小约2100bp，与预期大小相同。结果如图8所示，图8中，M:DL5000 Marker；1:pTargetF SpeI/HindIII酶切。

菌液物用AscI-N20-F/AscI-downdonor-R引物进行菌液PCR验证，结果见图8。剩余的菌液提质粒，所提取的质粒核酸电泳检测。结果见图9，由电泳结果可以看出质粒大小正确。

2、体内遗传操作

未敲除RBD片段的pBAC-PEDV阴性对照片段大小约850bp，RBD成功敲除并替换成AscI后的目的片段大小约350bp，菌液PCR验证结果见图10。结果可以看出，未敲除RBD的pBAC-PEDV阴性对照PCR扩增片段大小约850bp，敲除了RBD并替换成AscI酶切位点的阳性克隆条带大小约350bp。所挑取的14个克隆中有6个克隆大小正确。

将上述6个菌液PCR验证正确的克隆再次进行PCR，并核酸电泳检测，并切胶回收PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序验证，扩增目的片段见图11。

按Aidlab的BAC/PAC大型质粒提取试剂盒试剂盒的说明书进行pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质粒提取，质粒提取结果见图12。由结果可以看出，所提取的两个质粒大小均在15000bp以上。两个质粒均有两条条带，分别对应的是闭合环状及开环的质粒，结果与事实相符。

3、RBD突变体的连接、验证及其质粒提取

分别用mut-F/mut-Gib-R引物以合成的RBD突变体为模板进行PCR扩增RBD突变体，并进行回收，引物及PCR结果见图13。

pBAC-PEDV(mut)/TG1单克隆至LB+Cm培养基，37℃培养，并进行菌液PCR验证，验证引物为RBD-up243-F/RBD-down180-R。引物序列及菌液PCR结果见图14。RBD突变体连接后，目的条带大小约为850bp，说明RBD突变体成功连接。

pBAC-PEDV(mut)/TG1菌及pBAC-PEDV/TG1阳性对照菌用BAC/PAC大型质粒提取试剂盒进行质粒提取，结果见图15和图16。

图17和图18是PEDV感染性克隆RBD突变体替换，是在北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，测序正确，5个RBD突变体都已经连接上去。

实验验证：

试验材料

细胞Vero-CCL81细胞来自陕西诺威利华生物科技有限公司。

试剂Opti-MEM购自Gibco公司；转染试剂购自Qiagen公司；DNA/RNA共提取试剂盒购自宝生物(大连)有限公司；MEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibco公司。

试验方法

质粒转染用Vero-CCL81细胞进行PEDV感染性克隆病毒拯救。在6孔细胞培养板中培养Vero细胞，每孔加2ml细胞液。放置于浓度5％CO

待出现细胞病变后，或转染后84h后若还没有细胞病变，可将细胞反复冻融3次，记为F1代，按照3000r/min离心10min的方法收取上清。吸取其中500μl的上清液接种于成长良好的单层Vero细胞中，放置在37℃，含浓度5％CO

RT-PCR检测病毒

取F3代感染性克隆病毒培养液，冻融3次后按照病毒基因组DNA/RNA共提取试剂盒说明书提取总RNA，具体步骤如下：

(1)将收集的病毒液200μl加入适量裂解液RLplus，涡旋振荡30s；

(2)将所有溶液转移至DNA吸附柱CR3，用离心机按照12000r/min离心1min，收取滤液。

(3)向滤液中加入等体积70％乙醇，混和均匀，将得到的沉淀与溶液一并转入RNase-Free吸附柱CR3内，放入离心机，设置12000r/min离心1min，弃去收集管中的滤液，将吸附柱CR3重新放回到收集管中；

(4)向吸附柱CR3加入700μl去蛋白液RW1，12000r/min离心1min，弃掉收集管中的滤液，将吸附柱CR3重新放归收集管中；

(5)将700μl漂洗液RW加入到吸附柱CR3中，室温静置2min，用离心机对其12000r/min离心1min，弃去收集管中的滤液，将处理完的吸附柱CR3重新放回到收集管中；再照此重复一次；

(6)用离心机按照12000r/min离心1min，弃去收集管中的滤液，在室温环境下将吸附柱CR3静置数分钟；

(7)将吸附柱CR3转到一个新的1.5ml RNase-Free离心管中，在其中加入RNase-Free ddH

RNA提取后，生成cDNA，用于后续PCR检测，具体操作如下：

(1)将RNA模板和试剂盒中的组分置于冰上慢慢溶解待用；

(2)在无核酸酶的微量离心管中按下表格配置反转录反应体系，用枪头混匀，短暂离心：RNA模板8μl；gDNAremover 1μl；10*gDNAremover Buffer1μl；

(3)42℃孵育2min，随后60℃孵育5min；

(4)混合物迅速置于冰上冷却，短暂离心后加入以下组分：dNTP Mix 1μl；Oligo(dT)

(5)用枪头或其他方式轻轻混匀，简短离心后55℃孵育30min，85℃孵育5min，置于冰上或冷藏待用。

用引物扩增的反转录得到的cDNA模板。

动物试验

病毒扩大培养：将阳性对照病毒和改造后的病毒分别大量扩增，并测定病毒滴度，反复冻融后，离心去除细胞碎片，保存备用，测定效价后制备疫苗小样。

病毒毒价测定：将长至致密单层的Vero细胞消化后，密度调节至2×10^5/ml，铺入96孔板中，100μl/孔，放置在5％CO

试验动物分组及免疫

(1)动物分组

将30只SPF级Balb/c小鼠分成3组，每组10只，三组分别免疫fPEDV LC-AJ-M3、MEM和疫苗毒CV777，免疫剂量见表。0d进行一次免疫，14d在进行一次加强免疫。于免疫后14d、21d、28d通过小鼠眼眶静脉采血，分离血清，分别进行中和试验。

表7实验动物分组及免疫

(2)病毒中和试验

为了评价新型疫苗产生抗体能否与对流行性毒株产生保护作用，利用中和试验进行测定。采用固定病毒稀释血清法进行检测。将待检血清56℃灭活30min，5000r/min离心10min，取上清，将血清用MEM培养基分别做1:8、1:16、1:32、1:64、1:128倍稀释，稀释后分别与等体积的200TCID

试验结果：

重组成功的PEDV感染性克隆转染Vero细胞，84h后收取细胞，反复冻融，3000r/min离心10min后收集上清。取500μL上清重新感染Vero细胞，48h出现典型的PEDV细胞病变，Vero细胞发生融合并产生合胞体，说明构建的PEDV感染性克隆具有感染性，由于本次研究共合成了5个RBD突变体，最后只有其中的mut3最后病毒拯救成功，故将拯救成功的病毒命名为fPEDV LC-AJ-M3。根据试验设计阳性对照质粒也出现了典型PEDV病变，将其命名为fPEDV LC，如图19所示。

RT-PCR检测结果：

RT-PCR检测扩增病毒电泳图20所示。

病毒毒价测定：

测定扩增的fPEDV LC-AJ-M3和fPEDV LC的病毒毒价，分别取三个平行样，用Reed-Muench法计算TCID

中和试验结果：

中和效检测定结果如表4-2：

表4-2免疫实验中和效检结果

备注：中和效价＞1:8，判定为阳性。

通过感染性克隆和病毒拯救技术，我们构建了PEDV新型重组病毒，该病毒为弱毒株，命名为fPEDV LC-AJ-M3。经过测定病毒含量后制备疫苗小样，进行了小鼠免疫试验，结果证明血清抗体具有中和活性，小鼠抗体的中和试验效价较高，为后期靶动物试验和新型疫苗研发奠定了基础。改变现有病毒的非结构蛋白能够致使病毒致弱，是冠状病毒的特点。同时现在已经证实S基因区域是PEDV免疫优势区，PEDV主要的中和抗原表位就存在该区域。对于PEDV来说，由于其对小猪的高发特点，我们在改造的过程中，更多的保留主流行毒株的S蛋白，另外通过感染性克隆技术手段替换其他蛋白，从而使PEDV致弱。弱毒疫苗可以在母猪身上诱发出高效的中和抗体，类似于人类的母乳喂养的孩子更加健康一样，母猪通过母乳把PED抗体传递给仔猪，从而达到理想的抗PEDV保护效果。

试验结果证实，构建的感染性克隆病毒可以在Vero细胞中连续传代，获得的病毒能够刺激免疫动物产生有保护力的抗血清。以上研究都为后期靶动物试验和进一步开发新型疫苗提供了思路和基础。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。