猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建及猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞转录组学研究

摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是一种急性、高度传播性的肠道疾病，该病由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水等为主要临床特征。PED于2010年起在中国再次爆发，该次流行主要以变异毒株的出现为特征，造成80％-100％的哺乳仔猪发病，50％-90％的仔猪死亡。后来该病于2013年5月在美国爆发，给养猪业带来了极大的经济损失。
　　猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病的重要病原，给当前养猪业造成极大的经济损失，其靶细胞主要是单核巨噬细胞系统和树突状细胞，其感染后主要的临床组织病变为淋巴细胞减少和炎性细胞浸润，最终导致机体免疫功能抑制，从而继发感染其他细菌和病毒。
　　本论文针对这两种猪的重要病原，主要研究内容如下:
　　1.PEDV的流行病学调查通过对2011年2月至2011年10月间从华中、华东、华南、西南地区12个省份的57个猪场采的455份临床样品（包括粪便样品、小肠样品和乳汁样品），用RT-PCR检测方法检测，结果显示，有45个猪场的278份样品为PEDV阳性，猪场阳性率为78.95％，样品阳性率为61.11％，这些阳性样品包括253份粪便样品、20份小肠样品、5份乳汁样品，总样品阳性率为61.11％，表明PEDV在我国流行十分广泛，感染率相当高，同时本研究还从乳汁中检测到PEDV阳性，说明PEDV可能通过母乳垂直传播给哺乳仔猪。
　　2.PEDV CHGDU株的分离与鉴定尽管PEDV的感染率很高，猪流行性腹泻病毒的分离仍然十分困难。本研究将采自广东省某猪场发病仔猪的小肠样品处理后，接种Vero-CCL81细胞，同时维持液中添加15μg/mL胰蛋白酶，盲传3代后，有一份小肠样品接种的细胞观察到明显的PEDV特征性的多核细胞体病变，分离到的病毒通过RT-PCR和IFA检测，证实PEDV阳性，将该分离株命名为CHGDU。
　　3.PEDV CHGDU株S基因全长测定及分析通过对CHGDU毒株S基因全长测定及分析发现，该毒株与NCBI中登录的另一毒株GD-A毒株S基因的序列同源性为100％，进一步分析S基因的序列特征发现该毒株属于变异毒株，通过与疫苗株CV777 S蛋白相应区域分析结果表明:中和表位COE区域存在3个氨基酸突变（T554S、G599S和Q638S），而另一中和表位S1D区域包含5个氨基酸的突变(N724S、N728S、P768R、L769S和D771S)，与CV777相比，CHGDU在S1/S2结合位(P768R)和S2'位点突变为精氨酸(G896R)，这些位点可被蛋白质转化酶PC(proprotein convertase，PC)所识别和切割，从而增强病毒致细胞病变的能力和毒力。将CHGDU株的S基因与已测定的其他152株GenBank登录的S基因全长序列进行比较，并利用MEGA6软件绘制系统发育树，发现这些毒株可分为两个大群即Genogroup1和Genogroup2;其中这两个群又被分为两个亚群即1a、1b及2a、2b。Genogroup1群主要由2010年以后分离和报道的中国毒株以及2013年和2014年美国流行毒株组成，其中CHGDU株属于1a群，属于PEDV变异株，该毒株与处于2b亚群的疫苗毒株DR13和CV777遗传关系较远。
　　4.病毒的S基因全长克隆及重组病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP的拯救为进一步验证S基因在病毒致病过程中的作用，本研究首先克隆了CHGDU的S基因全长，成功构建表达载体PCAGGS-CHGDU-S-Flag，通过转染Vero-CCL81，IFA验证S基因能顺利表达，并在5μg/mL胰蛋白酶存在的条件下诱导细胞和细胞的融合，进一步将该基因克隆至穿梭载体，成功构建穿梭载体pPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP，通过体外转录RNA，电转至含有鼠肝炎病毒S基因的重组病毒mPEDV感染的Vero-CCM细胞中，通过定向重组的方法拯救出重组病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP，并且验证该毒株在培养过程中需要外源添加胰蛋白酶，证明S基因是决定PEDV毒株对胰蛋白酶依赖的关键基因。
　　5.Vero-hTMPRSS2-HA细胞系的构建与hTMPRSS2在病毒感染过程中作用的研究首先克隆了人丝氨酸蛋白酶TMPRSS2基因，构建了含有HA标签的表达质粒PQCXIN-hTMPRSS2-HA，Western-blot证实该蛋白正确表达，利用MLV系统，构建稳定表达细胞系Vero-hTMPRSS2-HA，并对细胞系进行了IFA和Western-blot检测hTMPRSS2的表达，证实稳定表达hTMPRSS2的细胞系构建成功，再利用含有GFP重组病毒为工具，测定了hTMPRSS2在病毒感染和释放过程中的作用，结果表明，hTMPRSS2在病毒入侵和释放过程中均没有明显的作用。
　　6.猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞的转录组学研究本研究采用WH株体外感染猪原代肺泡巨噬细胞，分别在感染后24小时和48小时取样进行全基因组表达谱分析，结果显示:24小时感染组中共有266个基因差异表达，其中包括212个上调表达和54个下调表达的差异基因;48小时感染组中共有175个基因差异表达，其中包括150个上调表达和25个下调表达的差异基因，但两组间相互比较，仅有6个基因差异表达。24小时感染组差异表达基因主要与细胞的运动、血液系统的形成和功能、免疫细胞运输、细胞-细胞间的信号传递和相互作用和肾脏相关疾病等功能相关，与之相关的生物学进程主要有:免疫反应、炎症应答、抗原递呈、趋化性和抗凋亡等;而48小时感染组差异基因主要与癌症、胃肠疾病、肿瘤的形成、细胞的死亡、组织损伤和免疫细胞的运输等功能相关，与之相关的生物学进程有:炎症应答、免疫反应、趋化性和细胞与细胞信号传递等。在两个感染时间点，均发现大量炎症相关基因的上调表达，炎症因子的上调表达可能PCV2导致系统性的炎症反应的原因。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

第1章 文献综述

1．1 猪流行性腹泻病毒研究进展

1．1．1 PED的流行

1．1．2 PEDV的分类地位

1．1．3 PEDV的分子结构

1．1．4 5’UTR和3’UTR

1．1．5 复制酶基因ORF1

1．1．6 S基因的结构、功能及应用

1．1．7 M基因的结构与功能

1．1．8 E基因的结构与功能

1．1．9 ORF3基因的结构与功能

1．1．10 N基因的结构与功能

1．1．11 PEDV的受体研究进展

1．2 冠状病毒感染性克隆研究进展

1．3 猪圆环病毒研究进展

1．3．1 猪圆环病毒概述

1．3．2 PCV2生物学特性

1．3．3 PCV2基因组成

1．3．4 PCV2编码的蛋白质

1．3．5 PCV2病毒的复制

1．3．6 PCV2的传播途径

1．3．7 PCV2感染与临床疾病

1．3．8 PCV2致病机理

1．3．9 PCV2与宿主免疫系统的相互作用

第2章 PEDV CHGDU株感染性克隆的构建

2．1 研究的目的及意义

2．2 材料与方法

2．2．1 病料

2．2．2 细胞与菌株

2．2．3 载体与质粒

2．2．4 工具酶及主要试剂

2．2．5 重要仪器和设备

2．2．6 培养基配制

2．2．7 感受态细胞制备

2．2．8 分子生物学分析软件

2．3 试验方法

2．3．1 病料采集与处理

2．3．2 病毒的分离

2．3．3 PEDV的增殖

2．3．4 TCID50的测定

2．3．5 病毒RNA提取

2．3．6 引物的设计与合成

2．3．7 反转录合成cDNA

2．3．8 质粒转染实验

2．3．9 间接免疫荧光(IFA)

2．3．10 RNA定向重组

2．3．11 病毒空斑纯化

2．3．12 病毒生长曲线的绘制

2．3．13 重组病毒对胰蛋白酶依赖性测定

2．3．14 MLV系统构建稳定细胞系Vero-hTMPRSS2-HA筛选

2．3．15 hTMRSS2在重组病毒感染过程中的作用

2．4 实验结果与分析

2．4．1 猪流行性腹泻病毒流行病学调查

2．4．2 病毒的分离

2．4．3 PEDV CHGDU株病毒毒价的测定

2．4．4 病毒的RT-PCR检测

2．4．5 间接免疫荧光实验(IFA)

2．4．6 病毒的S基因全长序列测定及分析

2．4．7 病毒的S基因全长克隆及IFA验证

2．4．8 穿梭质粒pPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3／GFP的构建

2．4．9 重组病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3／GFP的拯救

2．4．10 重组病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3／GFP生长曲线的绘制

2．4．11 rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3／GFP对胰蛋白酶依赖性测定

2．4．12 稳定表达蛋白酶hTMPRSS2的Vero-CCL81细胞系的构建

2．4．13 蛋白酶TMPRSS2在PEDV感染中的作用测定

2．5 讨论

2．5．1 PEDV流行病学调查及CHGDU毒株的分离鉴定

2．5．2 PEDV CHGDU株S基因全长测序及序列分析

2．5．3 重组病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3／GFP的拯救

2．6 小结

第3章 猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞转录组学研究

3．1 研究目的及意义

3．2 材料与方法

3．2．1 毒株及细胞

3．2．2 培养基与相关试剂的配制

3．2．3 主要试剂

3．2．4 主要仪器

3．2．5 试验动物

3．2．6 肺泡巨噬细胞的分离鉴定

3．2．7 PCV2感染实验设计

3．2．8 肺泡巨噬细胞总RNA的提取

3．2．9 样品RNA荧光标记

3．2．10 芯片的杂交与清洗

3．2．11 基因芯片扫描

3．2．12 基因芯片图像的采集与数据分析

3．2．13 芯片结果实时荧光定量PCR分析

3．2．14 细胞因子检测

3．2．15 差异表达基因的互作分析

3．2．16 统计学分析

3．3 实验结果与分析

3．3．1 感染前仔猪的检测

3．3．2 PCV2感染后和qPCR和IFA检测结果

3．3．3 样品RNA质量检测

3．3．4 芯片杂交结果及差异表达基因GO聚类分析

3．3．5 差异基因互作网络分析

3．3．6 芯片结果qPCR验证

3．3．7 PCV2感染后细胞上清中细胞因子检测

3．4 讨论

3．4．1 CD74在PCV2感染中的作用

3．4．2 Toll样受体通路分析

3．4．3 MHCII类分子与PCV2感染

3．4．4 细胞凋亡和生长抑制

3．4．5 钙结合蛋白在PCV2感染中的作用

3．4．6 炎症反应

3．5 小结

第4章 结论

参考文献

附录

个人资料

致谢