重组病毒

摘要： 2020年美国报道了高致病性的RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株,其对猪的致死率达到17.5%。为了分析美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国当前流行的PRRSV的关系,本研究对中国不同基因亚型的PRRSV与美国新发1-4-4 lineage1C PRRSV变异株进行遗传演化分析,结果显示,中国类NADC34 PRRSV与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株关系密切;其Nsp2推导氨基酸序列比对结果显示,中国类NADC34 PRRSV与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株在Nsp2区域存在相同的分子特征,即100个氨基酸(aa328~aa427)的连续缺失。PRRSV基因重组分析结果显示,美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株是以类NADC34 IA14737-2016株为母本毒株,并由IA/2014/NADC34和NADC30病毒株提供重组基因片段的重组病毒,而中国早期的类NADC34 PRRSV是以IA/2014/NADC34株为母本毒株的重组病毒。美国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪的致病力差异较大,而中国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪多为中、低致病力。此外,中国HLJZD22-1812株与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株具有类似的重组模式、相同的Nsp2缺失特征、相同的1-4-4 ORF5限制性片段长度多态性(RFLP)模式,且均属于lineage1C分支。本研究结果首次表明美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国类NADC34(PRRSV)属于同一亚型分支,且具有一致的分子特征,提示类NADC34 PRRSV在我国的流行及演化情况需高度关注。

摘要： 【目的】研究针对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)的耐热基因工程疫苗。【方法】利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株的HN基因替换到LaSota疫苗株上,再将禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)的Fiber2基因插入到其基因组上,构建表达Fiber2蛋白的重组耐热NDV质粒pTS-HN-Fiber2。通过病毒拯救技术拯救重组NDV rTS-HN-Fiber2,并测定其生物学特性和作为疫苗候选株的免疫原性和攻毒保护性。【结果】rTS-HN-Fiber2的鸡胚平均致死时间>168 h,且脑内接种致病指数为0,属于弱毒的范畴;在细胞上的生长曲线结果表明,rTS-HN-Fiber2与亲本LaSota株有相似的生长曲线,但最终的生长滴度略低于LaSota株;rTS-HN-Fiber2在56°C处理15 min后,病毒滴度下降约10^(3) TCID_(50)/mL,而LaSota株56°C处理5 min几乎无感染性;间接免疫荧光试验结果表明,rTS-HN-Fiber2能表达Fiber2蛋白。免疫和攻毒试验结果显示,rTS-HN-Fiber2能产生NDV抗体,且能显著提高雏鸡在FAdV-4强毒下的存活率,减轻FAdV-4强毒引起的组织病变,降低组织中的病毒载量。【结论】本研究成功构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV,该病毒保持了亲本LaSota株的弱毒生物学特性,但热稳定性有显著提升;重组NDV免疫雏鸡可产生针对NDV和FAdV-4强毒的保护,该重组NDV可作为开发针对FAdV-4和NDV二联基因工程疫苗的候选病毒株。

摘要： 为探寻伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)基因缺失株rPRV-bc-8基因组UL4-UL3基因间区域是否可作为外源基因的插入位点,在实验室已构建的含有增强型绿色荧光蛋白(Enhance Green fluorescent protein,EGFP)基因的转移质粒pMD-US6+7-EGFP-US2的基础上,通过DNA体外分子克隆技术将UL4序列替换左同源臂US6+7序列,UL3序列替换右同源臂US2序列,并将PolyA引入转移质粒,得到转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3。利用脂质体转染法将转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3与亲本毒rPRV-bc-8共转染PK-15细胞,经蚀斑纯化成功得到一株能够稳定表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。通过倒置荧光显微镜观察以及PCR鉴定确定EGFP基因已成功插入到伪狂犬基因组的UL4-UL3之间,并通过细胞传代试验分析得到重组毒的遗传稳定性良好。通过体外增殖试验分析得到重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在细胞内的增殖速度较快,接种后12 h内滴度始终高于亲本毒rPRV-bc-8,接种后40 h达到最高滴度108.3 TCID50/mL,与亲本毒的最高滴度接近,但是最高滴度的出现时间晚于亲本毒,并且在达到平台期后病毒滴度下降的比亲本毒快。通过对病毒培养液中荧光蛋白浓度进行测定,结果显示在接种后56 h时荧光蛋白浓度达到最高值4793.9 ng/mL,之后进入平台期。综上结果表明构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力,并且外源基因EGFP在此位点具有良好的表达效果,为进一步相关重组病毒的构建奠定了基础。

摘要： 为筛选与非洲猪瘟病毒(ASFV)引物解旋酶C962R互作的病毒蛋白,本研究将ASFV Pig/HLJ/2018株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后20 h内每间隔2 h收获细胞,通过荧光定量PCR检测C962R基因的动态转录水平。结果显示,ASFV感染PAM后6 h C962R基因的转录水平明显增加,18 h达峰值。经PCR扩增质粒pmCherry的mCherry基因、ASFV基因组中距C962R基因起始密码子41 bp(内含子部分)处上游约1000 bp的基因序列、距C962R N端约1000 bp的基因序列(该N端融合Strep标签)及C962R基因起始密码子上游的41 bp(内含子部分)基因序列后,构建重组质粒p3X-MCS-C962R-mCherry,并经双酶切鉴定正确后转染PAM,采用Pig/HLJ/2018株感染该PAM,48 h后分别收获上清液和细胞,采用PCR和western blot鉴定获得的重组病毒。结果显示,上清液中出现约1000 bp的包含mCherry和Strep标签的基因片段及PAM中出现100 ku的特异性条带,表明获得了融合表达C962R蛋白和Strep标签的重组ASFV(rC962R-mCherry)。将慢病毒包装质粒和辅助质粒共转染HEK 293T细胞,利用嘌呤霉素筛选融合表达C962R蛋白和Strep标签蛋白的细胞并经western blot鉴定。结果显示,细胞中出现100 ku的特异性条带,表明获得了表达ASFV C962R蛋白的细胞PK-15-C962R-Strep。分别将rC962R-mCherry感染PAM、ASFV Pig/HLJ/2018株感染PK-15-C962R-Strep,通过这两种感染方式经Strep pull-down试验检测C962R蛋白及筛选与其互作的病毒蛋白,并经质谱鉴定互作病毒蛋白的种类。采用PCR将Strep标签融合于筛选出的病毒蛋白编码基因的C端,分别克隆至pCAGGS载体,获得分别表达各病毒蛋白的重组质粒。将表达各病毒蛋白的重组质粒分别与表达C962R-Strep的重组质粒共转染HEK293T细胞,36 h后采用Co-IP试验进一步验证获得的与ASFV C962R蛋白互作的病毒蛋白。Strep pull-down试验结果显示,rC962R-mCherry感染的PAM细胞、ASFV Pig/HLJ/2018株感染的PK-15-962-Strep细胞中均出现100 ku的特异性条带。质谱鉴定结果显示,共筛选出3种病毒蛋白:A137R、K145R和K205R蛋白。Co-IP结果显示,IP样品中分别出现约16 bp、17 bp的特异性条带,对应为病毒的A137R和K145R蛋白。表明仅有A137R和K145R蛋白与C962R蛋白存在相互作用。本研究为以C962R蛋白为靶蛋白的新型抗ASFV药物及疫苗的研发提供实验依据。

摘要： 【目的】为探明引起禽白血病病毒K亚型(ALV-K)两不同毒株之间致瘤性差异的原因,进一步探索ALV-K的致病机理,实现两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救。【方法】以前期构建的ALV-K毒株HB2018003和HB2015032的感染性克隆为模板,PCR扩增分别获取两毒株单独的5′-端长末端重复序列(5′-LTR)基因片段和剩余目的基因片段。切胶回收目的片段后将两毒株的5′-LTR互换,通过同源重组的方法获得连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布Amp抗性平板过夜培养,挑取PCR鉴定为阳性的菌落提取重组质粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并送检测序。将PCR和测序鉴定正确的重组质粒转染至易感细胞DF-1中盲传3代,使用群特异性抗原P27 ELISA、多重PCR和间接免疫荧光等方法对拯救的病毒进行检测。【结果】测序和重组感染性克隆PCR鉴定的结果表明成功构建了5′-LTR互换的重组质粒,多重PCR结果显示在目的片段大小处出现ALV-K预期条带,未出现ALV-A和ALV-J条带,间接免疫荧光试验结果显示接种拯救病毒的DF-1细胞出现明显的亮绿荧光,阴性对照则没有出现荧光。综合以上结果,说明两株重组病毒拯救成功,并将其分别命名为rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。【结论】本研究采用同源重组的方法构建了5′-LTR互换的感染性克隆TOPO-003-032和TOPO-032-003,并成功拯救出病毒rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。

摘要： 为研究锚定蛋白基因(Ankyrin,ANK)对山羊痘病毒的影响,试验采用融合PCR和Overlap PCR技术扩增山羊痘病毒SS株5个ANK基因(ANK010、ANK138、ANK 140、ANK141.2和ANK145)两端侧翼序列和绿色荧光蛋白(GFP)基因,并将其产物连接Trans1-T 1载体构建ANK缺失的转移载体,经过菌液PCR以及质粒双酶切鉴定,阳性重组质粒用Lip 2000转染至已经感染羊痘病毒SS株的羊睾丸原代细胞,依报告基因GFP的表达情况在荧光显微镜下筛选目的基因缺失的重组病毒,同时设立不感染病毒的对照.结果 表明:通过融合PCR方法成功扩增山羊痘病毒SS株ANK基因010和138的两端侧翼序列及GFP基因片段,大小约1 200 bp;通过Overlap PCR方法成功得到ANK基因140、141.2和145基因的侧翼及GFP基因片段,大小约900 bp,与理论相符.研究成功构建了基因缺失转移载体,将其转染感染SS病毒的细胞中,5个ANK基因缺失的表达载体均可见绿色荧光斑点,说明得到各自基因缺失的重组羊痘病毒.

摘要： 为研究羊痘病毒宿主范围基因(Hrg)063的特性及生物学功能,采用overlap PCR技术将绿色荧光蛋白(GFP)基因与063基因两侧的同源臂连接起来,把扩增的目的基因插入到PEASY-T1克隆载体中,构建以GFP基因为报告基因的063基因缺失表达载体,并测序鉴定;用脂质体Lipofectamine 2000转染表达载体到羊痘病毒感染的羊睾丸原代细胞中,挑取荧光显微镜下表达为绿色荧光的063基因缺失的羊痘重组病毒,并传代纯化.成功的构建了Hrg 063缺失的表达载体(PEASY-Δ063-GFP),测序结果表明063基因的上下游同源臂与GFP报告基因大小约900 bp,与理论相符.转染后表达载体与羊痘病毒重组,得到了063基因缺失的山羊病毒SS株、TS株和疫苗株3个毒株重组病毒,但纯化时重组病毒不能正常传代.该研究中063基因缺失表达载体的构建为其生物学特性及功能的研究奠定了基础.

摘要： 人巨细胞病毒(HCMV)感染是常见的病毒性疾病,目前无有效的疫苗,故抗病毒药物筛选对HCMV的治疗具有重要意义.为了构建一种抗巨细胞病毒体外药物快速筛选模型,本研究以带有荧光素酶标签的鼠巨细胞病毒细菌人工染色体(Luc-MCMV-BAC)为基础,将其转染至小鼠成纤维细胞NIH-3T3,成功获得重组病毒Luc-MCMV,且其能够在细胞中稳定发光.噬斑法测定的病毒生长曲线显示,Luc-MCMV与野生型病毒Wt-MCMV具有相似的生长动力学,说明Luc-MCMV能够反映Wt-MCMV的生长状况,可用于后续抗病毒药物的筛选评价.进一步选用更昔洛韦(Ganciclovir)作为阳性对照药物,应用该体系对6种中药单体进行了筛选,结果显示黄芩素和黄芪甲苷具有抗MCMV活性,为抗HCMV药物的筛选奠定了前期基础.

摘要： 前期研究发现,随着病毒的不断传代,插入到鸭肠炎病毒(DEV)UL2基因中的报告基因绿色荧光蛋白(GFP)会发生点突变或缺失,严重影响了重组DEV的反向筛选.为筛选更加稳定的报告基因,通过酶切连接的方法以表达红色荧光蛋白(RFP)的表达盒取代重组质粒pT-UL2-GFP-gpt中的GFP-gpt表达盒,构建表达RFP的UL2基因缺失转移载体pT-UL2-RFP.该转移载体与DEV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)后,经克隆纯化获得表达RFP的重组DEV.通过测定重组病毒及其亲本毒的一步生长曲线及用PCR测定不同代次重组病毒的RFP序列发现,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在48 h和84 h达到峰值106.4 TCID50/0.1 mL和106.83 TCID50/0.1 mL,与亲本毒无明显差异(P>0.05);RFP表达盒在重组DEV连续传12代后仍可稳定表达,表明在DEV UL2区域插入RFP表达盒不影响病毒的繁殖,且RFP表达盒比GFP表达盒更适合作为报告基因.该研究结果对重组DEV的构建、筛选具有重要意义.

摘要： 伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒,含有多个复制非必需区,可以通过基因缺失研制弱毒疫苗,也可以通过异源基因的插入或替换构建活载体疫苗.目前构建重组PRV的技术方法包括传统同源重组技术、细菌人工染色体技术(BAC)、CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术.2011以来,一种毒力更强的变异株在我国暴发流行,应用变异株构建的基因缺失活疫苗(gE/gI、gE/TK或者TK/gE/gI)能对变异株提供完全的保护,为PRV在我国的净化和PRV变异株活载体疫苗的构建奠定了基础.研究发现以PRV基因缺失株为栽体,与其他病原的抗原编码基因共同构建重组病毒,能快速地诱导细胞免疫和体液免疫,达到一针多防的效果,应用前景广阔.适合的插入位点选择、外源基因高效表达和克服PRV母源抗体干扰等是提高活载体效果的关键.

摘要： 通过引入免疫增强因子GM-CSF,提高重组病毒的免疫原性.将牛GM-CSF克隆到pcDNA3.1载体中,构建GM-CSF基因表达盒;将tk基因上游同源臂、GM-CSF基因表达盒、tk基因下游同源臂克隆到pcDNA3.1载体中,得到转移载体pTK-GM-CSF.将亲本病毒BHV-1gG/TK/EGFP+基因组与转移载体pTK-GM-CSF采用磷酸钙法共转染MDBK细胞,得到重组病毒BHV-1gG/TK/GM-CSF+.并对重组病毒的生物学特性和对日本大耳白兔的免疫原性进行了评价.利用PCR和RT-PCR证实GM-CSF基因表达盒已正确插入重组病毒的tk基因位置,并具有转录活性.亲本株和重组株的空斑形态、空斑直径大小无明显差异;两者病毒滴度无明显变化,生长曲线相似;体外遗传稳定性良好.兔体实验表明在免疫早期重组毒株能产生较亲本株更高水平的IFNβ(P＜0.05).但中和抗体水平、攻毒后的临床症状及病毒排毒时间等各项指标检测表明,亲本株和重组毒株之间无明显差异.在免疫早期重组株刺激机体产生的IFN-β高于亲本株,具有一定的应用前景.

摘要： 目的：通过引入免疫增强因子GM-CSF,提高重组病毒的免疫原性。方法：将牛GM-CSF克隆到pcDNA3.1载体中,构建GM-CSF基因表达盒;将tk基因上游同源臂、GM-CSF基因表达盒、tk基因下游同源臂克隆到pcDNA3.1载体中,得到转移载体pTK-GM-CSF.将亲本病毒BHV-1gG–/TK–/EGFP+基因组与转移载体pTK-GM-CSF采用磷酸钙法共转染MDBK细胞,得到重组病毒BHV-1 gG–/TK–/GM-CSF+.并对重组病毒的生物学特性和对日本大耳白兔的免疫原性进行了评价。结果：利用PCR和RT-PCR证实GM-CSF基因表达盒已正确插入重组病毒的tk基因位置,并具有转录活性。亲本株和重组株的空斑形态、空斑直径大小无明显差异;两者病毒滴度无明显变化,生长曲线相似;体外遗传稳定性良好。兔体实验表明在免疫早期重组毒株能产生较亲本株更高水平的IFN-β(P＜0.05).但中和抗体水平、攻毒后的临床症状及病毒排毒时间等各项指标检测表明,亲本株和重组毒株之间无明显差异。结论：在免疫早期重组株刺激机体产生的IFN-β高于亲本株,具有一定的应用前景。

摘要： 2009年流感毒株H1N1易与其他亚型流感病毒发生重组,这有利于产生能够发生传播的病毒.目前在华东地区H9N2亚型禽流感正发生区域流行,并发生感染哺乳动物的情况.据报道具有H9N2的外部骨架和pH1N1内部骨架的重组病毒能够在豚鼠间发生气溶胶传播.此研究的目的是进一步定位影响病毒气溶胶传播的内部基因.为此重组一系列的病毒在豚鼠上进行气溶胶传播试验,初步发现pH1N1 CA04的内部基因NP,M,NS共同作用能够使重组的H9N2禽流感病毒产生气溶胶传播能力.

摘要： 为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒，本研究将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位区(第141—160位氨基酸)插入到PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端，利用感染性克隆技术拯救出一株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株，命名为recPCV2-CL-VP1。采用免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、捕获ELISA和免疫电镜鉴定该重组病毒。结果表明，在病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似，可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差，经细胞连续传10代，体外培养增殖性能稳定。本研究成功地构建了一株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒，为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。

摘要： 痘苗病毒具有广阔的克隆空间、广泛的宿主和细胞范围、可形成稳定的重组体等特点，而且相对毒力较弱、比较安全，广泛用于生物医药研究与开发。目的：获得一种新型痘苗病毒穿梭载体，并对其重组及表达功能进行验证，为新型基因工程活病毒载体疫苗的研制及生物技术药物研发奠定坚实基础。方法：本研究本着提升临床应用安全性、外源基因高效表达及多价疫苗研制的理念，设计、构建了一个痘苗病毒穿梭载体(pSTKE)，以痘苗病毒胸苷激酶基因(TK)作为筛选标记，包含三个独立的外源基因表达盒，启动子为痘苗病毒早晚期强力复合启动子(PE／L)，能够实现外源基因的全程表达。然后以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)和蓝色荧光蛋白(BFP)为报告基因，以中国天坛株痘苗病毒(VTT)为原始毒株，对每个表达盒的表达功能进行验证，并应用PCR、实时荧光定量PCR方法和Western blot对重组病毒的表达量和遗传稳性进行了检测。结果：设计构建的痘苗病毒穿梭载体的三个表达盒均具有高效的重组和表达能力，同时筛选获得两株重组痘苗病毒，重组病毒在20代内遗传稳定性良好，且TK基因20代内无回复突变，外源基因得到高效、稳定及持续表达。结论：获得一种高重组率、高效表达、遗传稳定性良好的痘苗病毒穿梭pSTKE，利用该载体构建的重组病毒可同时表达至少3种外源基因，且相互之间没有影响，可有效解决以往重组痘苗病毒安全性低、目的基因表达效率不高、目的基因表达周期不连贯和插入外源基因片段少等问题。

摘要： 目前防治茶尺蠖的方法主要是化学方法，但化学杀虫剂毒杀害虫的同时也毒杀其天敌并导致农药残留，而生物方法体现出独特的优越性。为了解决茶尺蠖饲养复杂而导致茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）繁殖困难，通过 Bac-to-Bac系统构建具有茶尺蠖核型多角体病毒解旋酶基因（hel）的重组家蚕核型多角体病毒（rBmNPV），使其具备BmNPV的polh基因表达盒和EoNPV的hel基因表达盒，经家蚕扩增后的rBmNPV感染茶尺蠖表明，已成功地将重组病毒的宿主域拓展至茶尺蠖，鉴定结果显示，重组BmNPV感染茶尺蠖后可以扩增。研究为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂奠定了基础。

摘要： 迄今为止，已有多种外源基因在伪狂犬活病毒载体中得到有效的表达，由本实验室所构建的PRV缺失株TK-/gE-/LacZ具有遗传背景清晰，病毒稳定性好等优点，并可以诱导有效的细胞免疫和体液免疫。FMDV的主要抗原位点位于FMDV的衣壳蛋白前体p1-2a上，同时该衣壳蛋白前提可以在FMDV的3C蛋白酶的切割、加工下最终组装成病毒空衣壳，诱导机体产生免疫反应，从而P12A3C基因作为FMDV的抗原基因可诱导较高的中和抗体。同时近年来一些学者的研究表明，泛素基因与靶抗原基因融合表达，可以将靶蛋白降解为小肽，而这种小肽在诱发特异性细胞免疫方面发挥着重要的作用，基于此，本研究将泛素基因(Ub)与O型口蹄疫的主要抗原基因P12A3C串联后插入表达载体PRV缺失株TK-gE-LacZ+，得到重组病毒TK-/gE-/UbOP12A3，并通过间接免疫荧光证实P12A3C基因得到表达，而Ub基因对该基因表达后的蛋白是否发挥了降解作用，有待进一步研究。

摘要： 趋化因子增加BBB通透性后，允许炎症细胞和其它免疫效应分子进人CNS清除狂犬病病毒，进而阻止狂犬病的发生。因此，增加BBB通透性和RABV特异性免疫应答均为阻止狂犬病发生所必需，表达趋化因子/细胞因子的重组狂犬病病毒不仅可用于狂犬病的暴露前和暴露后预防，还可用于狂犬病的临床治疗。

摘要： 趋化因子增加BBB通透性后，允许炎症细胞和其它免疫效应分子进人CNS清除狂犬病病毒，进而阻止狂犬病的发生。因此，增加BBB通透性和RABV特异性免疫应答均为阻止狂犬病发生所必需，表达趋化因子/细胞因子的重组狂犬病病毒不仅可用于狂犬病的暴露前和暴露后预防，还可用于狂犬病的临床治疗。

摘要： 趋化因子增加BBB通透性后，允许炎症细胞和其它免疫效应分子进人CNS清除狂犬病病毒，进而阻止狂犬病的发生。因此，增加BBB通透性和RABV特异性免疫应答均为阻止狂犬病发生所必需，表达趋化因子/细胞因子的重组狂犬病病毒不仅可用于狂犬病的暴露前和暴露后预防，还可用于狂犬病的临床治疗。

摘要： 本发明公开了重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用，所述重组溶瘤腺病毒载体的构建方法包括以下步骤：在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体；该方法构建出的重组溶瘤腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得重组溶瘤腺病毒，从而能够有效的识别并杀死多种恶性肿瘤的肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。

摘要： 本发明一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞，属于医学分子生物学领域。本发明的一种重组慢病毒载体，其特征在于：在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40Poly A序列，所述慢病毒载体为FG-12。本发明重组慢病毒的应用，如转染用于移植的干细胞，将使移植到患者体内的干细胞置于本发明重组慢病毒载体的启动子的监控之下，移植的干细胞一旦发生恶性转化，将立即启动重组慢病毒中自杀基因Apoptin的表达，使恶性转化的细胞凋亡而死。在临床使用中，本发明的重组慢病毒对转化干细胞起着即特异地起到预警、反应、示踪、清除的功能。

摘要： 本发明提供了含有编码狂犬病病毒抗原的插入DNA顺序的重组腺病毒DNA顺序和结合该DNA顺序的重组体腺病毒。;本发明还提供了含有有效量的重组体腺病毒和药物上可接受的赋形剂的疫苗和使哺乳动物对由狂犬病病毒诱发的疾病产生免疫能力的方法，包括将病毒或疫苗施用于哺乳动物。

摘要： 本发明公开了重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用，所述重组溶瘤腺病毒载体的构建方法包括以下步骤：在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体；该方法构建出的重组溶瘤腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得重组溶瘤腺病毒，从而能够有效的识别并杀死多种恶性肿瘤的肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。

摘要： 本发明“一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞”，属于医学分子生物学领域。本发明的一种重组慢病毒载体，其特征在于：在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40Poly A序列，所述慢病毒载体为FG-12。本发明重组慢病毒的应用，如转染用于移植的干细胞，将使移植到患者体内的干细胞置于本发明重组慢病毒载体的启动子的监控之下，移植的干细胞一旦发生恶性转化，将立即启动重组慢病毒中自杀基因Apoptin的表达，使恶性转化的细胞凋亡而死。在临床使用中，本发明的重组慢病毒对转化干细胞起着即特异地起到预警、反应、示踪、清除的功能。

摘要： 本发明提供一种重组O型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明通过对SVV/FJ/001株进行基因缺失突变改造，同时在SVA cDNA中融合进O型口蹄疫病毒的VP1基因，得到塞内卡重组病毒，该重组病毒能够表达融合进的外源FMDV VP1基因，且表达产物具有良好的反应原性；制备得到的疫苗株抗原产能高，致病性显著降低甚至对猪无致病性，灭活疫苗免疫动物后不仅能激发SVA的免疫应答，而且能产生针对融合基因的免疫活性，该疫苗株显著提高了生物安全性，可用于塞内卡病毒及一种或多种非塞内卡病毒的防控。

摘要： 本发明提供了一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明利用A型流感病毒八个基因片段为骨架包装出带有新型冠状病毒SARS‑CoV‑2表面刺突蛋白受体结合域（SARS‑CoV‑2_RBD）片段的重组流感病毒，此重组流感病毒可在复制过程中表达具有生物学活性和免疫原性的刺突蛋白受体结合区域RBD。本发明所述重组流感病毒rgH1N1（PR8）‑PA‑RBD可作为重组病毒类药物，用于2019新型冠状病毒肺炎（COVID‑19）的预防；也可作为体外SARS‑COV‑2 RBD等相关抗原表达和体内递呈系统。

摘要： 本发明提供一种重组O型口蹄疫病毒表位基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗及其制备方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明获得SVV/FJ/001株全长cDNA，并对其5'UTR进行缺失及突变改造，同时在SVA cDNA中融合进串联的O型FMDV的重组表位基因，构建得到重组口蹄疫抗原表位的塞内卡重组病毒，该重组病毒能够表达融合进的口蹄疫B细胞表位和T细胞表位，且表达产物具有良好的反应原性，重组病毒的致病性显著降低甚至对猪无致病性，显著提高了毒株的生物安全性；制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性，在有效激发SVA中和抗体的同时还能产生针对FMDV的特异性抗体，可用于塞内卡病毒及一种或多种非塞内卡病毒的防控。

摘要： 本发明提供一种重组A型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供了塞内卡病毒重组核酸、包含所述重组核酸的塞内卡重组病毒、包含所述塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株及其制备方法和应用。本发明对SVV/FJ/001株基因缺失突变改造，在其cDNA中融合进A型FMDV的VP1基因，得到塞内卡重组病毒，该重组病毒能够表达融合进的基因，且表达产物具有良好的反应原性；获得的疫苗株抗原产能高，致病性显著降低甚至对猪无致病性，灭活疫苗免疫动物后不仅能激发SVA的免疫应答，而且能产生针对融合基因的免疫活性，可用于塞内卡病毒及一种或多种非塞内卡病毒的防控。

摘要： 本发明涉及动物基因工程与动物病毒学技术领域，特别涉及重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗。本发明构建了高效表达猪蓝耳病病毒GP5蛋白的重组杆状病毒毒株BacSC-Dual-GP5，使其具有更好的免疫原性。本发明重组毒株所表达的重组蛋白除去融合部分，其产物表达产量非常高。用研制的PRRSV-GP5亚单位疫苗制品对本动物是安全的。疫苗免疫效力试验结果表明，所有疫苗免疫后28天抗体检测全部转阳；强毒攻击试验结果表明，1ml和2ml免疫组均获得100％保护，0.5ml组获得80％(4/5)保护。b pnum="1" />