反向遗传

摘要： H3N2犬流感病毒(H3N2 CIV)是流感病毒在进化过程中新形成的一个分支,在我国多地的犬中广泛流行。PB1-F2蛋白是甲型流感病毒的毒力因子,并可能与流感病毒的跨宿主传播相关。为探究PB1-F2长度的改变对H3N2 CIV的影响,本研究分别构建了包含H3N2 CIV各基因节段的重组质粒及携带M1R(PB1-F2的aa1由M突变为R)及S^(11)Stop(PB1-F2 aa11由S突变为终止氨基酸序列)突变的重组质粒pHW-PB1-F2-M1R和pHW-PB1-F2-S^(11)Stop,并均经测序鉴定。通过反向遗传操作技术,分别拯救了如下3株重组病毒:表达90个氨基酸PB1-F2的重组亲本病毒rH3N2;不表达PB1-F2的重组病毒rH3N2-M1R;仅表达11个氨基酸PB1-F2的重组病毒rH3N2-S^(11)Stop。将这3株重组病毒利用MDCK细胞传代后分别对其8个基因节段经PCR扩增及测序以鉴定其遗传稳定性。测序鉴定结果显示,3株重组病毒均正确构建,且不同代次之间各重组病毒的基因序列及各突变位点均相同,表明本研究构建的重组病毒具有较好的遗传稳定性。将表达PB1、PB1-F2-M1R及PB1-F2-S^(11)Stop的重组质粒分别与重组质粒PB2、PA和荧光素酶报告质粒pPolI-Luci-NP及海肾荧光素酶表达质粒共转染293T细胞,48 h后利用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性并比较3株重组病毒的聚合酶活性;测定3株重组病毒感染MDCK细胞后不同时间的TCID50以绘制病毒的生长曲线;将3株重组病毒均以106TCID50/50μL经鼻腔感染小鼠,分析各重组病毒对小鼠的致病性。用以评价PB1-F2长度改变对H3N2 CIV的影响。结果显示,rH3N2-S^(11)Stop的聚合酶活性与rH3N2相比无明显变化,而rH3N2-M1R的聚合酶活性则显著高于rH3N2(P<0.05);rH3N2-M1R和rH3N2-S^(11)Stop在MDCK细胞中的复制效率显著高于rH3N2(P<0.05),且rH3N2-M1R的复制效率要高于rH3N2-S^(11)Stop。小鼠的致病性试验结果显示,感染重组病毒后的小鼠表现被毛粗乱、精神不振、食欲减退等症状;3株重组病毒均对小鼠体质量有轻微影响,并对小鼠肺脏均造成了轻微病理损伤,但三者对小鼠体质量及肺脏的影响差别不明显。本实验结果首次证实,PB1-F2的不表达能够提高H3N2 CIV的转录效果,且PB1-F2长度的改变能够提高H3N2 CIV在细胞中的复制效率,但对病毒在小鼠中致病性的影响较小。本研究初步探究了PB1-F2长度的改变对H3N2 CIV的影响,为该病毒致病机制及其感染防控技术的研究与制定提供了参考依据。

摘要： 筛选和鉴定功能基因是研究各种生物学表型发生分子机制的关键步骤,也是人类后基因组时代主要研究内容之一。传统遗传学、全基因组关联分析、表达谱差异、基因组测序、生物信息学等基于正向遗传学的筛选方法和cDNA文库、RNA干扰、CRISPR/Cas9技术、插入突变、模式生物等基于反向遗传学的筛选策略已被应用于筛选和鉴定功能基因,各种技术方法均具备各自的优势和缺陷,但可相互结合使用,发挥各自优点。

摘要： H9N2亚型禽流感病毒NA基因vRNA 5′端的多聚腺苷酸化信号位点具有多样性,突变发生时,该位点失去与聚合酶的结合能力或结合能力减弱,阻碍多聚腺苷酸化过程,影响病毒mRNA的转录过程。为探究H9N2亚型禽流感病毒NA基因5′端多聚腺苷酸化信号位点处5个或6个连续的尿嘧啶(U_(5)或U_(6))碱基对病毒生物学特性的影响,以一株四川分离株A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)为骨架的反向遗传系统构建突变株。结果显示,含U_(5)的H9N2突变株(rCQYU_(5)-H9N2)的血凝效价、TCID_(50)和EID_(50)滴度均高于含U_(5)的H9N2突变株(rCQYU6-H9N2),但生长曲线无显著差异,表明H9N2 NA基因5′端多聚腺苷酸化信号位点U_(5)或U_(6)结构均不影响病毒的拯救,但U_(5)有助于提高病毒在鸡胚与细胞中的复制滴度。本实验研究结果可为H9N2亚型禽流感病毒的复制机理等研究提供参考。

摘要： 为探究狂犬病毒P和M基因对其生物学特性的影响,本研究以弱毒疫苗株rRC-HL为骨架,利用反向遗传技术将广西街毒株GX01和GX074的P和M基因分别组合替换rRC-HL株相应的基因进行联合突变,拯救获得重组突变体,应用间接免疫荧光实验和RT-PCR对重组突变体鉴定,测定多步生长曲线将亲本弱毒株和重组突变体进行生长特性的比较。结果显示,重组突变体rRC-HL(01P-074M)、rRC-HL(074P-01M)与亲本弱毒株rRC-HL在BSR/T7-9细胞中生长趋势较为相似,但在24、48、96h的病毒滴度均低于亲本毒株;与亲本强毒株CX01、GX074及标准强毒株CVS-11比较,重组突变体病毒滴度明显增高,说明狂犬病毒P和M基因影响病毒的复制。

摘要： 新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是最重要的禽病毒病原体之一,在全球家禽业中造成巨大的经济损失。该病毒具有高度遗传多样性,根据最近提出的NDV分类标准,目前有20多种独特的基因型。NDV常被用作重要的疫苗载体,用于开发针对特定病原体的二价疫苗,在实际中NDV载体比常规的全病毒疫苗更安全、更有效。另外,在这篇综述中还列举了NDV作为抗多种家畜经济上重要病毒的疫苗的潜力,以及探讨NDV载体疫苗的一些发展以及此类疫苗在兽医和人医中的潜在用途。

摘要： 细小病毒感染的动物宿主广泛,包括猫科、犬科、猪科、牛科、鸭科和鼬科等动物,是动物的一种重要病原.病毒反向遗传学技术是在获得病毒全基因组序列的基础上,构建感染性克隆,通过DNA重组、定点突变、插入、缺失等遗传修饰手段创造突变体,并研究突变体所造成的表型效应,从而研究基因的生物学功能.论文对ssDNA细小病毒反向遗传学技术的研究进行综述,为细小病毒同科病毒反向遗传学操作平台的建立提供参考.

摘要： [背景]蓝舌病病毒(Bluetongue Virus,BTV)是一种侵染反刍动物的虫媒病毒,基因重配可引起病毒的快速变异.[目的]通过我国强致病性BTV-16型毒株与弱致病性BTV-4型毒株间Seg-2与Seg-6基因节段的重配,探讨病毒基因重配与表型变异之间的关系.[方法]采用全长cDNA扩增与高通量测序获取BTV-16/V158的全基因组序列,构建病毒的真核表达质粒,通过免疫荧光与Western Blot检测目的蛋白表达;通过RT-PCR、体外转录与细胞转染等方法建立BTV反向遗传体系并获取基因重配病毒;通过蚀斑分析、增殖曲线分析与血清中和试验,比较亲本毒株与基因重配病毒在生物学特性上的差异.[结果]获取的BTV-16/V158毒株基因组大小为19 186bp,与中国和印度BTV-16型毒株具有最近的亲缘关系;将表达BTVVP1、VP3与NS2的真核表达质粒转染细胞,检测到目的蛋白的表达;将BTV的7种真核表达质粒与基因组ssRNA共转染BHK-21细胞,成功拯救出与亲本毒株生物学特性一致的病毒;将BTV-16/V158毒株的Seg-2与Seg-6替换为BTV-4/YTS4毒株的对应基因节段,拯救出基因重配病毒BTV-16/V158-RG(BTV-4/S2,S6);与亲本病毒相比较,基因重配病毒在BHK-21细胞上形成的蚀斑变小,增殖能力减弱,血清型由BTV-16型转化为BTV-4型.[结论]建立了我国流行BTV-16型毒株的反向遗传体系,BTV Seg-2与Seg-6的基因重配可引起病毒在细胞上增殖能力的改变与血清型改变.研究结果为BTV基因重配致病毒变异与新型基因工程疫苗的研究提供了基础.

摘要： 目的:利用反向遗传操作技术,构建新城疫病毒基因Ⅶ NP、P和L3个辅助质粒,为新城疫病毒基因Ⅶ反向遗传的拯救提供基础。方法:提取尿囊液病毒RNA,利用RT-PCR技术,分别扩增NP、P和L片段,并连接至克隆栽体,通过电泳、酶切验证以及测序后连接至辅助质粒载体pCI-neo。结果成功获取NP、P和L3个目的基因,测序结果与预期一致;成功构建pCI-NP、pCI-P和pCI-L3个辅助质粒。结论:本文成功构建的3条辅助质粒为后期NDV Ⅶ反向遗传的构建提供基础。

摘要： 目的研制一种可同时预防棘球蚴病与狂犬病的重组活载体疫苗。方法利用反向遗传技术,将细粒棘球蚴Eg95基因ORF区插入狂犬病病毒弱毒SAD株基因组的假基因区,得到全长感染性克隆,与辅助质粒共转染BHK-21细胞,拯救获得重组狂犬病病毒SAD-EG95株。结果重组病毒SAD-EG95株经RT-PCR与免疫荧光鉴定,表明重组病毒基因组中包含细粒棘球蚴Eg95基因,且能表达EG95蛋白。该重组病毒能在BHK-21和NA细胞中复制,病毒生长曲线与亲本株SAD差异较小,且传代稳定性良好,能在小鼠模型中诱导产生狂犬病病毒和细粒棘球蚴特异性保护抗体。结论成功构建表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组狂犬病病毒,为进一步研制预防狂犬病和细粒棘球蚴的二联疫苗奠定了基础。

摘要： 反向遗传操作系统的建立为RNA病毒的研究提供了一个强大的工具。该技术从上世纪90年代开始被应用于牛病毒性腹泻病毒研究工作，此后该病毒的分子生物学研究取得了长足的进展。本文综述了反向遗传操作在牛病毒性腹泻病毒上的建立过程以及该技术在病毒生物型形成、病毒复制和病毒蛋白功能等研究上的应用及进展。

摘要： @@近年来，BAC分子克隆化病毒在现代疫苗的研究和应用仍处于活跃的探索阶段，其表现出来的优势令人鼓舞。BAC系统以其容量大(可至数Mb)，能够稳定遗传且易于操作的载体系统巨大优势，成为众多分子生物学工作者实现对大基因组病毒进行基因操作的首选载体系统。目前，以BAC系统为基础的疱疹病毒反向遗传技术平台，BAC载体容纳了数百kb的全基因组疱疹病毒基因组，利用现代最先进的快速基因操作技术(Red/ET和Cre/loxP重组技术），成为疱疹病毒反向遗传操作的主流技术。

摘要： 构建的口蹄疫病毒(FMDV)基因组全长cDNA克隆，置于T7启动子下游，与表达T7RNA聚合酶的真核质粒共转染BHK-21细胞，能顺利稳定的拯救获得病毒。拯救的病毒和野生型口蹄疫病毒一样，对酸敏感，当pH值低于7.0时，完整的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。昆虫细胞的正常pH值偏酸，低于7.0，很难利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳结构。采用定点突变改变了Asia1型口蹄疫病毒结构蛋白的2个氨基酸。将改造和未改造的P12A基因和3C基因分组插入带双启动子的杆状病毒转移载体中，经重组获得了两株携带目的基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染HighFiveTM细胞，表达了目的蛋白。电镜观察到改造的P12A基因重组杆状病毒产生了直径为25nm～30nm的类似口蹄疫病毒粒子的空衣壳结构，而未改造的P12A基因重组杆状病毒未能观察到同等大小的衣壳结构。本研究建立了稳定的口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台，首次在昆虫细胞中组装成了FMDV完整的空衣壳结构。

摘要： 尽管鹅源新城疫自1997年以来就在我国许多省市流行和发生，但至今还未发现自然鹅源弱毒株用于防治，因此为研究鹅源新城疫的基因组功能及其减毒机理，本文针对鹅源新城疫病毒NA-1株人工构建其感染性克隆，并在此基础上研究新型弱毒疫苗，从而为有效控制本病的流行及我国养鹅业的健康发展提供技术支撑。

摘要： 利用反向遗传学操作技术，以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株，采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增，通过与双向转录载体pHW2000连接，转染293T和MDCK共培养细胞，成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)的猪流感病毒，生物学实验结果表明该拯救毒株在鸡胚半数感染量，组织培养半数感染量，稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。拯救的H3N2亚型猪流感病毒经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1:256，在接种MDCK60h后，血凝价可达到1:64。H3N2亚型猪流感病毒的拯救成功，为研究流感病毒突破种间屏障分子机制和猪流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

摘要： 利用反向遗传学操作技术，以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株，采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增，通过与双向转录载体pHW2000连接，转染293T和MDCK共培养细胞，成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)的猪流感病毒，生物学实验结果表明该拯救毒株在鸡胚半数感染量，组织培养半数感染量，稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。拯救的H3N2亚型猪流感病毒经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1:256，在接种MDCK60h后，血凝价可达到1:64。H3N2亚型猪流感病毒的拯救成功，为研究流感病毒突破种间屏障分子机制和猪流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

摘要： 为了获得狂犬病毒和犬细小病毒的二联疫苗，本研究运用分子生物学技术在狂犬病毒基因组G与L基因间插入犬细小病毒的VP2基因，再通过反向遗传操作系统拯救获得含VP2基因的重组病毒狂犬病毒HEP-VP2，并对该病毒生物学特性进行研究。结果表明，重组病毒在BHK-21细胞能稳定繁殖，传代10次，外源基因均能获得高效表达；以该病毒作为免疫原免疫小鼠，能引导机体产生抗狂犬病毒和犬细小病毒的抗体。

摘要： 本研究在狂犬病毒弱毒株HEP-Flury株全基因组3'-N-P-M-G-L5'的伪基因区域(G与L之间)，插入一个G基因，构建了携带双G基因的全长感染性克隆，其与辅助质粒共转染BHK-21细胞，成功获得狂犬病毒HEP-dG嵌合病毒，盲传十代，用荧光抗体和RT-PCR鉴定，该嵌合病毒在BHK一21细胞中稳定生长;狂犬病毒Hep-Flury株是日本等多个国家使用的常规疫苗株，在控制上述国家的狂犬病疫情中发挥了重要的作用该毒株经驯化后，已完全适应BHK-21细胞，能在该细胞上大量稳定增殖。在BHK-21细胞中培养4d，病毒滴度可达1.O×108～1.O×1109FFU／0.1mL，比亲代毒株Hep-Flury及其它狂犬病毒株高100-1000倍。以Hep－Flury株为基础改造的新型狂犬病毒Hep－dG株，具有更好的免疫原性。以该毒株制成的油乳剂灭活疫苗，分别免疫小鼠和犬，均能在免疫后14d产生高水平的中和抗体，与同类进口狂犬病灭活疫苗相比，抗体水平高1倍多。经改造后。该毒株的毒力比亲代株还弱，仅能引起未成年小鼠发病死亡，对成鼠无致病性;结果表明Hep-dG株和rHey－Flury株比较，其致病性降低、免疫原性提高;因此，该研究为开发新型基因工程疫苗奠定了基础。

摘要： 本研究在狂犬病毒弱毒株HEP-Flury株全基因组3'-N-P-M-G-L5'的伪基因区域(G与L之间)，插入一个G基因，构建了携带双G基因的全长感染性克隆，其与辅助质粒共转染BHK-21细胞，成功获得狂犬病毒HEP-dG嵌合病毒，盲传十代，用荧光抗体和RT-PCR鉴定，该嵌合病毒在BHK一21细胞中稳定生长;狂犬病毒Hep-Flury株是日本等多个国家使用的常规疫苗株，在控制上述国家的狂犬病疫情中发挥了重要的作用该毒株经驯化后，已完全适应BHK-21细胞，能在该细胞上大量稳定增殖。在BHK-21细胞中培养4d，病毒滴度可达1.O×108～1.O×1109FFU／0.1mL，比亲代毒株Hep-Flury及其它狂犬病毒株高100-1000倍。以Hep－Flury株为基础改造的新型狂犬病毒Hep－dG株，具有更好的免疫原性。以该毒株制成的油乳剂灭活疫苗，分别免疫小鼠和犬，均能在免疫后14d产生高水平的中和抗体，与同类进口狂犬病灭活疫苗相比，抗体水平高1倍多。经改造后。该毒株的毒力比亲代株还弱，仅能引起未成年小鼠发病死亡，对成鼠无致病性;结果表明Hep-dG株和rHey－Flury株比较，其致病性降低、免疫原性提高;因此，该研究为开发新型基因工程疫苗奠定了基础。

摘要： 本研究在狂犬病毒弱毒株HEP-Flury株全基因组3'-N-P-M-G-L5'的伪基因区域(G与L之间)，插入一个G基因，构建了携带双G基因的全长感染性克隆，其与辅助质粒共转染BHK-21细胞，成功获得狂犬病毒HEP-dG嵌合病毒，盲传十代，用荧光抗体和RT-PCR鉴定，该嵌合病毒在BHK一21细胞中稳定生长;狂犬病毒Hep-Flury株是日本等多个国家使用的常规疫苗株，在控制上述国家的狂犬病疫情中发挥了重要的作用该毒株经驯化后，已完全适应BHK-21细胞，能在该细胞上大量稳定增殖。在BHK-21细胞中培养4d，病毒滴度可达1.O×108～1.O×1109FFU／0.1mL，比亲代毒株Hep-Flury及其它狂犬病毒株高100-1000倍。以Hep－Flury株为基础改造的新型狂犬病毒Hep－dG株，具有更好的免疫原性。以该毒株制成的油乳剂灭活疫苗，分别免疫小鼠和犬，均能在免疫后14d产生高水平的中和抗体，与同类进口狂犬病灭活疫苗相比，抗体水平高1倍多。经改造后。该毒株的毒力比亲代株还弱，仅能引起未成年小鼠发病死亡，对成鼠无致病性;结果表明Hep-dG株和rHey－Flury株比较，其致病性降低、免疫原性提高;因此，该研究为开发新型基因工程疫苗奠定了基础。

摘要： 本发明提供了一种基于反向搜索和遗传算法的电路划分方法，包括：对电路门级网表进行建模；从MIMO门级电路的输出端口进行反向搜索并记录每次搜索到的结果，根据反向搜索结果进行初始划分，将MIMO门级电路划分为数量与输出端口数量相同的MISO系统；基于遗传算法对MISO系统进行组合、合并、优化，将符合要求的初始划分的MISO系统进行并集运算，得到期望的划分块数m；将电路划分的m块输出为电路门级网表，并分别加载到仿真器；杜绝了并行仿真中各仿真器之间的通信，对门级电路的各个逻辑门电路赋予权重，基于权重判断划分结果的负载均衡，使得电路划分的结果更加合理，实现了通信量为零且负载均衡。

摘要： 本发明公开了一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗传系统，包括：包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株全基因组cDNA的重组表达载体，其中ORF3区被替换为GLuc报告基因；包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株N基因的辅助质粒，所述猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株的全基因组序列GenBank号为KU558701.1。本发明构建的感染性克隆带有GLuc报告基因，拯救的重组病毒在感染动物和细胞时会产生分泌型Gaussia荧光素酶，非常易于检测，在病毒毒力分析等实验研究方面有很强的应用价值。同时，由于ORF3区被替换为GLuc报告基因，本系统拯救的重组病毒可制成新型标记疫苗，通过检测猪血清中是否有Gaussia荧光素酶，快速区别疫苗株免疫和野毒株感染，实用价值很高。

摘要： 本发明属于水生动物病毒基因工程技术领域，具体涉及一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒（red‑spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV）反向遗传系统的方法。本发明以CMV为启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，采用高转染效率的人胚肾293T细胞和对RGNNV高效复制的条纹月鳢细胞（striped snakehead cell,SSN‑1）组合的方法来拯救RGNNV，克服了鱼类细胞转染效率低的问题。

摘要： 本发明属于反向遗传学技术领域，具体涉及一种基于双启动子拯救猪塞尼卡病毒的反向遗传操作系统及其建立方法。本发明分别通过构建SVA通用型反向载体和SVA全基因组重组反向载体，然后基于T7 RNA聚合酶和RNA聚合酶II双转录系统，利用无缝克隆和重叠PCR技术，并在病毒序列两端引入HamRz和HDVRz序列，建立的高效精确的通用型SVA反向遗传操作系统。该操作系统能够高效精确的实现猪塞尼卡病毒的拯救，获得的重组毒株均未发生突变，遗传稳定性好。

摘要： 本发明公开了一种蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)的反向遗传方法和应用。本发明将辅助质粒和蓝舌病病毒PCR产物分两次转染BHK‑21细胞从而拯救病毒。本发明的蓝舌病病毒反向遗传拯救方法可用于BTV的致病机制研究、免疫机制研究以及重组疫苗的制备。

摘要： 本发明公开了一种猪非典型瘟病毒GD2株反向遗传操作系统及其建立方法和应用。该系统包括重组质粒1和重组质粒2，重组质粒1是将SEQ ID NO：1所示的由启动子序列和猪非典型瘟病毒GD2株基因组全长cDNA序列的5’半长片段依次连接组成的序列克隆到载体中构建得到；重组质粒2是将SEQ ID NO：2所示的由猪非典型瘟病毒GD2株基因组全长cDNA序列的3’半长片段和酶切位点序列依次连接组成的序列克隆到载体中构建得到。本研究的猪非典型瘟病毒GD2株反向遗传操作系统的建立，为研究猪非典型瘟病毒的复制、组装、入侵机制和致病机理等提供了研究基础，为进一步开展疫苗的研制和病毒载体相关基础研究提供了可行的技术平台。

摘要： 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法。本发明通过敲除质粒同源重组、插入回补质粒以及环出敲除质粒三步法方案来构建基于自杀质粒的细菌必需基因的缺失突变菌株。利用该方法，以铜绿假单胞菌PA0006基因作为目的基因，团队详细研究了假单胞菌必需基因PA0006的功能与抑制分析，结合显微观察、免疫印迹、转录组测序与DNA重测序等技术发现PA0006在细胞形态和脂多糖核心寡糖的生物合成中发挥着调节作用。PA0006基因也是开发治疗和预防铜绿假单胞菌引起疾病的新药靶标。与现有技术对比，本发明简单、快速、有效，方法可广泛应用于细菌必需基因的表型和抑制分析。

摘要： 本发明涉及一种小反刍兽疫强毒的反向遗传系统，一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的重组拯救病毒(rPPRV)(还有一种表达GFP的示踪重组小反刍兽疫强毒)。以及一种rPPRV动物感染模型，采用重组拯救病毒rPPRV对反刍兽进行攻毒。通过联合采用滴鼻和皮下注射两种途径对反刍兽进行攻毒，成功获得了小反刍兽疫的动物感染模型，为小反刍兽疫的疫苗研制、致病机制等研究奠定了基础。

摘要： 本申请提供了一种猫杯状病毒反向遗传平台及其构建方法，将猫杯状病毒DL19株基因组分为两段连接到改造好的pBluescript II SK(+)载体，构建了可作为反向遗传平台猫杯状病毒DL19株全长感染性克隆质粒，为后续病毒拯救、基因组结构研究奠定基础。

摘要： 本发明公开了一种基于转录调控序列重布的反向遗传操作方法及其应用，其中，所述方法为根据HuN4‑F112感染性克隆全长测序以及转录调控前导序列（Leader TRS），下游转录调控序列(body TRSs)一级核心6碱基序列的鉴定，将HuN4‑F112全基因组设计为分别包含Leader TRS,Body TRSs在内的六段基因组序列，分别设计用于Leader TRS,Body TRSs核心6碱基序列C5C6定点突变的引物，获得全基因组转录调控序列整体突变的基因组片段。该TRS circuit突变PRRS弱毒疫苗株能够有效抵抗自然环境中普遍发生的基因组间重组现象，对临床上PRRS的有效防控有重要意义。