昆虫细胞

摘要： 目的探索利用昆虫杆状病毒表达系统(IBEVS)表达的重组人乳头瘤病毒(HPV)58型主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒(VLP)的简单可行的层析分离方法。方法收集高水平表达HPV-58 L1的昆虫细胞并制备裂解上清,建立硫酸铵沉淀(ASP)联合层析法纯化L1蛋白的最佳条件,对纯化后的蛋白进行体外组装。对L1蛋白的纯化各个阶段中的组分、最终产品(纯品蛋白)及组装状态进行理化性质鉴定,分析其免疫原性。结果30%饱和硫酸铵(AS)分级分离后,L1蛋白得率为72%,纯度为9.34%;阴离子交换层析经300 mmol/L NaCl缓冲液洗脱后,L1蛋白得率>90%,纯度为13.6%;进一步经羟基磷灰石层析收获流穿液后,L1蛋白得率>80%,宿主蛋白质残留(HCPs)分析和L1蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示蛋白纯度>99%。经上述3步分离纯化的L1蛋白,其总得率为55.7%,每升细胞悬浮培养液(约3.0×10^(9)个细胞)产量为57~65 mg。动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)分析显示,L1蛋白组装成了形状均一、直径约55 nm的VLPs。该法制备HPV-58 L1 VLPs诱导小鼠免疫系统产生的中和抗体水平与超离法制备的相当。结论本研究所建立的HPV58-L1 VLPs分离纯化方法是一套具有蛋白得率高、活性好,且操作简单等特点的成熟方案,为利用IBEVS生产成本低的HPV多价预防性疫苗奠定基础。

摘要： 重组新型冠状病毒疫苗(Sf9细胞)研发由魏于全院士团队研发的重组蛋白新型冠状病毒肺炎疫苗(Sf9细胞),基于结构生物学的精准设计,靶向新型冠状病毒与人体细胞的结合部位,利用昆虫细胞在培养液中大量繁殖,将新冠病毒的基因引入昆虫细胞,生产出高质量的重组疫苗蛋白。该研发成果2020年2月获批临床试验后,以5.1亿元作价投资入股成立了成都威斯克生物医药有限公司。目前,该疫苗的I期临床试验正在中国、日本、尼泊尔、肯尼亚、印度尼西亚、巴林、白俄罗斯、乌兹别克斯坦、墨西哥同步开展。

摘要： 美国FDA于2022年7月13日批准Novavax公司(Novavax Inc.)研发的Novavax新冠佐剂疫苗(Novavax COVID-19 Vaccine,Adjuvanted)用于18岁以及以上年龄人群预防新冠肺炎。Novavax新冠佐剂疫苗需接种两剂次,两次接种的间隔时间为3周。该疫苗含有新冠病毒刺突蛋白和基质蛋白(Matrix-M)佐剂。该疫苗的刺突蛋白在昆虫细胞中制成,而基质蛋白佐剂含有原产于智利的皂树皮成分皂苷提取物。

摘要： 为了表达具有反应原性的N9亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,本研究将DK/HuN/S11670/2015(H11N9)株NA基因克隆至杆状病毒转移载体中,构建重组转移载体pFastBacHT A-N9并经PCR和测序鉴定后转化DH10Bac感受态细胞,经PCR鉴定获得了重组杆粒rBacmid-N9,转染昆虫细胞sf21获得重组杆状病毒rBaculovirus-N9。将获得的P3代重组杆状病毒感染sf21细胞后经间接免疫荧光试验(IFA)检测N9蛋白的表达和定位,采用western blot鉴定N9蛋白的反应原性。将杆状病毒表达的重组N9蛋白包被ELISA酶标板,初步建立间接ELISA方法,利用该方法分别检测N9蛋白抗体阳性鸡血清和阴性鸡血清。IFA和western blot结果显示,N9蛋白正确表达且主要锚定在细胞膜上,表达的N9蛋白可以与鼠源N9蛋白单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA方法结果显示,初步建立的间接ELISA方法可以检测鸡血清中的N9抗体。上述结果表明,经杆状病毒—昆虫细胞表达的N9蛋白具有良好的反应原性,为N9 AIV检测试剂盒的研发奠定了基础。

摘要： 为对微小牛蜱烯醇酶(Enolase)基因进行真核表达及免疫反应原性分析,本研究采用RT-PCR方法扩增微小牛蜱Enolase基因的开放阅读框(ORF)序列,将其克隆至pFastBac 1载体中构建重组质粒pFastBac1-Enolase,随后转化至大肠杆菌DH10Bac细胞中制备了重组杆粒Bacmid-Enolase,转染至SF9细胞以获得重组Enolase蛋白.通过双酶切、PCR及测序鉴定显示Enolase基因正确插入.利用SDS-PAGE分析表达产物,结果显示目的蛋白大小约为48 ku.利用western blot对重组蛋白进行分析,结果表明目的蛋白能被微小牛蜱抗原免疫兔阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性.凝血酶时间(TT)的测定结果显示,Enolase重组蛋白能显著延长TT,具有抗凝血活性.本研究首次采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对微小牛蜱Enolase基因进行真核表达,并鉴定了重组蛋白的免疫反应原性,为开展Enolase免疫原性分析及功能研究奠定了基础.

摘要： 目的 构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒,利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2,PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究.方法 基于粉纹夜蛾细胞(High5)密码子偏好性,将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化,并对P1基因进行稳定性突变,构建突变型rBac-PV2-P1 s-3 CD和野生型rBac-PV2-P1-3 CD杆状病毒.Western blot分别检测目的 蛋白表达量,离子交换层析纯化PV2-VLP,透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率.免疫大鼠评估免疫原性.结果 成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒.Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高.电镜观察发现直径约30 nm的三维结构,表明VLP成功组装.动物实验结果表明,重组制备的PV2-VLP具有免疫原性,且能有效刺激产生中和抗体.结论 用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗,为PV-VLP疫苗的研制提供参考.

摘要： 将蜂毒素信号肽、全长鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白、流感病毒HA跨膜区序列和胞内区序列融合制备成嵌合鞭毛蛋白,对其氨基酸序列和核苷酸进行理化特征、疏水性、二级结构、三级结构及稀有密码子特征展开分析,并进一步制备表达目的基因的重组杆状病毒。实验结果表明嵌合鞭毛蛋白可以在昆虫细胞内表达。

摘要： 将蜂毒素信号肽、全长鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白、流感病毒HA跨膜区序列和胞内区序列融合制备成嵌合鞭毛蛋白,对其氨基酸序列和核苷酸进行理化特征、疏水性、二级结构、三级结构及稀有密码子特征展开分析,并进一步制备表达目的基因的重组杆状病毒。实验结果表明嵌合鞭毛蛋白可以在昆虫细胞内表达。

摘要： 为了获得具有天然构象且反应原性良好的猪δ冠状病毒((PDCoV))受体结合域(RBD)蛋白,根据PDCoV流行株CC-HN2K-02株S蛋白编码序列,筛选、设计、优化并合成其RBD段DNA序列,将其亚克隆至杆状病毒双表达载体pFastBac^(TM) Dual上,获得pFBD-PDR重组质粒。将该重组质粒转化到DH10Bac^(TM)大肠杆菌感受态细胞中,进行2轮蓝白斑筛选并进行PCR鉴定获得阳性重组杆状质粒Bacmid-PDR;通过脂质体转染SF9细胞进行病毒拯救,出现明显病变后收取上清,并在正常SF9细胞中盲传3代,获得的杆状病毒命名为rBV-PDR。利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测rBV-PDR感染昆虫细胞后的蛋白表达情况。结果:重组质粒pFBD-PDR酶切验证正确,重组杆粒Bacmid-PDR构建成功,杆状病毒中能够表达PDR蛋白且能与Sterp-tag抗体发生特异性结合,IFA鉴定出特异性红色荧光,表明本试验成功表达了PDCoV-RBD蛋白,为深入开展PDCoV抗体的制备、新型疫苗、诊断试剂研发奠定了基础。

摘要： 昆虫杆状病毒表达载体系统是基于昆虫杆状病毒及其宿主细胞建立的真核表达体系,具有安全性高、重组蛋白表达水平高、能同时表达多个基因,可对重组蛋白进行正确折叠和翻译后修饰等优势,主要应用于预防性及治疗性疫苗和基因治疗药物的研发及生产.本文对该载体系统的关键技术及应用进展作一综述.

摘要： 通过PCR方法扩增完整的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因,随后将其克隆到Bac—to—Bac杆状病毒表达系统pFastBacTM HT B载体中,获得重组转移载体pFast—ORF2,再将其转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞中,发生转座反应,通过抗性蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组穿梭质粒rBacmid—Cap,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,PCR能够扩增出相应大小的片段,间接免疫荧光分析表明ORF2基因编码蛋白能在sf9细胞中获得表达,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗奠定了基础.

摘要： 为了获得更接近天然蛋白的表达产物,进一步分析镰形扇头蜱IGBP的分子的功能,本研究进行该分子在昆虫细胞中的真核表达,并利用表达产物分析结合宿主免疫球蛋白的特性分析.蜱的免疫球蛋白结合蛋白是从蜱的唾液腺中发现的一种免疫调节分子,它与蜱体内的宿主IgG结合,抑制宿主IgG对蜱的影响.本文以镰形扇头蜱的免疫球蛋白结合蛋白(RH-IGBP)为对象,利用昆虫细胞表达系统,成功表达出真核重组蛋白.利用此重组蛋白进行其与不同宿主,不同酶切片段IgG结合特性分析,结果表明,RH-IGBP与兔、猪IgG的IgG有明显结合能力,主要识别部位是IgG的F(ab')2片段.

摘要： 为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白,本研究利用PCR方法扩牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒。将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经抗生素、PCR鉴定,获得转座杆粒Bacmid-E2.转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,最后用SDS-PAGE和Western blotting对重组的表达蛋白进行分析。结果表明,实验成功体外表达E2基因,重组E2蛋白大小为43.6kDa,与预期值相符,且该蛋白能与BVDV阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA检测试剂盒奠定物质基础。

摘要： 采用地高辛标记探针,以核酸分子斑点杂交技术检测样品中sf9昆虫细胞残余DNA,其灵敏度和结果都能较好地达到《中国药典》的要求。

摘要： 为了获得具有良好生物学活性且具有较高表达量的鸡IL-17，在前期研究工作基础上，将其编码基因按照真核细胞(昆虫细胞)偏爱的密码子进行优化改造，经全基因合成后插入到转座载体pFastBacnTM I中，构建重组转移载体pfast-mod.chIL-17并转化感受态DHIOBac，然后通过位点特异性转座将mod.chIL-17基因整合到穿梭质粒Bacmid中，使用脂质体转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒Bacmid—mod.chIL-17，重组病毒传代扩增感染Sf9细胞后，通过间接免疫荧光实验证实了mod.chIL-17在杆状病毒系统中获得表达。

摘要： 通过PCR方法扩增完整的Cap基因，按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体中，将筛选的阳性重组载体pF-CP，转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞中，经过蓝白斑筛选和PCR鉴定，获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞，72h后获得重组杆状病毒。Westemblot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明，本研究成功构建了表达鸭圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒，表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性，为进一步研究C印蛋白的功能奠定了基础。

摘要： 为筛选与0型FMDV衣壳政酸感性相关的位点,通过突变相关酸敏感性位点以提高衣壳蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达量.本研究以牛源0型FMDV ON株为研究对象开展耐酸性毒株的筛选工作,筛选得到存在于P1上的5个错义突变位点.然后经过耐酸改造,利用杆状病毒表达系统获得表达0型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C.外源蛋白的表达检测结果表明,表达产物能够被0型FMDV多克隆抗体识别.兔疫电镜观察到了直径约27nm的正六边形颗拉.用蛋白样品rBac-P12A3C对BALB/c小鼠肌肉注射兔疫,通过液相阻断ELISA的方法检测0型口蹄疫病毒的抗体效价,最后取小鼠脾脏利用ELISPOT的方法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的水平.结果表明蛋白样品rBac-P12A3C可以激发小鼠的体液兔疫反应,同时还可以很好的激发小鼠的细胞兔疫反应.本研究为后期研制出FMD的基因工程亚单位疫苗奠定了基础.

摘要： 杆状病毒持续感染在野外昆虫宿主种群中普遍存在。在某些条件刺激下，持续感染可转变为增殖性感染，并引发流行病。杆状病毒持续感染对昆虫种群动力学以及病毒流行病学的研究具有重要意义。在某些条件刺激下,持续感染可转变为增殖性感染,并引发流行病.利用双向凝胶电泳技术对潜伏感染的P8-Se301-C1和健康Se301细胞总蛋白进行差异蛋白组比较，共获得16个上调蛋白点和15个下调蛋白点。MALDI-TOF/TOF质谱分析并获得了11个上调蛋白点和10个下调蛋白点的鉴定结果，这些蛋白主要与宿主免疫、代谢等相关。

摘要： 传统昆虫细胞杆状病毒表达系统(IBEvS)重组成功率仅有0.1％～1％,而Bac-to-Bac表达系统由于病毒载体重组在大肠杆菌中就可以完成,并且其杆状病毒质粒包含了多种抗性基因及LacZ缺失标记,重组病毒成功率可以达到100％.利用基于荧光的体积排阻色谱检测法,不用纯化就可以对蛋白的表达量、稳定性以及在去垢剂中的行为进行监测.提高和优化蛋白表达的主要方法有：减少蛋白降解;更改多角体基因上下游序列;更改启动子;利用转基因昆虫细胞系.利用IBEVS表达重组蛋白，减少重组蛋白降解的主要改进策略有：构建蛋白酶基因缺失的载体，如缺少半胱氨酸蛋白酶和几丁质酶等的杆状病毒载体；通过改变溶氧、pH等条件来降低重组蛋白的降解作用；添加蛋白酶抑制剂等。选用不同的昆虫细胞系能够拓展昆虫杆状病毒系统糖基化处理能力，例如High Five细胞所表达的重组蛋白在糖基化修饰方面比Sf9细胞更为复杂，将哺乳动物糖基化酶基因引入野生杆状病毒载体从而构建转基因昆虫细胞系。

摘要： 为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳蛋白(N),本研究在SBV-N蛋白编码基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBacTM-1中;经过测序鉴定后,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,经过同源重组获得重组杆粒Bacmid-His-SBV-N,将其转染Sf9昆虫细胞制备表达His-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒;将重组杆状病毒传代扩增后,利用Ni-NTA琼脂糖在非变性条件下纯化His-SBV-N融合蛋白,并对纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果表明,在相对分子质量约为26ku处出现目的蛋白条带,其大小与His-SBV-N融合蛋白相符;该蛋白与抗His标签的单抗和抗SBV-N蛋白的单抗2C8均可以发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的反应原性.重组His-SBV-N融合蛋白的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了生物材料.

摘要： 本发明公开了一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法：通过重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。本发明提供了一种大量分离膜蛋白的方法，利用杆状病毒感染昆虫细胞后以出芽的方式大量释放出来，致使细胞破裂，细胞剩余的膜因疏水作用而形成膜“小球”状，并且膜带有杆状病毒表达的HA融合蛋白，以此为膜蛋白的标志，经过多步纯化步骤获得宿主细胞剩余膜，过750kD中空纤维膜超滤后，再经HPLC和质谱分析，鉴定并找出目标膜蛋白。

摘要： 本发明提供了一种用于无细胞蛋白合成的昆虫细胞提取液的制备方法，昆虫细胞提取液，使用昆虫细胞提取液的无细胞系统的蛋白合成方法，以及包含昆虫细胞提取液的无细胞蛋白合成试剂盒。该提取液用本发明的方法制备简单，并且比用传统方法制备的提取液能合成更高产量的蛋白。

摘要： 用于在昆虫细胞中外源蛋白质表达的昆虫衍生启动子。在本发明中已经从昆虫(粉纹夜蛾)分离了调控多核苷酸序列，其驱动重要的昆虫蛋白质(hexamerin)在幼虫特定的演化阶段表达。所述调控多核苷酸序列促进外源基因在杆状病毒系统中比常规的多角体蛋白启动子更强的表达。另外，相对于生物技术工业中使用的常规杆状病毒，本发明的新的幼虫起源启动子与pL启动子的组合提高杆状病毒表达水平最高达到61％-375％(取决于侵染时间)。启动子pB2还驱动基因比多角体蛋白启动子更早表达，该特征对于正确的蛋白质折叠及翻译后修饰而言是重大优点。

摘要： 本发明提供一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液、裂解液获取方法及细胞裂解方法，通用性地对含AAV1～13等多种血清型的细胞中进行高效原位裂解，宿主细胞包括昆虫细胞和哺乳动物细胞，收率95%以上，全程操作无需转移料液或离心等，细胞裂解后，经过深层过滤或切向流过滤获得AAV细胞澄清液，具有收率高的特点，获得AAV细胞澄清液还可用于后续层析提纯，该方法可用于生产上大规模线性放大的收获rAAV细胞澄清液。

摘要： 本文描述了重组载体以及所述重组载体用于在昆虫细胞和哺乳动物细胞两者中表达重组蛋白的方法。本发明是基于重组转移载体，所述重组转移载体使一种或多种转基因的表达能够受昆虫细胞感受态启动子和哺乳动物细胞感受态启动子指导，所述昆虫细胞感受态启动子和所述哺乳动物细胞感受态启动子两者均存在于所述载体中的单个表达盒内并且在所述宿主细胞条件下具有活性。

摘要： 本发明公开一种昆虫细胞宿主细胞蛋白免疫检测试剂盒，涉及昆虫细胞免疫检测技术领域，上盒体的内部固定设置有免疫检测机构；下盒体的前后两侧对称插设有数个存放盒，每个存放盒底部的外侧均固定设置有翻转座，位于下盒体同一侧的翻转座的中部均通过轴承旋转穿设有转轴，转轴的左右两端分别固定插设在下盒体的左右两侧壁上；存放盒底部内侧的左右两侧对称固定设置有两个垫脚，垫脚的底部与下盒体的内底部相接触设置；存放盒的外侧壁中部固定设置有标签板，增加了检测试剂盒的容纳量，给蛋白免疫检测提供一个温度合适的环境，同时能够将试剂瓶进行有效存放，防止使用者混淆。

摘要： 本发明公开了Sf‑公昆虫细胞宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法。试剂盒包括稀释液、洗液、显色液、终止液、一抗包被的酶标板、Sf昆虫细胞蛋白标准品和标记的二抗，一抗为哺乳动物抗Sf昆虫细胞蛋白抗体，二抗为生物素标记的抗Sf昆虫细胞蛋白抗体。本发明的试剂盒，操作简便，检测结果准确可靠，检测灵敏度高，平均检测限低至18.4ng/ml，定量限为50ng/ml。

摘要： 本发明公开了一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法：通过重组杆状病毒Bm－sp－HA－tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。本发明提供了一种大量分离膜蛋白的方法，利用杆状病毒感染昆虫细胞后以出芽的方式大量释放出来，致使细胞破裂，细胞剩余的膜因疏水作用而形成膜“小球”状，并且膜带有杆状病毒表达的HA融合蛋白，以此为膜蛋白的标志，经过多步纯化步骤获得宿主细胞剩余膜，过750kD中空纤维膜超滤后，再经HPLC和质谱分析，鉴定并找出目标膜蛋白。

摘要： 本发明提供了一种用于无细胞蛋白合成的昆虫细胞提取液的制备方法，昆虫细胞提取液，使用昆虫细胞提取液的无细胞系统的蛋白合成方法，以及包含昆虫细胞提取液的无细胞蛋白合成试剂盒。该提取液用本发明的方法制备简单，并且比用传统方法制备的提取液能合成更高产量的蛋白。

摘要： 本实用新型公开了一种细胞培养实验用昆虫细胞吹打管，包括端部带有吸嘴的玻璃吸管，所述吸嘴为向一侧弯曲30-45o的尖管；在所述玻璃吸管的管颈上套装有洗耳球，在所述管颈内填装有过滤材料。所述尖管的长度为1-1.5cm。本实用新型的优点在于在对细胞培养实验中，对细胞的吹打力度可以有效控制，减少了细胞破损率，适合批量进行细胞吹打实验操作，提高了工作效率。通过对玻璃吸管的清洗消毒还可以反复使用，降低了实验成本。