EV71C4亚型SHZH98株全长cDNA感染性克隆的构建及应用

摘要

目的：构建EV71 C4亚型SHZH98株全长cDNA感染性克隆,并利用感染性克隆拯救得到的SHZH98株病毒对微生物发酵液进行抗EV71病毒活性的筛选,以期发现具有治疗EV71感染潜力的微生物天然产物.方法：应用反向遗传学技术,以Trizol提取的病毒基因组RNA为模板,在逆转录酶M-MLV的作用下合成病毒基因组的cDNA。然后以病毒基因组cDNA为模板,在DNA聚合酶的作用下分段扩增病毒的基因组序列,并通过引物引入5’端的T7启动子序列和3’端的PolyA尾序列.扩增得到的基因组片段顺次连入pBR322载体中，构建EV71SHZH98株的全长cDNA感染性克隆。将感染性克隆体外转录得到的病毒基因组RNA转染到Vero细胞中，即可拯救出EV71的病毒颗粒。通过Western blot分析、RT PCR鉴定、间接免疫荧光试验及电镜观察对拯救病毒的感染性和生物学特性进行检测。接种Vero细胞至96孔板，以药物对细胞CPE的抑制程度作为衡量抗病毒效果的指标，用SHZH98株拯救病毒对微生物发酵液进行抗EV71病毒活性的筛选。结果：测序结果表明SHZH98株全长cDNA克隆中含有完整的病毒基因组序列，全长7404nt。基因组的5’末端为含有741个碱基的非编码区(5'-UTR)，3’末端为含有81个碱基的非编码区(3'-UTR)。两者之间有一个完整的开放阅读框(ORF)，编码一条长为2193个氨基酸的多聚蛋白。转染病毒基因组RNA的细胞中和感染拯救病毒的细胞中均可检测到病毒基因组的复制和病毒特异性蛋白的表达，宿主细胞可出现剧烈而典型的CPE，说明感染性克隆体外转录的RNA和RNA拯救病毒均具有感染性。结论:本研究成功构建得到EV71 C4亚型SHZH98株的全长cDNA感染性克隆，为研究中国乃至亚太地区的EV71流行株的致病机理和EV71病毒疫苗的研发奠定了基础。利用拯救病毒筛选得到的具有抗病毒活性的微生物天然产物为抗EV71感染药物的开发提供了有益的参考。