口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株（全长、缺失和置换）cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

摘要

FMD(Foot-and-MouthDisease，FMD)是严重威胁世界畜牧业经济及人类健康的烈性传染病，是牛、羊、猪等主要畜种的头号杀手。该病病原FMDV(Foot-and-MouthDiseasevirus，FMDV)属于小RNA病毒，具有高度的变异性和广泛的宿主谱，关于其致病的分子机制、抗原变异的分子机理和宿主嗜性，至今还不是十分清楚。为了研究其致病机制、抗原变异的分子机理和宿主嗜性，我们首次构建了FMDV牛源泛亚型O/CHINA/99株的3株不同感染性cDNA分子克隆。 1.FMDVO/CHINA/99株全长cDNA分子克隆的构建和感染性鉴定 设计并合成了覆盖O/CHINA/99株基因组的9条引物，从感染牛源O/CHINA/99株的乳鼠胴体中提取病毒基因组RNA，采用RT-PCR方法分别扩增出4条目的基因片段(S、C、Z和E)。利用片段两端的限制性内切酶位点，将各基因片段分别插入到pOK12载体中，构建成O/CHINA/99株基因组的全长cDNA分子克隆。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK-21细胞，24h后可观察到典型的FMDV致细胞病变效应。分别使用RT-PCR法和乳鼠皮内接种法对拯救的病毒进行鉴定，结果表明拯救到了特定的FMDV。以上鉴定结果表明，我们已成功构建了O/CHINA/99株全长感染性cDNA分子克隆，并拯救出基因工程病毒。这将为研究FMDV基因组的结构与功能、探讨PMDV的分子致病机制以及宿主嗜性奠定了良好的基础。 2.FMDVO/CHINA/99缺失毒株的全长cDNA分子克隆的构建和感染性鉴定 关于PKs的功能目前尚不太清楚，有报道称PKs与FMDV的宿主嗜性和毒力有一定的关系。为揭示FMDV翻译、分子致病机制以及阐明PKs基因缺失导致的病毒宿主嗜性改变的原因，我们设计并合成了O/CHINA/99株基因组5条引物，利用RT-PCR扩增各基因片段，成功构建O/CHINA/99缺失毒株全长cDNA分子克隆。并拯救出O/CHINA/99特定缺失的基因工程病毒，这为进一步探索FMDV致病的分子机制及宿主嗜性奠定了良好的基础。 3.嵌合病毒pOKTAW97/CHINA99的全长cDNA分子克隆的构建和感染性鉴定 IRES是蛋白翻译顺式作用元件，二级结构有4个结构域，IRES不依赖帽结构指导病毒蛋白合成。由于IRES的空间结构发生变化，而结合的宿主真核翻译起始因子不同，所以IRES在病毒翻译和宿主嗜性中发挥很重要的作用。为揭示FMDV蛋白翻译、分子致病机制以及阐明IRES空间结构改变导致的病毒宿主嗜性改变的原因，我们以牛源FMDVO/CHINA/99株的感染性cDNA为骨架，用猪源FMDV的IRES置换相应的区段，构建了FMDV型内嵌合病毒pOKTAW97/CHINA99的全长cDNA分子克隆，并得到置换IRES的嵌合病毒。这将为研究FMDV基因组的IRES的结构与功能、探讨FMDV的分子致病机制以及宿主嗜性创造了良好的条件。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章绪论

1.1研究背景、目的和意义

1.2国内外研究现状

1.2.1 FMDV 5'UTR的VPg

1.2.2 FMDV 5'UTR的假结节

1.2.3 IRES在病毒翻译中的作用

1.2.4 3'UTR的功能及其与高级结构的关系

1.2.5影响FMDV宿主嗜性的基因

1.3 RNA病毒的反向遗传学研究

1.3.1概述

1.3.2早期的反向遗传学的研究

1.3.3病毒反向遗传操作技术的建立

1.3.4正链RNA病毒的反向遗传学操作

1.3.5负链RNA病毒

1.3.6影响构建感染性克隆的限制性因素

1.3.7感染性克隆的产生与鉴定

1.3.8病毒基因组功能的研究

1.3.9新型疫苗的研究

1.3.10基因治疗

1.4 结语

1.5 研究内容和方法

第二章 口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1 感染性克隆载体的鉴定

2.2.2体外转录物RNA的制备

2.2.3转染BHK-21细胞

2.2.4乳鼠实验结果

2.3讨论

第三章口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99缺失株全长cDNA分子的克隆构建和感染性鉴定

3.1材料与方法

3.1.1毒株和工程菌

3.1.2主要工具酶及试剂盒

3.1.3 5'端片段和引物设计合成

3.1.4 FMDV O/CHINA/99株基因组全序列的扩增

3.1.5全长cDNA的克隆和构建

3.2 结果

3.2.1 5'端缺失后序列的鉴定

3.2.2全长cDNA构建和鉴定

3.2.3体外转录物RNA的制备

3.2.4转染BHK-21细胞

3.2.5乳鼠试验结果

3.2.6功能未知区序列的空间结构

3.2.7 5'UTR序列的比对

3.4讨论

第四章口蹄疫病毒型内嵌合病毒TAW97/CHINA 99的构建和感染性鉴定

4.1材料与方法

4.1.1 O/CHINA/99感染性cDNA克隆

4.1.2主要工具酶及试剂盒

4.1.3突变序列的设计与合成

4.1.4 O/CHINA/99突变毒株全长cDNA的克隆和构建技术路线(图1)

4.2 结果

4.2.1嵌合重组质粒pOKTAW97/CHINA99的鉴定结果

4.2.2线性化全长cDNA的获得

4.2.3体外转录物RNA的制备

4.2.4 转染BHK-21细胞

4.2.5 乳鼠实验结果

4.3 IRES的空间结构及真核起始因子

4.3.1 IRES空间结构

4.3.2 FMDV翻译所涉及的细胞因子

4.4讨论

第五章研究结论

参考文献

致谢

作者简历