Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法

摘要

Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法，它涉及口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法。它解决了现有灭活疫苗纯化过程中很难监测，所以残留的非结构蛋白会干扰对自然感染动物的诊断，诊断的准确性低的问题。序列见SEQ ID NO：1。方法：1.从pBSAs全长重组质粒中克隆3A14L和3A14R，得到3A14L PCR产物和3A14R PCR产物，然后融合PCR回收融合产物；2.双酶切pBSAs全长重组质粒和融合产物，再连接并构建重组质粒pBSAs-3A14D即完成。本发明中缺失3A非结构蛋白的一部分，不会残留此部分的非结构蛋白，诊断的准确性高。

说明书

技术领域

本发明涉及口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起的主要侵害猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病病原FMDV(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)共分为7个血清型，分别为O，A，C，SAT 1，SAT 2，SAT 3和Asia 1型，感染一种血清型并不能产生对另外一种血清型的免疫保护力。3A蛋白氨基酸的缺失多发生于O型FMDV，这种自然缺失在Asia 1型FMDV至今尚未见报道。

对于FMD的预防，在西方发达国家以检疫为主，一旦发病以封锁、隔离扑杀为主要预防手段；而在发展中国家由于经济发展条件的限制，多采用疫苗接种结合封锁、隔离和扑杀患病动物的预防措施。在我国对于该病的预防主要以强制免疫作为平时的主要预防措施。由于鉴别口蹄疫自然感染和疫苗免疫动物(DIVA)是OIE判定一个国家有无口蹄疫的依据，因此疫苗的设计和生产也要服务于这个原则，即可以与DIVA的诊断方法相辅相成。动物感染FMDV后，通常既产生结构蛋白的抗体也能产生非结构蛋白的抗体。由于非结构蛋白在口蹄疫病毒复制过程中产生，所以如果血清中存在非结构蛋白抗体则说明动物感染了FMDV。而未感染的动物仅产生结构蛋白抗体，传统疫苗中保留了大部分的病毒免疫原蛋白。基于此原理，一些依赖于检测非结构蛋白来鉴别FMD自然感染和疫苗免疫动物的ELISA方法油然而生(De Diego et al.，1997；Mackay et al.，1998；Sorensen et al.，1998；Moonen et al.，2004)。然而疫苗在制备过程中可能存在非结构蛋白残留，降低了ELISA试验的特异性。由于灭活疫苗纯化过程中很难监测，所以残留的非结构蛋白会干扰对自然感染动物的诊断，诊断的准确性低。

分子标记疫苗是在分子水平上，将具有选择性标记的基因克隆到病毒全长cDNA中，经过检测，可以区分抗体来自于自然感染还是标记疫苗免疫，从而鉴别出感染畜群和免疫畜群。分子标记疫苗的开发有可能成为疫苗发展的一个主要方向。在国外，分子标记疫苗研究的比较多，例如，1997年Michael等(Michael et al，1997，Michael，1997)用反向遗传技术在呼肠孤病毒基因组上插入了CAT基因，并得到了CAT活性极高的拯救病毒。Moser等(1998)将CAT基因插入到CSFV Alfort/187株的全长cDNA克隆pA187-1上的Npro中，并将体外转录本RNA转染入SK-6细胞，结果得到了重组病毒vA187-CAT，重组病毒与原病毒vA187-1在培养特性上无差别，并可在细胞培养液中检测到融合蛋白CAT-Npro，此蛋白具有CAT活性和Npro活性，CAT基因可稳定保留在重组病毒基因组中，经传代10次后仍具有CAT活性。Shi等(2002)成功构建了西尼罗河病毒的全长感染性克并在cDNA上插入和缺失了几个酶切位点作为遗传标记，试验证明该重组病毒与其父本病毒具有同样的致病性。Yount等(2003)用反向遗传技术拯救出了带有突变标记的SARS病毒。Baric等(2005)构建出了带GFP标记的MHV(mouse hepatitis virus)和SARS-CoV感染性cDNA，试验证明，用此策略可在2个月内拯救出SARS病毒。国内，分子标记疫苗研究较少，如黄耀伟等(2003)报道，通过定点突变在传染性法氏囊病毒B节段上引入一个EcoRV酶切位点作为分子标记并成功拯救出了传染性法氏囊病毒；另又据网上新闻报道，我国还成功研制出带分子标记的高产重组禽流感疫苗株rH5N3、猪伪狂犬病毒闽A株SA215三基因缺失疫苗等一批产品。然而FMD抗原表位分子缺失标记疫苗的研究在国内尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有灭活疫苗纯化过程中很难监测，所以残留的非结构蛋白会干扰对自然感染动物的诊断，诊断的准确性低的问题，而提供Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法。

Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的基因序列为：SEQ ID NO：1。

Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的构建方法按以下步骤进行：一、从pBSAs全长重组质粒中克隆3A基因的91～104位氨基酸的3A14L(左臂)和3A14R(右臂)，得到3A14L PCR产物和3A14R PCR产物，然后进行融合PCR并回收融合产物；二、用EcoRT22I和Sma I分步双酶切pBSAs全长重组质粒和融合产物，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒pBSAs-3A14D，即完成Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的构建。

本发明具有双重特征，一是Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA在缺失掉这14个氨基酸(NEYIDKANITTDDK)后病毒对某些细胞的感染能力下降，甚至不感染；二是该区域是抗原表位区，缺失后即可作为一种标记与亲本病毒相鉴别；本发明中缺失3A非结构蛋白的一部分，不会残留此部分的非结构蛋白，不会干扰对自然感染动物的诊断，诊断的准确性高；传统疫苗的弊端是一旦灭活不彻底，残留的非结构蛋白会引起机体产生针对非结构蛋白的抗体，而自然感染的动物体内由于也有非结构蛋白抗体，所以给区分自然感染和疫苗免疫动物带来很大困难。

附图说明

图1是具体实施方式二中融合PCR凝胶电泳图，其中1泳道为2000plusMarker，2泳道为3A14L PCR产物，3泳道为3A14R PCR产物，4泳道为融合产物；图2是具体实施方式二中重组质粒pBSAs-3A14D鉴定的凝胶电泳图，其中1泳道为15000DNA Marker，2泳道为EcoR V酶切产物；图3是具体实施方式二中缺失重组病毒的RT-PCR鉴定的凝胶电泳图，其中1泳道为2000plus Marker，2泳道为rvAs-3A14D PCR产物，3泳道为rvAs-3A14D PCR产物；图4是具体实施方式二中重组病毒生长曲线，其中◆为亲本病毒，■为rvAs-3A14D；图5是具体实施方式二中3A14PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中1泳道为2000plus Marker，2泳道为3A14 PCR产物；图6是具体实施方式二中pET-32a-3A14表达载体鉴定的凝胶电泳图，其中1泳道为2000plusMarker，2泳道为Xho I单酶切，3泳道为Bgl II和Xho I双酶切，4泳道为EcoR I酶切，5泳道为质粒对照；图7是具体实施方式二中pET-32a-3A14-2表达载体鉴定的凝胶电泳图，其中1泳道为2000plus Marker，2泳道为阴性结果，3泳道为3A14-2PCR产物；图8是具体实施方式二中pET-32a-3A14-4表达载体鉴定的凝胶电泳图，其中1泳道为2000plus Marker，2泳道为阴性结果，3泳道为阴性结果，4泳道为Bgl II和Xho I双酶切；图9是具体实施方式二中pET32a-3A14表达蛋白的SDS-PAGE分析凝胶电泳图，其中1泳道为蛋白分子量标准，2泳道为pET-32a空载体诱导后，3泳道为pET-32a-3A14诱导后，4泳道为pET-32a-3A14诱导前；图10是具体实施方式二中pET32a-3A14-2和pET32a-3A14-4表达蛋白的SDS-PAGE分析凝胶电泳图，其中1泳道为pET32a空载体诱导后，2泳道为pET32a-3A14-2诱导前，3泳道为pET32a-3A14-2诱导后，4泳道为pET32a-3A14-2诱导后裂解后沉淀，5泳道为pET32a-3A14-2诱导后裂解后上清，6泳道为蛋白分子量标准，7泳道为pET32a-3A14-4诱导前，8泳道为pET32a-3A14-4诱导后，9泳道为pET32a-3A14-4诱导后裂解后沉淀，10泳道为pET32a-3A14-4诱导后裂解后上清；图11是具体实施方式二中3A14及其串联表达蛋白的Western blot鉴定凝胶电泳图，其中1泳道为蛋白分子质量标准，2泳道为FMDV-VP2结构蛋白阳性对照，3泳道为pET-32a空载体表达蛋白阴性对照，4泳道为3A14单独表达蛋白(epi3A14)的westernblot结果，5泳道为3A14-2表达蛋白的western blot结果，6泳道为3A14-4表达蛋白的western blot结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的基因序列为：SEQ ID NO：1。

本实施方式中缺失掉的是3A基因91～104位氨基酸，这14个氨基酸的序列为NEYIDKANITTDDK。

具体实施方式二：本实施方式Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的构建方法按以下步骤进行：一、从pBSAs全长重组质粒中克隆3A基因的91～104位氨基酸的3A14L(左臂)和3A14R(右臂)，得到3A14L PCR产物和3A14R PCR产物，然后进行融合PCR并回收融合产物；二、用EcoRT22I和Sma I分步双酶切pBSAs全长重组质粒和融合产物，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒pBSAs-3A14D，即完成Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的构建。

本实施方式步骤一中pBSAs全长重组质粒为含有As/CHA/05株FMDV全基因组全长cDNA的pBluescriptSK质粒，包含了保证所合成的转录本具有感染性所要求的Poly(C)和Poly(A)序列；在全长cDNA的5’末端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，T7启动子上游和3’末端具有EcoR V限制性内切酶位点以保正转录正确启始和终止。

本实施方式步骤一中3A14L(1518bp)，3A14R(516bp)，融合产物(2038bp)，如图1所示。

本实施方式步骤二中所得重组质粒pBSAs-3A14D，经鉴定为阳性的质粒送测序公司进行测序，以确保缺失了3A基因的42bp；经基因组两端的EcoR V酶切位点切出8200bp和3000bp条带，如图2所示，结果表明，成功构建了重组质粒pBSAs-3A14D。

实验：

(一)、重组病毒rvAs-3A14D的拯救及鉴定

a、缺失重组病毒的CPE：

重组质粒pBSAS-3A14D线性化的体外转录本转染BHK-21细胞后42h，细胞出现细胞病变(CPE)，表现为细胞圆缩、呈葡萄串状分布、细胞崩解成碎片直至脱落；将细胞培养物连续传代，CPE出现的时间缩短，病变更加典型，传至第3代细胞可在接种病毒后8h出现明显的CPE，培养11h可使80％细胞CPE，继续培养后最终单层脱落形成空斑，而对照细胞单层完整，形态规则；拯救得到的FMDV病毒命名为：rvAs-3A14D；

b、缺失重组病毒的间接免疫荧光检测：

将拯救病毒rvAs-3A14D分别感染BHK-21细胞后用Asia 1型FMDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验检测，均可观察到特异性荧光，而正常BHK-21细胞无荧光产生，这表明，拯救的缺失病毒为Asia 1 FMDV。

c、缺失重组病毒的电镜观察：

纯化的缺失拯救病毒与FMDV特异性单克隆抗体作用后形成免疫复合物，经过负染色，电子显微镜下观察，可见呈球形的病毒粒子，直径约为25nm；

d、缺失重组病毒的RT-PCR鉴定：

对拯救病毒rvAs-3A14D进行RT-PCR鉴定，扩增一段含有缺失位点的大小约为650bp的基因片段，如图3所示，经测序表明，两株拯救的病毒分别缺失了目的区域的30bp和42bp。

(二)、重组病毒的特性研究

重组病毒的生长曲线：为了比较重组病毒与亲本病毒之间的动态生长特性，制作病毒生长曲线，结果见图4，重组病毒与亲本病毒具有相似的复制特点和增殖特性。

a、病毒TCID₅₀的测定：

用Reed-Muench法测定了亲本病毒和重组病毒rvAs-3A14D的在BHK-21细胞的TCID₅₀；算得的TCID₅₀结果分别为，亲本病毒：10^-7.23，rvAs-3A14D：10^-6.88；由此可见，病毒缺失掉14aa抗原表位后对BHK-21细胞的感染性与亲本病毒差别不大；

b、病毒乳鼠LD₅₀的测定：

接种重组病毒和亲本病毒的乳鼠，分别在接种后28h～32h，高浓度接种乳鼠表现典型的呼吸困难、后肢麻痹等症状；42h～48h后开始出现乳鼠死亡，对照鼠正常；最后根据统计结果，计算出重组病毒和亲本病毒的LD₅₀，分别为亲本病毒：10^-6.77；rvAs-3A14D：10^-6.56；在致病力上不存在显著差异；

c、重组病毒的细胞嗜性：

为了研究病毒缺失3A的部分基因后，在体外是否会改变对其宿主细胞的嗜性和感染能力，选择了BHK-21、PK15和犊牛肾细胞三种动物肾细胞进行感染试验；结果表明，病毒缺失3A的91～104位氨基酸后，对犊牛肾细胞的感染能力明显降低，甚至不能在该细胞中进行复制，而在仓鼠肾细胞和猪肾细胞中生长良好；这说明，完整的3A基因对本毒株As/CHA/05能在犊牛肾细胞中正常复制是必需的。

(三)、3A14短肽的原核表达及抗原性鉴定

1材料与方法

1.1血清和抗体

血清为牛Asia 1型FMDV感染血清；兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标二抗购自Sigma公司。

1.2质粒与菌株

表达载体pET-32a、大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)pLysS本实验室保存。

1.3主要试剂

Ni²⁺-NTA离子柱亲和层析纯化试剂盒购自德国QIAGEN公司；EasySeeWestern blot Kit购自全式金公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司；IPTG购自宝生物工程(大连)有限公司；氨苄青霉素(Amp)、十二烷基磺酸钠(SDS)为Sigma公司进口分装；低熔点琼脂糖、考马斯亮蓝R250和考马斯亮蓝R250购自哈尔滨万太生物科技公司；丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸氨、甘氨酸、Tris-Cl、Tris-base、购自哈尔滨宝泰克生物科技公司。

1.4 14aa短肽相应基因的PCR扩增

该14aa短肽位于3A的91～104位氨基酸(基因片段命名为3A14，蛋白命名为epi3A14)；为了进行表位串联表达，故在短肽的下游引入了连接肽(Gly4Ser)3，需要扩增的整个序列结构为：BglII-NEYIDKANITTDDK-(Gly4Ser)3-BamH I-Xho I。利用融合PCR的方法扩增这段基因，4条引物如下所示，其中3A14E1和3A14E2为内引物，3A14E3和3A14E4为外引物；

  引物  引物序列Primer sequences(5′-3′)  方向3A14E1  GAACGAGTACATCGACAAAGCCAACATCACCACAGATGACAAGGGTGGTGGTGGTTCGG+3A14E2  TTACGGATCCGAACCACCACCACCCGAACCACCACCACCCGAACCACCACCACCCTTGT-  3A14E3  GGAAGATCTGAACGAGTACATCGACAAAG  +  3A14E4  CCGCTCGAGTTACGGATCCGAACCACCAC  -

PCR融合分两步进行，第一步内引物退火延伸，低复性温度下进行10个循环；第二步加入3A14E3和3A14E4(外引物)，以第一步反应产物为模板在高复性温度下进行25个循环扩增融合片段。

1.5重组表达载体的构建

a、3A14基因与表达载体pET-32a的连接反应：上述纯化后的PCR产物和载体pET-32a分别用Bgl II和Xho I进行双酶切，将3A14片段定向克隆至pET-32a中，连接产物命名为pET-32a-3A14；

b、表位串联重组表达载体pET-32a-3A14-2和pET-32a-3A14-4的构建：将pET-32a-3A14重组载体用BamH I和Xho I酶切，回收载体片段。由于BamH I与Bgl II是同尾酶，所以具有Bgl II和Xho I粘性末端的3A14酶切产物能够插入上述载体中，构建成含有2个3A14E片段的重组载体pET-32a-3A14-2；同理，构建了含有4个3A14E片段的重组载体pET-32a-3A14-4。

1.6 3A14及其串联蛋白的诱导表达及纯化

a、在大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达：将提取的阳性质粒转化表达宿主菌E.coli Rosetta(DE3)，之后接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养到菌液的OD_600nm约为0.4～0.6时；加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG进行诱导表达，测定诱导4h后的阳性菌和阴性菌的OD₆₀₀值，准备通过12％分离胶进行SDS-PAGE电泳分析3A14及其串联产物在Rosetta宿主菌中的表达情况；

b、诱导菌的SDS-PAGE分析：收集诱导4h后的1mL样品12000r/min离心1min，弃上清，菌体沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.4)重悬，重悬用PBS(μL)＝菌液OD₆₀₀值×50，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水中裂解5min，12000r/min，离心30s后备用，参照分子克隆指南第三版中SDS-PAGE制胶方法，采取5％积层胶、12％分离胶进行SDS-PAGE分析。

c、表达蛋白的纯化：表达的蛋白以可溶形式表达，在天然条件下对蛋白进行纯化，并参照Ni²⁺-NTA离子柱亲和层析纯化试剂盒QIAGEN蛋白纯化手册进行操作。

1.7Western blot检测

以重组3A14及其串联蛋白为被检抗原，原核表达的口蹄疫病毒VP2蛋白做为阳性参照蛋白，TrxA蛋白作为阴性对照(TrxA为pET-32a的一个大的融合标签蛋白，有109aa)；以牛Asia 1型口蹄疫病毒感染血清为一抗；兔抗牛IgG-HRP为二抗，进行Western blot操作，具体操作如下：

(1)将纯化得到的蛋白经SDS-PAGE后转印至PVDF膜；

(2)封闭：以5％的脱脂乳4℃封闭过夜；

(3)一抗作用：弃去封闭液，用PBST洗涤PVDF膜3次，每次10min，然后将其放入用PBST稀释好的一抗中(1∶1000)，于平缓摇动的37℃摇床上，50r/min，温育2h；

(4)二抗作用：弃去一抗，用PBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。将PVDF膜移至用PBST稀释好的二抗中(1∶10000)，于平缓摇动的37℃摇床上，50r/min，温育1h；

(5)显色：弃去二抗溶液，用PBST洗涤NC膜3次，每次10min，ECL显色试剂盒进行显色，胶片曝光。

2结果

2.1 3A14短肽及其串联片段原核表达载体的构建

a、3A14的PCR扩增产物

经融合PCR，获得了含有3A14和连接肽的115bp的PCR产物，如图5所示。

b、pET-32a-3A14表达载体的鉴定

用Xho I单酶切，切出6015bp目的条带(5900bp+115bp)，用目的片段两端的Bgl II和Xho I双酶切切出5900bp载体带和115bp条带，而连入目的片段后，载体原有的EcoR I酶切位点消失，故用EcoR I应切不开质粒，如图6所示。

c、pET-32a-3A14-2表达载体的鉴定

用引物3A14E3和3A14E4 PCR鉴定重组质粒，目的条带大小为200bp，如图7所示。

d、pET-32a-3A14-4表达载体的鉴定

用Bgl II和Xho I双酶切，切出5900bp载体带和388bp的条带，如图8所示。

2.2 3A14短肽及其串联片段在大肠杆菌中的诱导表达

经终浓度为1mmol/L IPTG，37℃诱导4h后，SDS-PAGE分析诱导后的与诱导前的菌相比，在约20kDa的位置出现了预期相符的蛋白条带，结果表明Asia1口蹄疫病毒3A14的融合蛋白在Rosetta菌中获得了表达(约20kDa)，如图9所示；3A14的2个串联和4个串联片段诱导后也得到了表达，而且是可溶性表达，约为27kDa和34kDa，如图10所示。

2.3 3A14短肽及其串联片段表达蛋白的Western blot鉴定

纯化后的蛋白经Western blot鉴定，表达的融合蛋白epi3A14-2和epi3A14-4均与牛Asia1型口蹄疫感染血清产生特异性反应，具有良好的抗原性，但epi3A14却无可见条带。

结论

a、利用融合PCR技术构建了Asia 1型FMDV 3A基因91～104位氨基酸缺失的感染性重组质粒pBSAs-3A14D。

b、利用反向遗传操作系统构建了一株缺失掉Asia 1型FMDV 3A基因91～104位氨基酸的重组病毒(rvAs-3A14D)，该缺失位点模拟了其他血清型FMDV的自然缺失，为研究Asia 1型FMDV的宿主嗜性提供及其有利的资料。

c、本实施方式构建的重组病毒rvAs-3A14D缺失的14aa为3A非结构蛋白中的抗原表位区，缺失后可作为标记与亲本病毒相鉴别，为进一步研究口蹄疫分子标记疫苗奠定基础。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中克隆3A基因的91～104位氨基酸的左臂(3A14L)，所用的反应体系：

成分                                                   用量

以pBSAs全长重组质粒的500倍稀释为模板                   3μL

20μM引物L1  5′-TCATCAAACTCCTGAGCCGC-3′              1μL

20μM引物L2  5′-CACCGCATCATTCACCATCT-3′    1μL

5×PrimeSTAR Buffer                                    10μL

2.5mM dNTP                                             4μL

PrimeSTAR HS DNA聚合酶                                 0.5μL

用dH₂O补至                                             50μL

注：单下划线部分与3A104L的3′端匹配；双下划线部分与3A14R的5′端匹配；

条件：94℃预变性3min，94℃20s，57℃30s，72℃1min，共25个循环，72℃延伸7min。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中克隆3A基因的91～104位氨基酸的右臂(3A14R)，所用的反应体系：

成分                                                用量

以pBSAs全长重组质粒的500倍稀释为模板                3μL

20μM引物R1  5′-GATGGTGAATGATGCGGTG-3′    1μL

20μM引物R2  5′-TGACGAGGCACGAGGTAGGC-3′           1μL

5×PrimeSTAR Buffer                                 10μL

2.5mM dNTP                                          4μL

PrimeSTAR HS DNA聚合酶                              0.5μL

用dH₂O补至                                          50μL

注：单下划线部分与3A104L的3′端匹配；双下划线部分与3A14R的5′端匹配；

条件：94℃预变性3min，94℃20s，57℃30s，72℃1min，共25个循环，72℃延伸7min。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中融合PCR分为两步进行，第一步融合PCR不加引物，反应体系由下列成分组成：

成分                                          用量

5×PrimeSTAR Buffer                           10μL

2.5mM dNTP                                    4μL

3A14L PCR产物                                 5μL

3A14R PCR产物                                 5μL

PrimeSTAR HS DNA聚合酶                        0.5μL

条件：94℃预变性3min，94℃15s，50℃30s，72℃1.5min，共10个循环。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

第二步融合PCR中加入L1和R2引物(外引物)，反应体系由下列成分组成：

成分                               用量

10×ExTaqBuffer                    5μL

2.5mM dNTP                         4μL

20μM引物L1                   1μL

20μM引物R2                   1μL

融合PCR第一步中PCR产物        3μL

ExTaqDNA聚合酶                0.5μL

用dH₂O补至                    50μL

条件：94℃预变性3min，94℃15s，60℃30s，72℃2min，共25个循环，72℃延伸7min，4℃保存。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中酶切的体系如下：

成分                         用量

pBSAs全长重组质粒            30.0μL

EcoRT22I                     2.5μL

10×H Buffer                 5μL

无菌水                       12.5μL。

其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中酶切的体系如下：

成分                                           用量

pBSAs全长重组质粒EcoRT22I酶切后回收产物        30.0μL

Sma I                                          2.5μL

10×T Buffer                                   5μL

BSA                                            5μL

无菌水                                         7.5μL。

其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中酶切的体系如下：

成分                    用量

融合产物                30.0μL

EcoRT22I                2.5μL

10×H Buffer            5μL

无菌水                  12.5μL。

其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中酶切的体系如下：

成分                                  用量

融合产物EcoRT22I酶切后回收产物        30.0μL

Sma I                                 2.5μL

10×T Buffer                          5μL

BSA                                   5μL

无菌水                                7.5μL。

其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中连接体系如下：

成分                               用量

10×T₄DNA连接酶缓冲液              1.0μL

双酶切后的融合产物                 6.0μL

双酶切后的pBSAs全长重组质粒        2.0μL

T₄DNA连接酶                        1.0μL。

其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

序列表

<110>东北农业大学

 

<120>Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法

 

<160>5

 

<210>1

<211>8154

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的基因序列。

 

<400>1

ttgaaaaggg gcgctagggt ctcaccccta gcacgccaac gactgctcct acgctgtgct 60

acacacttac gtgtgtacat gcgggaaccg atggactatc gttcacccac ctacagctgg 120

actcacggca ccgcgtggcc atgctagctg gattgtgcgg acgaacgccg cttgcgcttc 180

ggcgtgaccg gttaatactc ttaccactct ccgcctactt ggtcgttagc gctgtcttgg 240

gcactcctgt tgggggccgt tcgacgctcc acggtctccc ccgtgtgaca cactacggtg 300

ttgtggccac accgtgcgag ttgttcgcct ggtgtgcttc ggctgtcacc aagcgcccgc 360

ctttcacccc ccccccccta agttttaccg tcactcccga cgttaaaggg agataaccac 420

acgcttgaga ccgtcttgtc cgacgttaac ggactggaac cacaagctta taccgccttt 480

cccggcgtta acgggatgta accacaagat ggaccttcac ccggaagtaa aacggcacac 540

acacacagtt ttgcccgttt tcacgagaaa cgggacgtct gcgcacgaaa cgcgccgtcg 600

cttgaggagg acttgtacaa acacgatcta cgcaggtttc ccaaccgaca caacccgtgc 660

aacttgaaac tccgcctggt ctttccaggt ctagaggggt gacattttgt actgtaattg 720

actccacgct cggtccacta gcgggtgtta gtaactgtat tgttgcttcg tagcggagca 780

taatggccgt gggaactccc ccttggtaac aaggacccac ggggccgaaa gccacgtcct 840

aacggaccca ttatgtgtgc aaccccagca cggcaactta ctgtgaaaac cactttaagg 900

tgacactgat actggtactc aactactggt ggcaggctaa ggatgccctt caggtacccc 960

gaggtaacac gcgacactcg ggatctgaga aggggaccgg gacttcttta aaagtgcccg 1020

gtttaaaaag cttctatgtc tgaacaggcg accggaggcc ggcgcctttc ttttgactac 1080

tactgctttt atggatacaa ctgattgctt tgtcgccctg atccacatat ttagagagat 1140

taaggcactg tttctttcac ggacacaagg aaagatggaa ttcacacttc acaacggtga 1200

gaagaagacc ttttactcca gacccaacaa ccatgataac tgctggctga acactatcct 1260

ccagttgttc aggtacgtcg atgagccttt cttcgactgg gtctacgact cgcctgaaaa 1320

cctcactctc gaggcgatta ggcagttgga ggaagttacc ggtcttgagc tgcatgaggg 1380

tggaccaccc gcccttgtca tctggaacat caagcatttg ctccacaccg gagtcggtac 1440

cgcttcgcgc cctagcgaag tgtgtatggt agacggcacg gacatgtgtt tggctgattt 1500

ccatgctggc attttcctga aaggacaaga acatgctgtg tttgcctgtg tcacctccaa 1560

cgggtggtac gcgatcgatg acgaggactt ttacccctgg acaccggacc cgtccgacgt 1620

cctggtgttt gttccgtacg accaagaacc gctcaacggc gagtggaaag caaaggttca 1680

gaagcggctc aagggggccg ggcaatccag tccggcgacc gggtcgcaga accagtcagg 1740

caacactgga agcatcatta acaactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac 1800

gcaacttgga gataacgcta tcagcggagg ctccaacgag ggttccacgg acaccacatc 1860

cacacacaca aacaacaccc aaaacaatga ttggttctca cgcttggcca gctcggcctt 1920

tagcggactg tttggtgctc ttttggctga caagaaaacg gaggagacaa ctctgcttga 1980

agaccgcatt ctcaccacca gaaatggcca cacgacgtcg acaacacagt cgagtgttgg 2040

cgtaacatat ggttacgctg tggctgagga cgcggtatct gggcctaaca cctcaggcct 2100

ggagacccgc gtgacacagg ctgaacggtt cttcaagaaa cacctgtttg actggacgcc 2160

ggatttgtca tttggacact gtcactactt ggaactcccc tctgaacaca agggcgtgtt 2220

tggcagcctc atgagctctt atgcttacat gaggaacggg tgggacgttg aggtgaccgc 2280

tgttggaaat cagttcaatg gtggttgtct cctcgtcgca ctcgtgccgg agctgaaaga 2340

gctcgacacg cggcagaagt atcagttaac cctcttccca caccagttca ttaacccgcg 2400

cactaacatg acggctcaca ttaacgtgcc gtacgtgggt gtcaacaggt acgaccagta 2460

cgagctccac aaaccgtgga cgcttgtggt gatggtggtg gccccgctta ccgtcaaaac 2520

tggtggttct gaacagatca aggtttacat gaatgcagcg ccgacctacg tgcacgtggc 2580

aggagaactg ccctcgaaag aggggatagt tcctgtggcg tgtgtggacg gttacggcaa 2640

catggtaacc acggacccga agacggctga ccccgtctac gggaaagtgt ctaacccccc 2700

cagaacaagc ttccctgggc gcttcacaaa cttccttgat gtagcggagg cgtgtccaac 2760

cttcctccgc ttcggagaag taccatttgt gaagacggtg aactctggtg accgtttgct 2820

tgccaagttt gacgtgtccc tcgctgcggg gcacatgtcc aacacctact tggcaggttt 2880

ggcacagtac tacacacagt acagcggcac tatgaatatc cacttcatgt tcaccggacc 2940

cacggatgcc aaagcccgct acatggtggc ttacatacct cctggtatga caccgccaac 3000

ggacccggag cgggctgcac actgcattca ttctgagtgg gacactggac tcaattctaa 3060

atttaccttt tctatccctt acctttctgc tgcagactat gcttacactg cttctgacgt 3120

ggctgagacc acgagtgtgc agggatgggt gtgtatttac cagatcaccc acggtaaagc 3180

tgaaggtgac gcgctggtcg tgtccgtcag cgctggcaag gactttgagt ttcgactacc 3240

ggtggatgcc cgccaacaga ctaccaccac tggcgagtcc gcggacccag tcaccaccac 3300

ggttgagaac tacggaggag agacccagac ggcccgacgg cttcacactg atgtcgcctt 3360

cgttctcgac aggttcgtaa aactcaccca gcccaagagc acccaaaccc ttgatctcat 3420

gcagatcccc tcacacacac tggtcggggc gcttctccgg tctgcgacgt actacttctc 3480

agacctggag gttgcgctcg tccacacagg accggtcacg tgggtgccca atggtgcgcc 3540

taagaccgcc ttgaacaacc acaccaaccc gactgcctac cagaagcagc ctatcacccg 3600

cttggcactc ccctacaccg ctccccaccg cgtgctgtca acagtgtaca acgggaagac 3660

aacgtacgga gaagaatcct cgcggcgtgg tgatcttgcc gccctcgcac gcagagtgag 3720

caaccggctg cccacttcct tcaactacgg cgctgtgaag gccgacacca tcacggagct 3780

gttgatccgc atgaagcgtg cggaaacata ctgccccagg cccttgctgg ctcttgacac 3840

cacacaagac cgccgtaaac aggagatcat tgcacctgag aaacagactt tgaactttga 3900

cctactcaag ttggcaggag acgtggagtc caaccctggg cccttcttct tctctgatgt 3960

caggtcgaac ttcaccaagc tggtggacac cattaaccag atgcaagagg acatgtcaac 4020

aaaacacgga cccgacttta accggttggt gtccgcattt gaggaactgg ccactggagt 4080

gaaggctatc aggactggtc ttgacgaggc caaaccctgg tacaaactca tcaaactcct 4140

gagccgcttg tcatgcatgg ccgctgtagc agcacggtca aaggacccag tccttgtggc 4200

catcatgctg gctgacaccg gccttgagat tctggacagc acattcgtcg tgaagaagat 4260

ctccgactca ctctccagtc tctttcacgt gccggccccc gtcttcagtt tcggagcccc 4320

ggttctgttg gccgggttgg tcaaagtcgc ctcgagtttc ttccggtcca cgcccgaaga 4380

ccttgagaga gcagagaaac agctcaaagc acgtgacatc aatgacatct tcgccattct 4440

caagaacggc gagtggttgg tcaaattgat tcttgccatc cgcgactgga ttaaggcatg 4500

gatcgcctca gaagaaaagt ttgtcaccac gacagacttg gtgcctggca tcctcgaaaa 4560

gcagcgggac ctcaacgacc cgagcaagta cgaggaagcc aaggagtggc tcgacaacgc 4620

gcgtcaagcg tgtctgaaga gcgggaacgt ccacattgcc aacctgtgca aggtgatcgc 4680

cccggcaccc agcaagtcga gacccgaacc cgtggtcgtt tgcctccgag gcaaatccgg 4740

ccagggaaag agtttccttg cgaacgtgct cgcacaagca atctccacac acttcaccgg 4800

cagaactgat tcagtttggt actgcccgcc tgaccctgac cacttcgacg gttacaacca 4860

acagaccgtt gttgtgatgg atgatttggg ccagaacccc gacggcaagg actttaagta 4920

cttcgcccag atggtttcaa ccacggggtt catcccgccc atggcctcgc tcgaagacaa 4980

aggcaaacct ttcaacagca aggtcatcat cgccaccacc aacctgtatt cgggcttcac 5040

cccgaggacc atggtgtgcc ctgatgcact gaaccggagg tttcactttg acattgacgt 5100

gagtgccaag gatgggtaca aaattaacaa caagttggac attatcaaag cacttgaaga 5160

cacccacacc aacccggtgg caatgtttca gtacgattgt gcccttctca acggcatggc 5220

cgtcgaaatg aagagaatgc aacaagacat gttcaagcct caaccgcccc tccagaacgt 5280

gtaccaactt gttcaggagg tgattgatcg ggtcgagctc cacgagaaag tgtcgagcca 5340

cccgattttc aagcagatct caattccttc ccaaaagtct gtgctgtact tcctcattga 5400

gaaaggccag catgaggcag cgattgaatt ctttgaggga atggtgcacg actccattaa 5460

ggaggaactc cggcccctca tccaacagac ctcatttgtg aaacgcgctt tcaagcgcct 5520

gaaggaaaac tttgagattg ttgccctgtg tttgactctt ttggcaaaca tagtgatcat 5580

gatccgcgag acgcgcaaga gacagcagat ggtgaatgat gcggtgactc ttgacgaggc 5640

ggaaaagaac cctctggaga ccagtggtgc tagcaccgtt ggtttcagag agagaaccct 5700

cccggggcgc aagacgagtg atgacgtgta ctccgagccc gtcaaacccg tggaggaaca 5760

accacaagct gaaggaccct acgccgggcc actcgagcgt cagaaacctc tgaaggtgag 5820

agccaagctc ccacagcaag agggacctta cgctggcccg atggagagac agaaaccact 5880

gaaagtgaaa gcaaaagccc cggtcgttaa ggaagggcct tacgaaggac cggtgaagaa 5940

acctgtcgct ttgaaagtga aagcaaagaa tttgattgtc actgagagtg gtgccccacc 6000

gactgacttg caaaagatgg tcatgggcaa caccaagcct gttgagctca tcctcgacgg 6060

caagacggta gccatctgct gcgctaccgg agtctttggt actgcctacc tcgtgcctcg 6120

tcaccttttc gcagagaagt acgacaagat catgctggac ggcagagcca tgacagacag 6180

tgactacaga gtgtttgagt ttgagattaa agtaaaagga caggacatgc tctcagacgc 6240

cgcactcatg gtgctccacc gtgggaatcg cgtgcgtgac atcacgaagc acttccgtga 6300

tgtagccaag atgaagaaag gaacccccgt cgttggtgtg atcaacaacg ccgacgttgg 6360

gagactgatt ttctctggtg aggccctaac ctacaaagac attgtagtgt gcatggacgg 6420

agacaccatg cctggccttt ttgcctacaa ggccgtcacc agggcgggct actgtggagg 6480

agccgttctc gcgaaggacg gagccgagac tttcatcgtc ggcactcact ctgcaggcgg 6540

caacggagtt ggatactgct cgtgcgtttc caggtccatg ctgctcaaga tgaaggctca 6600

cattgatccc gagccacacc acgagggatt ggttgttgac accagagatg tggaggagcg 6660

cgtgcacgtc atgcgcaaaa ccaagcttgc acccaccgta gcacacggtg tgttcaaccc 6720

tgaatttggg cctgctgcct tgtccaacaa ggacccgcgc ttgaacgaag gagttgtcct 6780

cgatgaggtc atcttctcca agcacaaggg agacacaaag atgtctgagg aggacaaagc 6840

gctgttccga cgttgcgctg ccgactacgc gtcgcgcttg cacagcgtgc tgggtacagc 6900

aaatgcccca ttgagcattt acgaggcaat caagggcgtc gacggactcg atgccatgga 6960

accagacacc gcacctggcc ttccctgggc cctccagggg aaacgccgtg gtgcgctgat 7020

tgacttcgag aacggcacag tcggacccga ggtcgaggct gccctaaagc tcatggagaa 7080

aagagaatac aagtttgctt gtcagacctt cctgaaggac gagattcgcc cgatggagaa 7140

agtacgtacc ggcaagactc gcattgtcga tgtcttgcct gttgaacaca ttctttacac 7200

caggatgatg attggcagat tttgtgctca aatgcactca aacaacggac cgcaaattgg 7260

ctcggcggtc ggttgcaacc ctgacgttga ttggcaaaga tttggcacac attttgccca 7320

gtacagaaac gtgtgggatg tggactactc ggcctttgat gctaaccact gcagcgatgc 7380

aatgaacatc atgttcgagg aggtgttccg cacagagttt ggcttccacc cgaacgccga 7440

gtggatcctg aagactcttg tgaatacgga acatgcttat gagaacaaac gcattgttgt 7500

tgagggcggg atgccgtctg gctgttccgc gacaagcatc ataaacacaa ttttgaacaa 7560

catttacgtg ctctacgctt tgcgcagaca ctatgaggga gttgagctgg acacttacac 7620

catgatctcc tacggagacg acatcgtggt ggcaagtgat tacgatctgg actttgaggc 7680

tctcaagcct cacttcaaat ctctgggcca aaccatcact ccagctgaca aaagcgacaa 7740

aggttttgtt cttggtcact ccattactga tgtcactttc ctcaaaagac acttccacat 7800

ggattatgga actgggtttt acaaacctgt gatggcctcg aagaccctcg aggctatcct 7860

ctcctttgca cgccgtggga ccatacagga gaagttgacc tccgtggcag gactcgccgt 7920

ccactctgga cctgacgagt accggcgtct ctttgagccc ttccagggtc tctttgagat 7980

tccaagctac agatcacttt acctgcgttg ggtgaacgcc gtgtgcggtg acgcataatc 8040

cctcagatga aacaattggc agaaagactc tgaggcgagc gacaccgtag gagtgaaaag 8100

ctcgaaaggg cttttcccgc ttccacgttc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa       8154

 

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>PCR上游引物的序列L1。

 

<400>2

 

tcatcaaact cctgagccgc 20

 

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>PCR下游引物的序列L2。

 

<400>3

tttccgcctc gtcaagagtc accgcatcat tcaccatct 39

 

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR上游引物的序列R1。

 

<400>4

gatggtgaat gatgcggtga ctcttgacga ggcggaaaa 39

 

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>PCR下游引物的序列R2。

 

<400>5

tgacgaggca cgaggtaggc 20