BPIV3 NM09株全长感染性cDNA克隆的构建及重组病毒的拯救

摘要

根据牛副流感病毒3型(BPIV3)内蒙古分离株(NM09株)的全基因组序列(GenBank No.JQ063064)设计7对引物,以BPIV3NM09株提取的RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增出病毒全长基因组,各个基因片段克隆到PCRBlunt载体并测序,利用生物信息学软件DNAstar中的SeqMan对各片段进行拼接,获得BPIV3NM09全基因序列.利用DNAstar软件中的Seq Builder和在线分析软件NEBcutter,对BPIV3NM09株全基因组序列进行酶切位点分析,找到合适的酶切位点进行连接,并分别在基因组N端和C端分别引入锤头状核酶结构(HamRz)和丁肝病毒核酶结构(HdvRz).同时根据pCR-Blunt载体和pcDNA3.1(+)载体上的多克隆位点次序,将各个BPIV3NM09株基因片段按照一定的先后顺序依次亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建获得BPIV3NM09株全长cDNA克隆pcDNA3.1-NM09.利用脂质体转染法将纯化的全长质粒pcDNA3.1-NM09及辅助质粒pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L共转染BSR细胞,在MDBK细胞上盲传,经RT-PCR、FA或IFA鉴定,成功获得重组BPIV3病毒.本研究为进一步开发基因工程重组疫苗和研究该病毒毒力因子以及分子致病机理奠定了基础.