牛肠道病毒BJ101株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救

摘要

牛肠道病毒(Bovine Enterovirus，BEV)为微RNA病毒科肠道病毒属成员。基因组是不分节段的大小约为7500bp的单股正链RNA。BEV宿主范围广泛，能感染牛、羊，负鼠和海豚等，一般表现为亚临床症状，有时引起腹泻和呼吸道疾病。牛肠道病毒包括牛肠道病毒E型(Bovine Enterovirus E，BEV-E)和牛肠道病毒F型(Bovine Enterovirus F，BEV-F)，BEV-E分为四个亚型，BEV-E1到BEV-E4;BEV-F分为六个亚型，BEV-F1到BEV-F6。牛肠道病毒毒力较弱、能够耐受酸性环境，是很好的候选疫苗载体。本研究分离得到一株BEV BJ101毒株，对其全基因组进行测序并以此为基础成功构建BJ101株的全长感染性cDNA克隆，病毒拯救成功，并分析了拯救病毒的生物学特性，旨在为研究BEV致病机制、研发新型基因工程疫苗提供科学依据。
　　采用RT-PCR方法从北京某牛场有腹泻症状牛的粪便样品上分离到一株牛肠道病毒，命名为BJ101，分离的病毒在MDBK细胞上的TCID50为1×10-6.4/0.1m L，经电镜观察发现其病毒颗粒符合小RNA病毒粒子特征，直径为25nm～30nm，无囊膜，BJ101株的基因组长度为7409bp，其中5'非编码区(UTR)长812bp，3'UTR长72bp，病毒基因组开放阅读框(ORF)全长6525bp，编码区内没有核苷酸数目的变化。对核苷酸序列进行比对分析发现，在5'UTR区，与PS42株、PS83株核苷酸序列相似性最高为84.9％和85.0％，在3'UTR区，与K2577株和SL305株的核苷酸序列相似性最高，均为91.5％。BJ101的VP1、VP2、VP3、和P1与E2属的毒株核苷酸和氨基酸序列的相似性都最高，进化树上处于同一分支，但VP4处与E1属的核苷酸和氨基酸序列的相似性都最高，进化树上处于同一分支。由于BEV的分型主要依据的是VP1的核苷酸和氨基酸序列，所以BJ101株属于E2型，并且在VP4处可能存在与E1型毒株的重组。
　　根据BJ101全长核苷酸序列，去掉载体的T7启动子并仅保留SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将BEV全基因序列分为A、B、C三个片段进行扩增，在A片段的5'端用引物引入T7启动子序列，在B和C两片段重叠部分通过引物引入分子标记EcoRⅤ酶切位点（氨基酸同义突变）。将阳性的GpBSK-BEV质粒线性化，转染BSR-T7细胞系拯救病毒，将获得的病毒在MDBK细胞上接毒，通过细胞病变、遗标记检测、基因组测序、间接免疫荧光等验证显示获得了rBEV。rBEV与亲本毒有相似的TCID50及生长曲线。
　　综上所述，本研究获得了BJ101株的感染性cDNA克隆并能拯救出病毒，为进一步研究BEV的致病机制和研发新型基因工程疫苗提供了技术平台。

目录

声明

摘要

1引言

1．1牛肠道病毒概述

1．1．1牛肠道病毒的形态与基因组结构

1．1．2非编码区功能

1．1．3编码区功能

1．1．4病毒的复制

1．1．5病毒的理化性质

1．1．6牛肠道病毒的分类

1．1．7牛肠道病毒的致病机制

1．1．8牛肠道病毒的流行

1．1．9牛肠道病毒的检测

1．2反向遗传学

1．2．1 RNA病毒的反向遗传学研究

1．2．2反向遗传在肠道病毒中的应用

1．3研究目的与意义

2．1．1病料与细胞

2．1．2质粒与菌株

2．1．3单克隆抗体

2．1．4主要设备和仪器

2．1．5试剂

2．1．6溶液配制

2．2方法

2．2．1牛肠道病毒分离鉴定及全基因组分析

2．2．2牛肠道病毒的感染性分子克隆的构建

3．1病毒的分离

3．2 RT-PCR鉴定

3．3病毒的蚀斑纯化

3．4病毒在MDBK上的TCID50

3．5 BJ101毒株电镜观察

3．6全基因组扩增结果

3．7全基因组序列分析

3．7．2基因组核苷酸序列同源性比较

3．7．3基因组氨基酸序列同源性比较

3．7．4遗传进化分析

3．8病毒全长基因组的克隆

3．9载体的改造

3．10全长cDNA克隆的酶切鉴定

3．11重组质粒线性化

3．12拯救病毒的鉴定

3．12．1拯救病毒的传代

3．12．2遗传标记的鉴定

3．12．3拯救病毒基因组测序

3．12．4 Western Blot结果

3．12．5间接免疫荧光

3．12．6电镜观察结果

4．13拯救病毒的TCID50

4．14病毒的生长曲线

4．1病毒全基因序列测序

4．2 BJ101基因组分析

4．3全长cDNA感染性克隆的构建

4．4病毒拯救

5结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

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