猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-XL株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种高度传染性疾病。为从病毒学角度探讨我国PRRSV的分子致病机制，本论文从河北省新乐市某爆发猪繁殖与呼吸综合征病的猪场中分离出一株PRRSV HB-XL，并对其进行完整基因组测序和分析，揭示该毒株的基因型、基因组特征及遗传变异特点，应用反向遗传操作技术，成功构建出PRRSV HB-XL株的全长感染性cDNA克隆，并拯救出病毒，系统分析了拯救病毒的生物学特性，为进一步深入研究和阐明PRRSV的分子致病机制，构建动脉炎病毒载体和新型基因工程疫苗提供科学依据。
　　从河北省新乐市某猪场采集疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的病料，通过Marc-145细胞传代培养，RT-PCR检测等方法鉴定，确认分离到一株PRRSV，命名为HB-XL株（登录号KP162169）。进一步对其全基因组进行克隆测序，经同源性比较及系统进化树等分析，表明该毒株属于美洲型PRRSV，且与国内流行的高致病性毒株遗传关系较近。与经典美洲株相比，该毒株非结构蛋白Nsp2发生30个不连续氨基酸缺失;其ORF5编码的GP5蛋白的第13位、151位氨基酸均为具有强毒特性的精氨酸(R)，第137位为具有野毒特性的丝氨酸(S);其Nsp2和ORF5基因的独特变异表明该毒株可能是疫苗重组毒株，且较低的致病力和死亡率说明该毒株毒力较弱，说明HB-XL株有可能发展为疫苗株的备选毒株。
　　运用反向遗传操作技术，构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) HB-XL株的全长cDNA克隆，并拯救出病毒，命名为RvHB-XL。对拯救病毒的鉴定结果表明，RvHB-XL能在MARC-145细胞引起典型的PRRSV细胞病变(CPE);拯救病毒的遗传标记能够稳定遗传。病毒生长特性结果显示，RvHB-XL拯救病毒与亲本病毒在Marc-145细胞上具有相似的增殖特性。PRRSV HB-XL感染性克隆的成功构建为进一步研究PRRSV的相关分子致病机制提供了技术平台。
　　综上所述，本研究获得的PRRSV HB-XL株的感染性cDNA克隆及其拯救病毒，为构建动脉炎病毒载体和新型基因工程疫苗创造了有利条件。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 国内外研究概况

1．2 研究目的及意义

1．3 研究内容与技术路线

1．4 目标

2 PRRSV HB-XL株的分离鉴定及全基因组遗传变异分析

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 病料与细胞

2．2．2 载体与菌株

2．2．3 主要试剂

2．2．4 主要仪器

2．3 方法

2．3．1 引物设计合成

2．3．2 病料处理

2．3．3 病毒分离培养

2．3．4 病毒基因组总RNA的提取

2．3．5 反转录合成cDNA

2．3．6 病毒的RT-PCR鉴定

2．3．7 全基因组的扩增和测序

2．3．8 PCR产物回收、连接、转化与阳性克隆的筛选

2．3．9 全基因组序列测定与分析

2．4 结果与分析

2．4．1 病毒分离鉴定

2．4．2 PRRSV HB-XL全基因组的PCR扩增

2．4．3 PRRSV HB-XL基因组特点分析

2．4．4 同源性分析

2．4．5 遗传进化树分析

2．4．6 变异分析

2．5 讨论

2．6 小结

3 PRRSV HB-XL株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救

3．1 前言

3．2 材料

3．2．1 细胞与毒株

3．2．2 载体与菌株

3．2．3 主要试剂

3．2．4 主要仪器

3．3 方法

3．3．1 引物设计与合成

3．3．2 pWSK29质粒酶切位点的改造

3．3．3 PRRSV HB-XL全长cDNA克隆质粒的构建

3．3．4 病毒的拯救

3．3．5 拯救病毒的鉴定

3．4 结果与分析

3．4．1 pWSK29质粒酶切位点的改造

3．4．2 全基因组分片段PCR扩增

3．4．3 PRRSV HB-XL全长cDNA克隆质粒的构建

3．4．4 拯救病毒的鉴定

3．5 讨论

3．6 小结

4 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

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致谢