逆转录病毒载体

摘要： 目的构建一种逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统。方法对逆转录病毒载体进行设计改造,在其两端插入绝缘子序列(insulator),并基于Gal4/UAS基因表达调控系统进行SynNotch门控系统的构建。首先采用逆转录病毒载体分别构建仅含有Gal4-VP64融合蛋白转录调控元件的门控质粒以及含有UAS激活序列的效应质粒,效应质粒使用绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶(luciferase)作为报告基因,共分为6种,其中三种为正向序列设计,将UAS序列以及报告基因正向插入逆转录病毒载体中(5’~3’),分别包括正向无绝缘子、正向单绝缘子、正向双绝缘子;另三种为反向序列设计,将UAS序列以及报告基因反向插入逆转录病毒载体中(3’~5’),分别包括反向无绝缘子、反向单绝缘子、反向双绝缘子。测序成功的质粒进一步通过病毒包装制备病毒载体,包括门控载体和效应载体。PCR法检测逆转录病毒滴度。将病毒载体转导入293T细胞,效应载体单独转导的293T细胞作为未诱导组,门控载体与效应载体共转导的293T细胞作为诱导组,分别通过流式细胞术及荧光素酶化学发光实验检测两组报告基因的表达效率。结果逆病毒载体滴度均在107~108拷贝/mL之间,且不低于阳性对照。流式细胞术的检测结果显示,正向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为95.5%、69.7%、76.2%,诱导后EGFP的表达效率分别为99.9%、95.3%、97.1%。反向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为0.085%、0.610%、7.400%,诱导后EGFP的表达效率分别为59.900%、77.900%、89.500%。荧光素酶化学发光实验的检测结果显示,正向设计的三种效应载体在未诱导的情况下luciferase表达的荧光强度均在104以上,诱导后荧光强度均在105以上;反向设计的三种效应载体在未诱导的情况下luciferase表达的荧光强度均在3×103以下,诱导后荧光强度均在104以上,诱导前后荧光强度比较,P<0.01,其中反向双绝缘子设计诱导后荧光强度可达到105以上。结论成功构建了一种逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统。

摘要： 近日,美国食品药品监督管理局(FDA)已授予实验性程序化T细胞疗法AUTO3治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的孤儿药资格(ODD)。AUTO3是一种自体富集T细胞,经单个逆转录病毒载体修饰表达2个独立的嵌合抗原受体(CAR),分别靶向B淋巴细胞抗原CD19和CD22,并且每个CAR都针对单个靶点活性进行了独立优化。

摘要： Objective:To investigate a modified protocol of establishing mouse Ph + ALL model so as to provide a more convenient and more powerful tool for Ph + ALL studies.Methods:Immature B cells from BALB/c mice were transfected with the Mig190 retrovirus and infused into irradiated syngeneic mice.The immunophenotype was identified by flow cytometry,the BCR-ABL was identified by RT-PCR and Western blot.Leukemia cells isolated from sick mice were re-infused into syngeneic mice without irradiation.Results:The acute lymphoblastic leukemia was established in mice after Mig190 retroviral transfection,the lymphoblasts were observed by blood smears,the immunophenotype of these leukemic cells was CD19 +,and the BCR-ABL was detected by RT-PCR and Western blot,the immunophenotype was conformed as Ph + ALL,the isolated leukemia cells infused into mice rapidly developed B-ALL.Conclusion:A new protocol is established to generate mice with Ph + ALL.This mouse model can provide a more simple and effective tool in comparison with the conversional protocols.%目的:改良建立Ph+急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠模型的方法,为Ph+ ALL提供更加便捷的研究工具.方法:使用Mig190逆转录病毒转染BABL/c小鼠前体B细胞,输注同系小鼠,建立Ph+ ALL模型;应用外周血涂片,流式细胞术鉴定免疫表型,RT-PCR和Western blot方法鉴定BCR-ABL转录和蛋白表达,并分离发病小鼠的白血病细胞进行再次输注.结果:Mig190逆转录病毒转染后小鼠发生急性淋巴细胞白血病,在血涂片观察到原始和幼稚淋巴细胞,免疫分型示白血病细胞CD19+;RT-PCR和Western blot均检测到BCR-ABL,符合Ph+ ALL的免疫表型和分子生物学特征;再次输注未经照射的同系小鼠能迅速发生B-ALL.结论:改良建立的Ph+ ALL小鼠模型,能够为研究Ph+ ALL提供更简便而有效的工具.

摘要： Objective:To explore the inhibitory effect of Tum-5 gene on the tumor growth and its influence in the angiogenesis of hepatocellular carcinoma (HCC),and to illustrate its mechanism involved in antitumorigenesis.Methods:The human HepG2 cells were selected in in vitro experiment and treated with different multiplicity of infection (MOI) (0,1,5,10,25 and 50) of pLXSN and pLXSN-Tum-5 virus particles for 72 h.The proliferation rates of cells in various groups were detected by MTT method.In vivo,the H22 tumor-bearing mouse models were established.The mice were divided into saline group,pLXSN group and pLXSN-Tum-5 group (n=5).The mice in saline group were intratumorally injected with normal saline,and the mice in pLXSN group and pLXSN-Tum-5 group were intratumorally injected with virus particles (MOI =5),5 times every other day.The volumes and weights of transplanted tumor and the weights of mice in various groups were measured.The CD31 expressions in transplanted tumor tissue were detected by immunohistochemical method and the microvessel density (MVD) was calculated.Results:Compared with pLXSN group,the proliferation rates of cells in pLXSN-Tum-5 group after infected with different MOI of virus particles were not significantly different (P＞ 0.05).The volumes and weights of transplanted tumor of the mice in pLXSN-Tum-5 group were significantly smaller than thosein pLXSN group and saline group after intratumoral injection (P＜ 0.05 or P＜ 0.01).The immunohistochemical results showed that there was irregular angiogenesis in each group.Compared with saline group and pLXSN group,the mean value of MVD of the transplanted tumor tissue of the mice in pLXSN-Tum-5 group was significantly decreased (P ＜ 0.05).Conclusion:Tum-5 can exert its antitumor activity by inhibiting the formation of neovascularization in HCC.%目的:探讨肿瘤抑素5 (Tum-5)基因对肝细胞癌的抑制作用及对血管生成的影响,阐明其参与抗肿瘤生成的作用机制.方法:体外实验选择人肝癌HepG-2细胞,采用不同感染复数(MOI)(0、1、5、10、25和50)的pLXSN和pLXSN-Tum-5病毒颗粒感染72 h,MTT法检测各组细胞增殖率.体内构建肝癌H22荷瘤小鼠模型,分为saline组、pLXSN组和pLXSN-Tum-5组,每组5只.saline组小鼠瘤内注射生理盐水,pLXSN组和pLXSN-Tum-5组小鼠瘤内分别注射相应的病毒颗粒(MOI=5),隔日注射,共注射5次.测定各组小鼠移植瘤体积、质量和小鼠体质量,免疫组织化学法检测CD31蛋白在各组小鼠移植瘤组织中的表达,计算微血管密度(MVD).结果:与pLXSN组比较,不同MOI pLXSN-Tum-5组的细胞增殖率差异无统计学意义(P＞0.05);荷瘤鼠瘤内注射结束后,pLXSN-Tum-5组小鼠移植瘤体积和质量均明显小于pLXSN组和saline组(P＜0.05或P＜0.01);免疫组织化学检测,各组小鼠移植瘤内均有形态不规则的新生血管生成,与saline组和pLXSN组比较,pLXSN-Tum-5组小鼠移植瘤组织MVD平均值明显降低(P＜0.05).结论:Tum-5可通过抑制肝癌组织内新生血管的生成发挥抑瘤作用.

摘要： CAR-T细胞作为一种活的个体化治疗药物,其药学研究与评价显著区别于小分子化学药和大分子重组蛋白.CAR-T产品的药学研究表现出原材料的“多样性”、制备工艺的“差异化”和质控策略的“互补性”等特点.申报临床阶段的药学评价重在识别重大风险点,在保证临床用药安全性的前提下,兼顾细胞制品的产品特殊性.本文结合近期国内CAR-T产品药学审评实践,提出此类产品药学评价的一般考虑与评价要点,并就行业共性问题与发补原因展开讨论,以期促进此类产品尽快进入临床,在临床实践中不断改进完善,最终转化成可实际应用的药品.

摘要： 嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)因其在血液肿瘤中的显著疗效已成为肿瘤免疫治疗领域中的国际研究新热点,成为肿瘤治愈新的希望.目前,在CAR-T细胞产品的生产中,通常是利用逆转录病毒载体或慢病毒载体将CAR基因高效地导入T细胞中,但在使用这些病毒载体的同时也带来了CAR-T产品污染复制型逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)的潜在风险.虽然随着病毒载体设计及生产体系的不断改进,这种风险已大大降低,但仍不能完全排除.因此,监管机构要求对于临床使用的慢病毒或逆转录病毒载体、转导的CAR-T细胞产品以及患者均要进行复制型病毒的检测.本文主要通过分析复制型病毒污染检测的必要性、降低复制型病毒污染风险的措施、复制型病毒检测的阶段以及检测方法等方面,提出在CAR-T细胞生产过程中控制RCR/RCL的策略,以供CAR-T细胞产品研发者参考.

摘要： 为了降低实验成本,解决悬浮细胞难转染问题,本研究进行逆转录病毒包装及感染悬浮细胞一白血病细胞的实验.采用磷酸钙转染方法将逆转录病毒质粒MSCV-PIG、Gag-pol与VSVG共转染入293T细胞,通过旋转法将病毒原液与KG-1a白血病细胞共孵育,最后用嘌呤霉素筛选稳定细胞株.逆转录病毒原液感染KG-la细胞48 h后KG-1a细胞的感染效率约为10％.但嘌呤霉素稳筛后,携带逆转录病毒载体的KG-1a细胞阳性率可达85％以上.通过低成本的磷酸钙转染方法获取病毒,采用病毒原液成功感染较难转染的白血病细胞,为做基础研究的科研人员提供借鉴.

摘要： 目的:建立BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型,为研究白血病的发病机制和药物开发提供理想的平台.方法:利用含有pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆转录病毒上清感染6~10周龄C57BL/6供者小鼠的骨髓细胞,移植给致死量射线照射的同种同型受者小鼠,建立BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型;监测移植小鼠的体质量,生存率;流式细胞仪检测小鼠外周血有核细胞GFP表达(代表有核细胞表达BCR/ABL1)和细胞分型;观察小鼠脾脏、肺脏和肝脏等器官大体形态和HE染色变化.结果:移植20 d后,移植小鼠呈现弓背、活动性减少、精神萎靡的状态,体质量明显降低;流式细胞仪检测外周血中出现GFP+细胞,并且随着移植时间的延长,GFP+粒细胞明显增多.移植小鼠的生存率较对照组明显降低.移植小鼠发病后呈现脾脏显著增大、肺出血、肺脏及肝脏出现白色结节和HE染色呈现大量细胞浸润,且小鼠脾脏中有核细胞的80%为GFP+Gr-1+细胞,即BCR-ABL1+粒细胞白血病细胞.结论:利用此方法成功建立了BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型,为研究慢性粒细胞白血病机制和治疗提供了平台.

摘要： 病毒介导的基因转移技术是利用携带外源目的基因的病毒载体、1个或多个包装载体以及包装细胞,模拟病毒的侵染和转移行为,实现将外源目的基因导入宿主细胞的基因转移技术。目前,已建立的比较成熟的病毒基因转移系统包括逆转录病毒、腺病毒、杆状病毒、腺相关病毒和慢病毒系统。这些病毒基因转移系统已在哺乳动物、鸟类和昆虫细胞上得到广泛应用,前三种病毒基因转移系统在海洋脊椎动物鱼类中也已得到很好的应用,而在海洋无脊椎动物中,仅能见到逆转录病毒和杆状病毒基因转移系统的应用报道。本文综述了逆转录病毒和杆状病毒介导的基因转移技术在海洋无脊椎动物中的研究进展,并对其应用前景进行了展望。

摘要： 目的:建立Ph+急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠模型,为Ph+ ALL研究提供工具.方法:用Mig190逆转录病毒转染BABL/c小鼠骨髓细胞产生CML样小鼠,分选CML样小鼠BCR-ABL+B细胞,输注同系小鼠建立Ph+ ALL模型;应用流式细胞术鉴定免疫表型,RT-PCR和Westem blot鉴定BCR-ABL转录和蛋白表达.结果:Mig190逆转录病毒转染后小鼠迅速发生CML样病变,输注来自CML样小鼠的BCR-ABL+B细胞后受鼠均发生急性淋巴细胞白血病,免疫分型显示白血病细胞CD19+;RT-PCR和Western Blot均检测到BCR-ABL,符合Ph+ALL的免疫表型和分子生物学特征.结论:成功开发了一种新型Ph+ ALL小鼠模型的建立方法,能够为研究Ph+ALL提供一有力工具.

摘要： 为了建立通过动物被毛获取蜘蛛拖丝蛋白的方法,本研究利用pIRES2-EGF和PMM载体以及前期获得的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S),构建逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-EGFP.采用磷酸钙法将PMX-2S-IRES-EGFP质粒转染到PlatE细胞并获得重组逆转录病毒.通过小鼠成纤维细胞系NIH3T3检测病毒侵染能力,并采用PCR法检测蜘蛛拖丝蛋白基因在NIH-3T3细胞的整合状况.其结果,成功构建了逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-EGFP;通过感染NIH-3T3细胞测定重组逆转录病毒滴度约为2×105cfu·mL-1；PCR鉴定结果显示,目的基因2S-IRES-EGFP已整合入NIH-3T3细胞基因组中.上述结果为进一步开展通过逆转录病毒转基因法获得表达蜘蛛拖丝蛋白的转基因动物奠定基础.

摘要： 目的 建立携带IL-4RA基因的重组逆转录病毒载体系统. 方法 重组的逆转录病毒载体pLNC-IL-4RA通过质脂体转染PA317细胞进行包装,在两周的G418筛选后,PA317抗性克隆产生并扩增,PA317细胞上清收集后转染NIH3T3细胞进行病毒滴度的测定. 结果：显示含有目的基因的逆转录病毒最高的病毒滴度为1×104CFU/ml。

摘要： 通过试验的方法构建了LM03的逆转录表达载体，筛选出稳定的产毒细胞株，并且通过感染NIH/3T3细胞，用免疫细胞化学染色及Western Blot检测其蛋白表达情况，为下一步开展基因治疗应用奠定了基础。

摘要： 本研究在实验室前期研究的基础上,选取4个有效抑制猪瘟病毒增殖的干扰基因N1、N2、S10和S11,其中N1和N2针对Npro基因,S10针对NS3基因,S11针对NS4A基因,进行逆转录病毒栽体介导的抑制猪瘟病毒增殖的研究.首先包装出重组逆转录病毒,感染PK-15细胞获得稳定表达干扰基因的细胞克隆,然后采用间接免疫荧光、荧光定量PCR和病毒滴度三种方法测定了细胞表达的shRNA抑制猪瘟病毒增殖水平.结果:成功包装出携带干扰基因的重组逆转录病毒,并筛选获得稳定表达干扰基因的PK-15细胞克隆,间接免疫荧光、荧光定量PCR和病毒滴度三种方法测定结果表明接毒后12-60h,与对照细胞相比,荧光比例、病毒基因组的拷贝数和病毒滴度保持较低的水平,比对照细胞低1-2个数量级,48h病毒基因拷贝数抑制倍数分别为149.3,病毒感染滴度抑制倍数分别为143.54.随着时间的延长,抑制作用降低,但是仍有一定的抑制作用.

摘要： 本文构建并包装含有IL-12p40基因的逆转录病毒载体pGCy-mIL-12p40,探讨了其在类风湿关节炎生物治疗中的意义,在类风湿关节炎的免疫机理和免疫应用方面具有十分重要的价值.

摘要： 目的 构建具有拮抗IL-4作用的IL-4变异体(IL-4RA)的表达载体,并通过真核宿主细胞表达变异蛋白. 方法 设计突变引物,从小鼠的PBMC细胞提取总RNA,R-PCR方法扩增目的片断.将该片断构建在真核表达载体上,并在真核细胞BHK-21中表达,通过Eilsa方法检测变异蛋白的表达. 结果 通过测序分析及限制性酶切鉴定,采用RT-PCR成功的完成了IL-4RA的扩增和表达载体的构建,重组载体转染真核细胞后在上清中检测到IL-4RA的表达. 结论 经构建含有目的基因的逆转录病毒载体,能够成功的在真核细胞表达出IL-4RA.

摘要： 禽类生殖系统和胚胎发育的特殊性,使禽类转基因技术的研究落后于哺乳动物.慢病毒载体作为制备转基因家禽基因转移的工具已被证明具有高效性和稳定整合性.本研究用慢病毒载体,采用赤道开窗法将表达GFP重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔制备转基因鸡,通过PCR、RT-PCR、Southern、Western方法鉴定.鉴定阳性的转基因鸡经Tail-PCR分析外源基因的整合位点.转基因阳性鸡(TG)与野生型鸡(WT)交配繁育F1代,荧光显微镜下观察F1代TG鸡组织GFP的表达,F1代阳性鸡与WT鸡交配繁育F2代.成功获得表达GFP的转基因鸡,整合位点分析表明GFP整合到鸡基因组4号染色体.繁育至F2代,在血液与组织中能够检测到外源基因,表明外源基因能稳定遗传,并建立微核心群单元.

摘要： 禽类生殖系统和胚胎发育的特殊性,使禽类转基因技术的研究落后于哺乳动物.慢病毒载体作为制备转基因家禽基因转移的工具已被证明具有高效性和稳定整合性.本研究用慢病毒载体,采用赤道开窗法将表达GFP重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔制备转基因鸡,通过PCR、RT-PCR、Southern、Western方法鉴定.鉴定阳性的转基因鸡经Tail-PCR分析外源基因的整合位点.转基因阳性鸡(TG)与野生型鸡(WT)交配繁育F1代,荧光显微镜下观察F1代TG鸡组织GFP的表达,F1代阳性鸡与WT鸡交配繁育F2代.成功获得表达GFP的转基因鸡,整合位点分析表明GFP整合到鸡基因组4号染色体.繁育至F2代,在血液与组织中能够检测到外源基因,表明外源基因能稳定遗传,并建立微核心群单元.

摘要： 禽类生殖系统和胚胎发育的特殊性,使禽类转基因技术的研究落后于哺乳动物.慢病毒载体作为制备转基因家禽基因转移的工具已被证明具有高效性和稳定整合性.本研究用慢病毒载体,采用赤道开窗法将表达GFP重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔制备转基因鸡,通过PCR、RT-PCR、Southern、Western方法鉴定.鉴定阳性的转基因鸡经Tail-PCR分析外源基因的整合位点.转基因阳性鸡(TG)与野生型鸡(WT)交配繁育F1代,荧光显微镜下观察F1代TG鸡组织GFP的表达,F1代阳性鸡与WT鸡交配繁育F2代.成功获得表达GFP的转基因鸡,整合位点分析表明GFP整合到鸡基因组4号染色体.繁育至F2代,在血液与组织中能够检测到外源基因,表明外源基因能稳定遗传,并建立微核心群单元.

摘要： 禽类生殖系统和胚胎发育的特殊性,使禽类转基因技术的研究落后于哺乳动物.慢病毒载体作为制备转基因家禽基因转移的工具已被证明具有高效性和稳定整合性.本研究用慢病毒载体,采用赤道开窗法将表达GFP重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔制备转基因鸡,通过PCR、RT-PCR、Southern、Western方法鉴定.鉴定阳性的转基因鸡经Tail-PCR分析外源基因的整合位点.转基因阳性鸡(TG)与野生型鸡(WT)交配繁育F1代,荧光显微镜下观察F1代TG鸡组织GFP的表达,F1代阳性鸡与WT鸡交配繁育F2代.成功获得表达GFP的转基因鸡,整合位点分析表明GFP整合到鸡基因组4号染色体.繁育至F2代,在血液与组织中能够检测到外源基因,表明外源基因能稳定遗传,并建立微核心群单元.

摘要： 本发明提供具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域，其中所述促有丝分裂或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。当通过此类病毒载体转导细胞例如T细胞或自然杀伤细胞时，它们被促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白同时活化。

摘要： 衍生自含有缺失gag基因的非灵长类动物慢病毒基因组的逆转录病毒载体，其中gag中的缺失除去了gag编码序列中核苷酸350下游的一个或多个核苷酸。

摘要： 本发明公开了纯化逆转录病毒(逆转录病毒载体)的方法，所述方法包括以下步骤：A)、对含有逆转录病毒(逆转录病毒载体)的细胞培养上清液进行微滤处理，以除去所述细胞培养上清液中的细胞碎片，获得微滤病毒液；B)、对所述微滤病毒液进行核酸酶处理，以将宿主DNA残留降解为小片段DNA，获得酶消化病毒液；C)、将所述酶消化病毒液进行超滤，使所述逆转录病毒(逆转录病毒载体)留在截留液中，收集截留液，获得超滤病毒液；D)、低速离心处理所述超滤病毒液，使所述逆转录病毒(逆转录病毒载体)进行沉淀，收集沉淀，得到未经除菌的病毒。该方法所的逆转录病毒(逆转录病毒载体)产品在保证逆转录病毒液纯度的同时，浓缩病毒液滴度达到107IP/ml，符合下游工艺要求。

摘要： 本发明提供了包装细胞系在生产VSV‑G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒中的用途，其中所述包装细胞系是低密度脂蛋白受体(LDLR)阴性，任选地所述包装细胞系稳定表达VSV‑G。公开了一种制备所述VSV‑G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的方法，以及通过所述方法获得的所述颗粒。

摘要： 本发明公开了一种含HIhh的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用。所述的含HIhh的逆转录病毒载体是将XhoI与NotI双酶切重组载体pCIG-HIhh-IRES-EGFP获得的含HIhh片段，与XhoI与NotI双酶切逆转录病毒载体pSFG获得的大片段连接，经转化，酶切鉴定，测序制备得到的，所述的含HIhh的逆转录病毒颗粒是通过含HIhh的逆转录病毒载体转染包装细胞系293GPG制备的。本发明还涉及上述逆转录病毒载体和逆转录病毒颗粒在制备治疗骨缺陷药物中的应用。本发明的优点在于为骨组织工程解决早期血管化问题提供了一种新方法，为治疗骨缺陷疾病提供了一种新途径。

摘要： 衍生自含有缺失gag基因的非灵长类动物慢病毒基因组的逆转录病毒载体，其中gag中的缺失除去了gag编码序列中核苷酸350下游的一个或多个核苷酸。

摘要： 衍生自含有缺失gag基因的非灵长类动物慢病毒基因组的逆转录病毒载体,其中gag中的缺失除去了gag编码序列中核苷酸350下游的一个或多个核苷酸。

摘要： 本公开涉及包括编码半抗原结合受体和T细胞活化受体的多核苷酸的逆转录病毒载体。所述逆转录病毒载体还可包括转导增强子。还公开了衔接分子以及它们与所述逆转录病毒载体和用所述逆转录病毒载体转导的T细胞结合的用途。

摘要： 本发明公开了纯化逆转录病毒(逆转录病毒载体)的方法，所述方法包括以下步骤：A)、对含有逆转录病毒(逆转录病毒载体)的细胞培养上清液进行微滤处理，以除去所述细胞培养上清液中的细胞碎片，获得微滤病毒液；B)、对所述微滤病毒液进行核酸酶处理，以将宿主DNA残留降解为小片段DNA，获得酶消化病毒液；C)、将所述酶消化病毒液进行超滤，使所述逆转录病毒(逆转录病毒载体)留在截留液中，收集截留液，获得超滤病毒液；D)、低速离心处理所述超滤病毒液，使所述逆转录病毒(逆转录病毒载体)进行沉淀，收集沉淀，得到未经除菌的病毒。该方法所的逆转录病毒(逆转录病毒载体)产品在保证逆转录病毒液纯度的同时，浓缩病毒液滴度达到107IP/ml，符合下游工艺要求。

摘要： 本发明涉及一种构建用于生产携带目的核酸片段的逆转录病毒载体生产细胞的方法及通过所述方法获得的生产细胞。