shRNA

摘要： 构建鸡转化生长因子β1(Tgfβ1)干扰表达载体,在马立克病毒转化的肿瘤细胞系(MDCC-MSB1)中鉴定其抑制表达效果。根据GenBank中鸡Tgfβ1序列以及pG1.2载体序列,设计合成3条干扰鸡Tgfβ1表达的短发夹核糖核酸(shRNA)干扰序列,分别将其插入表达载体pG1.2,构建pG1.2-Tgfβ1干扰表达载体。将构建的质粒转染MDCC-MSB1细胞后,用qRT-PCR和Western blot检测MDCC-MSB1细胞鸡Tgfβ1表达量。研究结果表明:pG1.2载体中被插入了设计合成的鸡Tgfβ1 shRNA干扰序列,构建了pG1.2-Tgfβ1干扰表达载体。pG1.2-Tgfβ1干扰表达载体转染细胞后,鸡Tgfβ1的表达量显著降低。本文构建的鸡Tgfβ1的干扰表达载体,可有效干扰MDCC-MSB1细胞中Tgfβ1的表达。

摘要： 目的:探讨SERPINB3基因与口腔鳞状细胞癌转移的相关性。方法:通过慢病毒干扰技术减弱SERPINB3基因在舌鳞状细胞癌TCA8113细胞中的表达,得到SERPINB3敲低的稳转细胞系,然后进行Western blotting、划痕实验、Transwell实验检测。结果:shRNA沉默SERPINB3基因后发现,SERPINB3基因对舌鳞状细胞癌的转移具有一定的影响。结论:提示SERPINB3基因与舌鳞状细胞癌转移及侵袭能力之间具有一定的相关性,SERPINB3基因有可能成为基因治疗口腔鳞癌的靶点。

摘要： 目的探索来源于脐带间充质干细胞(huc-MSCs)的含有腺病毒-TGF-β1 shRNA的外泌体对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠纤维化肾组织的靶向性和缓解肾间质纤维化的疗效。方法构建单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型;腺病毒-TGF-β1 shRNA转导脐带间充质干细胞,收集其外泌体;采用纳米粒子追踪分析、透射电子显微镜、Western blot法和RT-qPCR法对外泌体及其对TGF-β1的干扰效率进行鉴定;IVIS Lumina系统荧光成像技术分析外泌体在体(in vivo)分布情况;HE染色、Masson染色、TGF-β1免疫组织化学染色(IHC)分析外泌体对UUO大鼠肾间质纤维化的疗效;Western blot法检测大鼠肾组织Collagen I、Fibronectin、α-SMA以及TGF-β1、p-Smad 3和Smad 3的表达情况。结果含有腺病毒TGF-β1 shRNA的外泌体在体外对TGF-β1具有显著的敲低效率(P<0.01)。此外泌体经尾静脉注射至大鼠体内后,大部分聚集于左侧损伤肾脏,具有定向迁移能力。相对于UUO组大鼠而言,经含有腺病毒-TGF-β1 shRNA的外泌体治疗后,能够明显缓解UUO大鼠肾间质纤维化的程度,HE染色和Masson染色显示的肾间质组织胶原纤维沉积显著减少;IHC染色显示TGF-β1表达明显被抑制(P<0.01)。Western blot结果显示,相较于UUO组,外泌体治疗组大鼠纤维化肾组织的Collagen I、Fibronectin和α-SMA表达显著降低(P<0.01);TGF-β1和磷酸化-Smad 3(P<0.01)被显著抑制。结论将huc-MSCs来源的含有腺病毒-TGF-β1 shRNA的外泌体尾静脉注射至UUO大鼠体内,外泌体能够特异性靶向纤维化的肾组织并通过抑制TGF-β1/Smad 3通路修复肾间质纤维化。

摘要： 构建可以稳定敲降Atg7基因的重组慢病毒载体,并使用该载体构建稳定敲降Atg7基因的PK-15细胞系。首先根据GeneBank数据库中Atg7基因的序列设计特异性的干扰序列并构建重组慢病毒载体,包装慢病毒后感染PK-15细胞,通过药物筛选的方式获得稳定敲降Atg7基因的细胞系,最后通过实时荧光定量PCR和Western-blot试验检验细胞系的敲降效果。重组质粒的双酶切结果和测序结果证实,重组载体序列与最初设计序列完全一致;实时荧光定量PCR和Western-blot试验的结果均显示重组质粒pLKO.1-Atg7-shRNA-Puro能够抑制PK-15细胞中Atg7的表达和自噬的发生。上述结果表明,本研究成功构建了重组慢病毒载体pLKO.1-Atg7-shRNA-Puro和稳定敲降Atg7基因的PK-15细胞系,为后续研究Atg7基因的生物学功能以及细胞自噬在宿主抗病毒感染中的重要作用奠定了基础。

摘要： 目的构建SLC6A4基因RNA干扰(RNAi)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,建立慢病毒介导沉默SLC6A4基因的PC12细胞稳转细胞系,检测SLC6A4基因沉默对缺氧诱导的细胞凋亡的影响。方法设计合成3条针对SLC6A4基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,在293T细胞中共转染进行慢病毒包装。转染大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞,荧光显微镜观察GFP荧光,筛选最佳shRNA干扰序列,应用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。应用RT-PCR方法检测SLC6A4基因的表达,Western blot方法检测蛋白5-HTT的表达变化,流式细胞术检测沉默SLC6A4基因对缺氧诱导的PC12细胞凋亡的影响。结果成功构建SLC6A4-shRNA慢病毒载体并转染PC12细胞,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞内SLC6A4基因和蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。结论通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默PC12细胞SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。

摘要： 目的 构建半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)基因短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,探讨其对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖的影响及可能机制.方法 以CysC基因为靶点,设计并合成目标shRNA,构建CysC-shRNA慢病毒载体并进行鉴定、包装及浓缩;后转染A549细胞,并用qRT-PCR检测Cy-sC mRNA水平评估敲除效率;用MTT实验和细胞克隆形成实验检测CysC-shRNA对A549细胞增殖的影响,并用Western Blot检测相关关键蛋白变化情况.结果 重组慢病毒感染A549细胞,72 h后于荧光显微镜下观察CysC-shRNA组和Ctr-shRNA组GFP表达情况,发现CysC-shRNA组GFP表达水平明显低于Ctr-shRNA组.用qRT-PCR检测各组CysC mRNA水平评估沉默效果,CysC-shRNA组、Ctr-shRNA组和空白对照组CysC mRNA水平比较差异有统计学意义(P0.05).结论 靶向下调CysC可明显抑制NSCLC细胞增殖,与PI3K/Akt信号通路相关.

摘要： 目的 构建大鼠shRNA-Slfn5重组腺病毒载体并观察在内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率.方法 根据Rat Slfn5基因的mRNA序列设计合成siRNA片段5个,分别克隆到pDKD-CMV-U6-shRNA上转入大肠杆菌感受态细胞,PCR筛选转化子,阳性克隆进行测序;利用Admax系统选取目的穿梭质粒shRNA-Slfn5(5)包装和扩增重组腺病毒shRNA-Slfn5及病毒滴度测定;利用Slfn5过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签,通过Western blot法检测Slfn5过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag表达,观察靶点质粒对Slfn5表达的影响;最后用病毒感染EPCs并用绿色荧光蛋白量检测转染效率.结果 经测序验证5组目的质粒构建成功;重组腺病毒质粒shRNA-Slfn5(1)、shRNA-Slfn5(4)、shRNA-Slfn5(5)可明显抑制Flag蛋白的表达;shRNA-Slfn5病毒滴度为3.95×1010 PFU/mL;EPCs的转染效率为(85.64±2.58)％.结论 构建了shRNA-Slfn5重组腺病毒载体,其在EPCs转染效率高.

摘要： 目的 探讨靶向沉默Zwilch对人皮肤恶性黑素瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法 通过感染shRNA慢病毒靶向沉默A375细胞Zwilch的表达及作用,实时荧光定量PCR及Western blotting检测其沉默效果;采用CCK-8和Annexin V/PI染色分别检测靶向沉默Zwilch对A375细胞的增殖及凋亡的影响.结果 慢病毒感染72 h后,sh-Zwilch细胞的Zwilch mRNA及蛋白表达水平均显著下降(P＜0.05),shRNA慢病毒靶向沉默A375中Zwilch的表达和作用与空白组比较,sh-Zwilch组细胞活性随时间显著下降(P＜0.05),凋亡比例明显上升(P＜0.05).结论 靶向沉默Zwilch能够有效抑制人皮肤恶性黑素瘤细胞增殖并诱导其凋亡,从而有望成为其基因靶向治疗的一种新靶点和新策略.

摘要： 目的 研究携Pik3cb shRNA的磁性纳米微泡在磁场和超声双重作用下,对受损伤血管壁中平滑肌细胞的影响.方法 构建携Pik3cb shRNA的磁性纳米微泡,检测其粒径和Zeta电位.建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型,随机分为磁性纳米微泡组和转染对照组.2周后麻醉处死取损伤处血管进行HE染色和免疫组化ki67染色观察受损伤血管内膜增生的程度和平滑肌细胞的增殖情况.结果 制得的携shRNA的磁性纳米微泡的平均粒径为(1.75±0.32)μm,Zeta电位为(10±0.79)mV.磁性纳米微泡组的内膜增厚程度和平滑肌细胞的增殖程度较转染对照组减轻.结论 成功构建了携Pik3cb shRNA的磁性纳米微泡,在磁场和超声双重作用下,可以实现其对平滑肌细胞的靶向高效转染,发挥抑制血管再狭窄的作用.

摘要： 目的 探讨shRNA沉默软骨素聚合因子(ChPF)基因对脑胶质瘤细胞活性的影响及可能作用机制.方法 使用携带有靶向ChPF基因shRNA(ChPF-shRNA)的重组慢病毒转染人脑胶质瘤A172细胞,RT-PCR和Western印迹检测细胞中ChPF mRNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞周期及凋亡水平.进一步使用单核细胞趋化蛋白(CCL2)-shRNA转染人脑胶质瘤A172细胞,RT-PCR和Western印迹检测细胞中CCL2、ChPF mRNA和蛋白表达水平.结果 ChPF-shRNA组ChPF mRNA和蛋白相对表达量明显低于空白对照组和Nc-shRNA组(P0.05).结论 ChPF基因表达下调可能通过调控CCL2来抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭,促进细胞凋亡.

摘要： 本试验将靶向猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.结果表明本试验所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.

摘要： 本试验将靶向猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.结果表明本试验所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.

摘要： 本试验将靶向猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.结果表明本试验所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.

摘要： 本试验将靶向猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.结果表明本试验所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.

摘要： 本研究根据牛轮状病毒(Bovino rotavirus，BRV)的NSP4基因序列，设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89，利用脂质体介导法，将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞，包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV，以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照，48h后与LacZ shRNA对照比较，RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明，针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明，在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中，病毒滴度分别是对照组的50%、20%和1 0%.上述实验结果表明，针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因，并且能阻断牛轮状病毒增殖.

摘要： 本研究根据牛轮状病毒(Bovino rotavirus，BRV)的NSP4基因序列，设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89，利用脂质体介导法，将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞，包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV，以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照，48h后与LacZ shRNA对照比较，RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明，针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明，在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中，病毒滴度分别是对照组的50%、20%和1 0%.上述实验结果表明，针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因，并且能阻断牛轮状病毒增殖.

摘要： 本研究根据牛轮状病毒(Bovino rotavirus，BRV)的NSP4基因序列，设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89，利用脂质体介导法，将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞，包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV，以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照，48h后与LacZ shRNA对照比较，RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明，针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明，在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中，病毒滴度分别是对照组的50%、20%和1 0%.上述实验结果表明，针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因，并且能阻断牛轮状病毒增殖.

摘要： 本发明涉及包含GM‑CSF基因、Flt3L‑TRAIL融合基因、抑制TGF‑β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物。

摘要： 本发明公开了一种表达含有CTLA‑4阻遏分子的外泌体的多能干细胞或其衍生物。多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CTLA‑4阻遏分子的表达序列及外泌体加工合成基因，其能表达含有CTLA‑4阻遏分子的外泌体。多能干细胞或其衍生物表达的CTLA‑4阻遏分子被外泌体包裹后，外泌体携带CTLA‑4阻遏分子与靶细胞结合，释放其包含的CTLA‑4阻遏分子，从而阻断CTLA‑4通路，解除抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，其能够有效清除肿瘤细胞。

摘要： 本发明公开了一种表达靶向BTLA的shRNA和/或shRNA‑miR的多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向BTLA的shRNA和/或shRNA‑miR的表达序列。本发明提供的多能干细胞或其衍生物表达靶向BTLA的shRNA和/或shRNA‑miR被外泌体包裹后，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断BTLA，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

摘要： 本发明公开了一种表达靶向IgE的shRNA和/或shRNA‑miR的多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向IgE的shRNA和/或shRNA‑miR的表达序列。本发明提供的多能干细胞或其衍生物表达靶向IgE的shRNA和/或shRNA‑miR被外泌体包裹后，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，进而将其释放，从而抑制IgE表达可用于治疗过敏、哮喘等及相关疾病。

摘要： 本发明公开了一种表达靶向B7‑H4的shRNA和/或shRNA‑miR的多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7‑H4的shRNA和/或shRNA‑miR的表达序列。本发明提供的多能干细胞或其衍生物表达靶向B7‑H4的shRNA和/或shRNA‑miR被外泌体包裹后，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断B7‑H4，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

摘要： 本发明公开了一种表达靶向PCSK9的shRNA和/或shRNA‑miR的多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向PCSK9的shRNA和/或shRNA‑miR的表达序列。本发明提供的多能干细胞或其衍生物表达靶向PCSK9的shRNA和/或shRNA‑miR被外泌体包裹后，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，进而将其释放，从而抑制PCSK9表达，达到降血脂的效果。

摘要： 本发明公开了一种表达靶向IL‑4 Rα的shRNA和/或shRNA‑miR的多能干细胞，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向IL‑4 Rα的shRNA和/或shRNA‑miR的表达序列。本发明提供的多能干细胞或其衍生物表达靶向IL‑4 Rα的shRNA和/或shRNA‑miR被外泌体包裹后，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，进而将其释放，从而抑制IL‑4 Rα表达可用于治疗过敏、哮喘等及相关疾病。

摘要： 本发明公开了一种表达靶向B7‑H5的shRNA和/或shRNA‑miR的多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7‑H5的shRNA和/或shRNA‑miR的表达序列。本发明提供的多能干细胞或其衍生物表达靶向B7‑H5的shRNA和/或shRNA‑miR被外泌体包裹后，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断B7‑H5，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

摘要： 本发明涉及包含GM‑CSF基因、Flt3L‑TRAIL融合基因、抑制TGF‑β表达的shRNA和抑制HSP表达的shRNA的抗肿瘤组合物。

摘要： 本发明公开一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法，本发明针对Rho激酶信号通路的关键因子RhoB设计了shRNA序列，并构建了相应的shRNA慢病毒沉默载体。所述shRNA序列包含序列5’-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3’。通过实验结果证实本发明的shRNA能够显著沉默RhoB的表达。鉴于RhoB作为一种潜在的肺动脉高压治疗靶点，因此本发明的提供的RhoB的shRNA及其相关生物试剂，可用于研究和制备治疗肺动脉高压的相关疾病的药物。