慢病毒载体

摘要： 【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号:NZ_CP081489.1)设计引物,并采用PCR扩增T7 RNAP基因片段,将其克隆至慢病毒载体中,构建pCDH-CMV-T7 RNAP重组质粒。筛选阳性克隆及测序鉴定后,利用脂质体将包含重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP的包装系统和辅助包装质粒共转染至HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装及纯化,获得高病毒滴度的重组慢病毒。将收集的病毒液分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1、5、10和20感染BHK-21细胞,72 h后观察荧光情况,筛选最佳MOI。将重组慢病毒在最佳MOI条件下感染BHK-21细胞,通过绿色荧光蛋白copGFP的表达观察感染细胞的阳性率。使用4μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选物进行多轮筛选,最终筛选得到BHK-21-T7 RNAP细胞株。进一步对所筛选的细胞株设计3对检测引物进行RT-PCR检测,并通过检测试验组与空白对照组细胞中海肾荧光素酶(hRluc)报告基因的活性差异来反映T7 RNAP驱动T7启动子下游基因的能力。【结果】本研究成功扩增了大肠杆菌BL21(DE3)细胞基因组中T7 RNAP基因,成功构建重组慢病毒载体,并获得了滴度为1.0×10^(8)TU/mL的重组慢病毒。成功筛选到BHK-21-T7 RNAP细胞株,此重组细胞株经RT-PCR扩增能够检测到T7 RNAP的特异性DNA序列。将含有T7启动子驱动的hRluc的质粒(pT7-hRluc)转染此细胞株后发现,BHK-21-T7 RNAP细胞株中hRluc的活力与空白对照组BHK-21细胞相比极显著升高(P<0.01)。【结论】本研究获得了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株,且所筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株中的T7 RNAP能够驱动pT7启动子下游基因hRluc的转录,研究结果为RNA病毒的反向遗传学平台建立奠定了细胞基础。

摘要： 目的构建过表达大鼠Ctnnb1 (catenin beta1)慢病毒载体,建立过表达Ctnnb1的大鼠间充质干细胞(MSC)稳转株,为后续研究过表达Ctnnb1的MSC产生的外泌体对老年慢性阻塞性肺疾病相关肺动脉高压(COPD-PH)的作用和机制奠定基础。方法 PCR扩增Ctnnb1基因全序列,将序列插入PGMLV-18844:PGMLV-CMV-MCS-3×Flag-PGK-Puro载体,构建PGMLV-CMV-Rat;tnnb1-3×Flag-PGK-Puro慢病毒表达质粒,质粒瞬转293细胞后,使用Western Blot验证其过表达效率。再将构建的慢病毒载体和包装质粒共转染293细胞,包装病毒。包装的过表达慢病毒和阴性对照病毒感染大鼠MSC,再次使用Western Blot测定其过表达效果。结果经测序分析,本研究成功构建了PGMLV-CMV-Rat;tnnb1-3×Flag-PGK-Puro慢病毒载体。Western Blot结果提示,该慢病毒载体成功转染293细胞,构建的载体能高效过表达Ctnnb1;过表达Ctnnb1的慢病毒感染大鼠MSC后,得到过表达Ctnnb1基因的大鼠MSC稳转株。结论本研究成功构建过表达Ctnnb1慢病毒及其稳转大鼠MSC株。

摘要： 为了建立PrxⅡ敲降的稳定细胞系并探究人肝细胞中PrxⅡ对过氧化氢(H_(2)O_(2))的清除作用,使用空白慢病毒载体和含Sh-PrxⅡ的慢病毒载体侵染人肝细胞系QSG-7701,利用流式细胞仪以及荧光显微镜检测转染效率,蛋白免疫印迹检测PrxⅡ蛋白信号,然后用不同浓度的H_(2)O_(2)处理Scramble(空白慢病毒载体转染组)和Sh-PrxⅡ(含Sh-PrxⅡ的慢病毒载体),MTT assay检测细胞存活率。结果显示PrxⅡ被敲降,同时随着H_(2)O_(2)的处理浓度的增高,PrxⅡ敲降后的细胞存活率明显降低。由此得出结论,Prx稳定敲降的QSG-7701细胞系成功建立,并且敲降PrxⅡ后QSG-7701细胞的抗氧化作用降低。

摘要： 为了构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的Marc-145细胞系,以PRRSV全长感染性克隆为模板,通过PCR方法扩增PRRSV N基因,将N基因克隆到慢病毒载体中,获得重组质粒pLenti-CMV-N,利用三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,将慢病毒颗粒转导至Marc-145细胞,用潮霉素B初步筛选阳性细胞,采用终点稀释的方法筛选出稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系。通过的PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,IFA和Western blot试验验证了N蛋白在细胞系中稳定表达。为此,我们成功获得了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系。

摘要： 目的构建眼发育缺失1(Eya1)基因慢病毒载体,并探讨过表达Eya1对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的鼠多巴胺能神经元细胞MES23.5凋亡的影响。方法构建过表达Eya1基因的慢病毒,并感染MES23.5细胞,筛选稳定表达Eya1的细胞株;6-OHDA药物处理诱导MES23.5多巴胺能细胞损伤模型,分为对照组、空载体组、过表达Eya1组;采用CCK-8法检测细胞活力、细胞凋亡Hoechst染色(Hoechst 33258)和Western blot检测过表达Eya1对细胞凋亡的影响。结果酶切电泳显示目的基因重组至慢病毒载体,测序结果表明构建的Eya1基因过表达载体与Eya1基因编码序列完全一致;CCK-8显示6-OHDA药物处理后过表达Eya1组的细胞活力水平高于对照组(P<0.05);Hoechst 33258染色显示过表达Eya1组的细胞核浓缩聚集水平低于对照组;且过表达Eya1组中Bcl-2蛋白的表达高于对照组(P<0.05),Bax蛋白的表达低于对照组(P<0.05)。结论成功构建了过表达Eya1的MES23.5细胞株,Eya1通过调控Bcl-2、Bax蛋白表达,从而拮抗6-OHDA诱导的MES23.5多巴胺能细胞的凋亡。

摘要： 目的构建β1肾上腺素能受体(ADRB1,1165G>C)基因多态性稳定过表达的心肌细胞模型,为其在高血压、心力衰竭及不良心血管事件中的功能及机制研究奠定了实验基础。方法将ADRB1cDNA克隆片段和PMT399载体连接后获得pSE4077和pSE4078重组质粒,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集上清液感染H9C2细胞,利用定量聚合酶链式反应(QPCR)方法筛选稳转细胞株。结果pSE4077和pSE4078组的ADRB1蛋白表达水平显著高于未转染的细胞对照组和转染空病毒的对照组,且pSE4078组也高于pSE4077组。结论基于H9C2细胞株的ADRB1基多态性稳定过表达模型构建成功。

摘要： 目的 利用慢病毒载体构建稳定过表达miR-155的AB 8/13细胞株(AB 8/13-LV-has-miR-155)和稳定敲低miR-155的AB 8/13细胞株(AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton),为研究miR-155在足细胞焦亡和肾脏疾病中的作用奠定基础。方法 体外培养AB 8/13细胞,使用不同浓度嘌呤霉素刺激AB 8/13细胞48 h,在光学显微镜下观察AB 8/13细胞的死亡情况;使用LV-has-miR-155阴性对照病毒、LV-has-miR-155-5p inhibiton阴性对照病毒分别感染AB 8/13细胞,在荧光显微镜下观察AB 8/13细胞的状态和感染效率;在嘌呤霉素筛选出稳定细胞株后,通过实时荧光定量PCR法检测稳定细胞株的miR-155表达量。结果 在3.5μg/mL及以上浓度的嘌呤霉素作用于AB 8/13细胞48 h后,所有细胞全部死亡。LV-has-miR-155慢病毒感染AB 8/13细胞的感染效率达到80%的最佳条件为在含HiTransG P的完全培养基中进行感染,MOI为10;LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒感染AB 8/13细胞的感染效率达到80%的最佳条件为在含HiTransG A的完全培养基中进行感染,MOI为100。qRT-PCR结果显示AB 8/13-LV-has-miR-155细胞株的miR-155表达量明显升高,AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton细胞株的miR-155表达量降低。结论 成功构建AB 8/13-LV-has-miR-155稳定细胞株和AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton稳定细胞株,为进一步探究miR-155在人足细胞焦亡中的作用机制奠定基础。

摘要： 目的:验证遗传性釉质发育不全(amelogenesis imperfecta,AI)相关基因FAM83H突变(c.1354C>T,p.Gln452*)后的功能。方法:构建FAM83H突变(c.1354C>T,p.Gln452*)和空白对照野生型慢病毒载体;应用转染技术感染人胚肾上皮细胞(HEK293T),对转染后的细胞形态进行观察;用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测细胞中FAM83H信使RNA(mRNA)的表达水平;细胞免疫荧光技术(immunofluorescence technique)检测转染后的细胞中FAM83H蛋白细胞定位的改变。结果:慢病毒转染HEK293T细胞后,细胞形态无明显变化,FAM83H突变细胞中,mRNA表达低于对照组;细胞免疫荧光结果显示,FAM83H突变后,胞内定位改变,主要在胞核表达,少量表达于细胞质,提示FAM83H胞内作用位点的改变可能导致釉质钙化不全。结论:突变FAM83H改变了其蛋白在HEK293T细胞中的表达及定位,为进一步理解FAM83H突变导致AI的发病机制提供了依据。

摘要： 【目的】研究旨在分析小鼠Nr1d1基因序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建并筛选出干扰效率最优的小鼠Nr1d1基因慢病毒干扰载体。【方法】对小鼠Nr1d1核苷酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析;设计合成4对小鼠Nr1d1基因的特异性shRNA序列和1对无义序列;分别将它们连接至pCD513B-U6慢病毒干扰载体上构建重组质粒,通过PCR及测序鉴定,分别将鉴定正确的重组质粒命名为pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-1(sh1)、pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-2(sh2)、pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-3(sh3)、pCD513B-U6-shRNA Nr1d1-4(sh4)和pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-NC(shn);将重组质粒和辅助包装质粒共转染至HEK293T细胞中,收毒后将病毒颗粒感染小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞);使用荧光显微镜观察HEK293T细胞和NIH3T3细胞中的绿色荧光蛋白表达情况;Western Blotting检测并筛选出干扰效率最佳的载体。【结果】小鼠Nr1d1基因编码区序列全长1848 bp,编码615个氨基酸,其中丝氨酸含量最高(14.0%),色氨酸含量最低(0.5%);小鼠Nr1d1基因核苷酸序列与大鼠、人及黑猩猩的相似性分别为94.8%、90.0%和90.0%;NR1D1蛋白可能与ARNTL、NCOR1和NPAS2等蛋白发生相互作用。成功构建4个小鼠Nr1d1基因的慢病毒干扰载体,将它们转染至HEK293T细胞后观察到绿色荧光蛋白表达;将病毒颗粒感染NIH3T3细胞后观察到绿色荧光蛋白表达;与对照组shn相比,慢病毒干扰载体sh2、sh3、sh4均能有效下调NR1D1蛋白的表达,且sh3的干扰效率最高。【结论】研究成功构建了小鼠Nr1d1基因的慢病毒干扰载体,筛选验证了其在NIH3T3细胞中的干扰效率,并对小鼠Nr1d1基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析,为进一步研究小鼠Nr1d1基因的生物学功能提供了前期理论基础和关键材料支撑。

摘要： 目的:研究慢病毒沉默过氧化物还原酶4(peroxiredoxin 4,PRDX4)对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响,并探讨其分子机制。方法:采用shRNA干扰技术敲低肺癌细胞系A549中PRDX4的表达,Western blot和qRT-PCR验证转染效果;划痕愈合实验检测细胞迁移能力;Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力;Western blot分析p-ERK1/2、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。结果:成功构建沉默PRDX4的肺癌细胞系;慢病毒感染后A549细胞PRDX4蛋白和mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05);与BC组和NC组相比,Sh组细胞迁移、侵袭能力显著降低(P<0.05);与BC组和NC组相比,Sh组细胞p-ERK1/2、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平显著降低。结论:沉默PRDX4可能通过ERK信号通路抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。

摘要： 为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDVE0基因序列(AJ133739.1),构建包含IgK信号肽的pZJ-CMV-eGFP-IgK-E0重组质粒和不含信号肽的pZJ-CMV-eGFP-E0重组质粒.将其采用PEI方法转染HEK-293T细胞包装慢病毒并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行westernblot检测蛋白表达.通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因已正确整合到慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达.本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳细胞中的表达及其免疫原性研究及基因工程疫苗的研发奠定基础.

摘要： 目的:脊髓损伤(SCI)是一种病情严重、预后不良的中枢神经系统疾病,当前对脊髓损伤的治疗,并没有十分完善的方法.脊髓损伤后由于神经细胞的大量死亡,以及髓鞘和胶质瘢痕释放的髓磷脂相关抑制因子的存在,导致无法恢复应有的神经功能.因此,如何促进脊髓损伤后神经轴突的再生,是当前脊髓损伤修复的主要目标.干细胞移植补充损伤的神经细胞,同时拮抗轴突内存在的生长抑制因子已成为治疗脊髓损伤的有效手段。rn 方法:SD大鼠胎鼠来源的NSCs培养并鉴定，荧光显微镜下观察及流式细胞术检测以确定Lingo-1 shRNA慢病毒载体的最佳复染指数(MOI)Hochest染色检测细胞凋亡。rn 结果:1.MOI=20是体外转染大鼠NSCs的最佳复染指数。2.Lingo-1 shRNA慢病毒载体能下调Lingo-1和RhoA蛋白的表达，且加入Lingo-1 shRNA慢病毒组的NeuN的蛋白表达明显增加，而CNPase和GFAP的蛋白表达无明显变化。3.Notch信号通路抑制剂DAPT能使Notch通路的有效成分NICD的表达明显下调，下游Hesl,Hess等的基因表达也受到抑制，Lingo-1,NeuN,CNPase和GFAP的蛋白表达均增加。rn 结论:1.Lingo-1 shRNA慢病毒载体能成功转染大鼠的神经干细胞，并促进其向神经元的分化，其作用机制可能与抑制下游RhoA信号通路的转导相关。2.DAPT能抑制大鼠神经干细胞的Notch信号通路，并促进其向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的分化。

摘要： 目的：探讨Let-7b过表达和Let-7b抑制慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化中的作用.rn 方法：构建Let-7b过表达和Let-7b抑制慢病毒载体并感染大鼠MSCs,筛选最适感染复数(MOI);实验分未感染组、感染组1(感染LV-rno-Let-7b-up)、感染组2(感染LV-rno-Let-7b-inhibition)、阴性对照组(感染空病毒);采用法舒地尔诱导感染后大鼠MSCs分化为神经元细胞.倒置荧光显微镜下观察MSCs感染后荧光表达情况;采用免疫细胞化学染色检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经微管结合蛋白(MAP-2)的表达变化;PT-PCR检测MAP-2mRNA的表达变化;MTT法检测细胞存活率.rn 结果：倒置显微镜下观察大鼠LV-rno-Let-7b-up和LV-rno-Let-7b-inhibition慢病毒载体感染成功,MOI值为10,感染3d时大鼠LV-rno-Let-7b-up慢病毒感染率最高,细胞存活率较高,感染率可达(92.1±4.3)％;MOI为20,感染5d时大鼠LV-rno-Let-7b-inhibition慢病毒感染率最高,细胞存活率较高,感染率可达(90.3±4.2)％.法舒地尔可以诱导MSCs向神经细胞分化,感染组1诱导MSCs为神经细胞显著高于阴性对照组和感染组2,NSE、MAP-2表达率明显高于阴性对照组和感染组,差异有统计学意义(P＜0.05).rn 结论：结论LV-rno-Let-7b-up可更高效感染大鼠MSCs,感染LV-rno-Let-7b-up后大鼠MSCs经法舒地尔诱导向神经细胞分化比率增加.

摘要： 目的：外周T细胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphomas,PTCLs)源于成熟的胸腺后淋巴细胞,是一类少见的生物学行为及临床表现高度异质性疾病,预后差.包装EZH2基因RNA干扰(RNA interfernce,RNAi)慢病毒载体,可以为今后相关实验研究奠定基础. 方法：EZH2-shRNA质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装.病毒载体转染Hut78细胞后,观察感染效率,用RT-PCR和Western blot检测EZH2基因mRNA和蛋白的表达水平. 结果：功包装慢病毒表达载体,感染Hut78细胞,效率在95％以上.经RT-PCR和Western blot检测,结果显示EZH2基因在靶细胞中的表达水平降低. 结论：功包装并鉴定EZH2基因RNAi慢病毒表达载体.

摘要： 通过构建siRNA-survivin慢病毒载体,对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞进行感染,探索survivin对高肺血流性肺动脉高压肺动脉平滑肌细胞增殖的调控作用.结果表明Survivin在高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞上表达。siRNA-survivin慢病毒载体对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞进行体外干扰，能抑制肺动脉平滑肌细胞增殖。

摘要： 本研究旨在通过慢病毒载体系统将EAVGP3/GP4分别转入Marc-145细胞中,建立能够稳定表达EAVGP3/4的Marc-145细胞系.采用PCR方法从EAV感染性克隆上扩增相应的病毒基因,通过酶切连接构建pLenti-EAV GP3/4-CMV-Hygro.将重组质粒与慢病毒包装质粒VSVG和psPAX2共转染293T细胞,包装表达EAV GP3/4的慢病毒,并用其感染Marc-145细胞.采用潮霉素B和终点稀释法筛选出稳定表达EAV GP3/4的Marc-145细胞系.为后续EAV基本结构蛋白,嵌合病毒的研究以及动脉炎病毒细胞嗜性的研究提供条件.

摘要： 目的：本研究通过慢病毒载体系统构建了稳定表达鸡BCRP的MDCK细胞系MDCK-chBCRP,为鸡BCRP底物筛选及药物间相互作用研究奠定基础. 方法：试验首先构建含鸡BCRP慢病毒的表达载体并转染293T细胞得到含鸡BCRP的慢病毒.所得病毒感染MDCK细胞,经含1μg/mL的嘌呤霉素培养液筛选后得到稳定表达鸡BCRP转运体的MDCK细胞模型MDCK-chBCRPo Western Blot、荧光显微镜和流式法检测BCRP蛋白表达.对BCRP经典底物米托蒽醌的敏感性及蓄积能力进行蛋白功能的验证.最后运用构建好的细胞系对鸡常用药物进行BCRP底物的筛选. 结果：成功构建了含鸡BCRP慢病毒的表达载体,并通过转染293T细胞后获得滴度为2.77x106IU/mL的慢病毒.Western Blot、荧光显微镜和流式法检测结果显示鸡BCRP蛋白高表达于MDCK细胞系.米托蒽醌的敏感性及蓄积能力实验结果显示,转染BCRP基因后MDCK细胞对米托蒽醌耐药性明显提高(P＜0.01),并且BCRP蛋白能显著高效外排BCRP底物米托蒽醌(P＜0.05),显示良好的生物活性功能.底物筛选结果显示替米考星、氟苯尼考的净外排率大于2,可能是是鸡BCRP底物,恩诺沙星、阿莫西林的净外排率小于2,可能不是鸡BCRP底物. 结论：成功构建了稳定表达鸡BCRP的MDCK细胞系,并可用于鸡BCRP底物的筛选.

摘要： 目的：构建人miR-637慢病毒过表达载体,建立稳定过表达miR-637的甲状腺癌细胞株TPC-1细胞株,检测其对细胞增殖的影响. 方法：设计针对miR-637前体的过表达基因片段,应用聚合酶链反应法(PCR)扩增目的基因片段,通过基因重组技术将目的基因片段插入GV369慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序和比对分析,构建GV369-miR-637慢病毒表达载体.用慢病毒毒液感染TPC-1,建立稳定过表达miR-637的TPC-1细胞株.荧光显微镜下观察GV369-miR-637慢病毒表达载体的转染效果,RT-PCR检测GV369-miR-637-TPC-1、GV369-NC-TPC-1和TPC-1三组细胞中miR-637的表达水平,CCK-8检测各组细胞的增殖能力. 结果：经限制性内切酶鉴定及DNA测序分析,成功构建GV369-miR-637慢病毒表达载体质粒.GV369-miR-637-TPC-1和GV369-NC-TPC-1细胞在荧光显微镜下均发出绿色荧光,并且转染效率高.与对照组比较,GV369-miR-637-TPC-1细胞中miR-637的表达水平显著提高,其增殖能力受到抑制. 结论：成功构建过表达miR-637的TPC-1细胞株,其抑制细胞增殖,为进一步探讨miR-637在甲状腺乳头状癌中作用与分子生物学机制奠定基础.

摘要： RNAi作为新兴的基因阻断技术，在人类基因功能的研究、基因治疗方面已经广泛应用本研究选择慢病毒载体感染靶细胞，慢病毒载体较其他病毒载体具有以下特点：①感染能力强，对分裂细胞和非分裂细胞均具有较强的感染能力，特别是对神经元细胞具有较好的感染效果;②整合能力强，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主的染色体上，从而达到持久性基因表达。综上所述，本实验中，慢病毒介导的shRNA沉默PTEN促进体外培养神经元轴突延伸和生长，同时损伤局部注射慢病毒载体有助于大鼠脊髓损伤周围轴突再生和突触形成明显，运动和感觉功能恢复得到明显改善。总之，PTEN沉默将为治疗SCI提供新的治疗靶点。

摘要： 竹黄菌主要寄生于箭竹属和短穗竹属竹子植物.可用于治疗虚寒胃病、风湿性关节炎、气管炎、百日咳、坐骨神经痛、跌打损伤及贫血头痛等病症.竹黄菌素主要从天然竹黄中提取,与金丝桃素结构相似,许多学者对其比较研究表明,两者具有类似的作用机理,均是通过光照激活产生活性氧从而达到治的目的,在医领域具有抗肿瘤的功能和抗HIV、HSV等病毒的功能.因在竹黄菌Shiraia sp.SUPERH-168中缺乏有效的表达系统,使得该菌仍停留在发酵优化、纯化及其医药应用领域,然而其合成竹红菌素的代谢机理研究甚少.另一方面,随着高通量技术的快速发展,竹黄菌全基因组序列已测序,合成竹红菌素代谢基因簇也相应的被注释.因此,目前有必要在竹黄菌中建立有效表达系统,为解析竹红菌素代谢途径奠定分子基础.rn 本研究运用聚乙二醇/CaCl2转化技术，在竹黄菌SUPERH-168建立了含潮霉素与绿色荧光蛋白筛选标记的慢病毒表达系统。该过程主要包括原生质体制备、聚乙二醇/CaC12转化及阳性克隆子筛选。从酶种类、酶量、酶解温度、和渗透压稳渗剂及浓度等5个方面优化原生质体制备条件。结果表明:“81.25U/ml破壁酶+5mg/mL崩溃酶+5mg/mL葡聚糖酶”酶组合，抱子菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度30°C,酶液pH5.8、以0.6mol/L MgS04·7H2O为渗透压稳定剂制备原生质体最好，原生质体产率为5×106/g。表达质粒经聚乙二醇/CaCl2转化后，在含500μg/mL潮霉素PDA，挑选克隆子，荧光显微镜下，观测到较强的绿色荧光型号，野生菌SUPER-H168无此信号。

摘要： 本发明属于生物领域，尤其涉及慢病毒载体的制备方法及得到的慢病毒载体和应用。本发明公开了一种慢病毒载体的制备方法，包括：以基于LTR1.27‑GEW质粒为骨架，在5’端添加R和U5区，得到慢病毒载体Obio‑01。本发明制备得到的新型的第四代慢病毒载体在保障安全性的前提下，还能够具有高产量的病毒滴度，可应用于基因治疗等领域。

摘要： 本发明一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞，属于医学分子生物学领域。本发明的一种重组慢病毒载体，其特征在于：在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40Poly A序列，所述慢病毒载体为FG-12。本发明重组慢病毒的应用，如转染用于移植的干细胞，将使移植到患者体内的干细胞置于本发明重组慢病毒载体的启动子的监控之下，移植的干细胞一旦发生恶性转化，将立即启动重组慢病毒中自杀基因Apoptin的表达，使恶性转化的细胞凋亡而死。在临床使用中，本发明的重组慢病毒对转化干细胞起着即特异地起到预警、反应、示踪、清除的功能。

摘要： 本发明属于生物领域，尤其涉及慢病毒载体的制备方法及得到的慢病毒载体和应用。本发明公开了一种慢病毒载体的制备方法，包括：以基于LTR1.27‑GEW质粒为骨架，在5’端添加R和U5区，得到慢病毒载体Obio‑01。本发明制备得到的新型的第四代慢病毒载体在保障安全性的前提下，还能够具有高产量的病毒滴度，可应用于基因治疗等领域。

摘要： 本发明提供一种用于慢病毒载体制备的低温混匀装置和慢病毒载体的纯化方法。该装置包括磁力耦合搅拌电机、系统控制单元和水夹套控温单元；系统控制单元分别与磁力耦合搅拌电机、水夹套控温单元信号连接，用于控制磁力耦合搅拌电机和水夹套控温单元；水夹套控温单元包括水夹套箱体；水夹套箱体的底部设置有磁力耦合搅拌电机，顶部设置有开口，侧壁包括内壁、外壁以及位于内壁和外壁之间的冷却剂通道。本发明的装置可保证核酸酶在2‑8°C环境下进行消化步骤，并以一定的剪切力搅拌混匀病毒上清液，使核酸酶与病毒上清液充分混合，完全内切外源性核酸，减少人力成本，缩短核酸酶消化时间，有利于慢病毒载体的标准化生产。

摘要： 本发明提供了一种CYBB慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用，所述慢病毒载体包括hEF1α启动子和CYBB串联共表达。本发明的慢病毒载体携带CYBB基因，在hEF1α启动子的启动下，实现了携带的CYBB基因在已分化或未分化的干细胞中的安全高效表达，同时，干细胞作为潜在的传送载体，提高了CYBB基因在转基因细胞中的表达量。

摘要： 本发明公开了一种人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体。本发明利用过表达慢病毒载体包载技术，分别构建了人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体，且将人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体分别转染293T细胞后，通过荧光素报告基因检测表明，本发明人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体在细胞中均能正常表达。本发明人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体为帕金森疾病的治疗和研究提供了新的模型，具有重要的研究价值。

摘要： 本发明“一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞”，属于医学分子生物学领域。本发明的一种重组慢病毒载体，其特征在于：在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40Poly A序列，所述慢病毒载体为FG-12。本发明重组慢病毒的应用，如转染用于移植的干细胞，将使移植到患者体内的干细胞置于本发明重组慢病毒载体的启动子的监控之下，移植的干细胞一旦发生恶性转化，将立即启动重组慢病毒中自杀基因Apoptin的表达，使恶性转化的细胞凋亡而死。在临床使用中，本发明的重组慢病毒对转化干细胞起着即特异地起到预警、反应、示踪、清除的功能。

摘要： 本发明提供具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域，其中所述促有丝分裂或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。当通过此类病毒载体转导细胞例如T细胞或自然杀伤细胞时，它们被促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白同时活化。

摘要： 本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体公开了一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用。本发明在常规慢病毒载体pGreenPuro shRNA基础上，选择性插入EF1a启动子元件，获得pGreenPuro‑Dual质粒，进而获得一种表达CD19‑CAR协同沉默PD‑1的重组慢病毒载体。通过慢病毒包装程序获得表达CD19‑CAR‑plus‑shPD‑1的重组慢病毒，能够体外感染目的细胞并有效表达CD19‑CAR以及抑制PD‑1基因的表达。本发明可用于肿瘤的细胞免疫治疗，具有特异的杀伤肿瘤作用，并对肿瘤的免疫微环境具有潜在的调节作用，为基础实验性研究和临床治疗提供了良好的技术支撑。

摘要： 本发明涉及用于治疗溶原性病毒的组合物，该组合物包括编码分离的核酸的慢病毒载体，该分离的核酸编码两种或更多种基因编辑器，所述基因编辑器选自靶向病毒DNA的基因编辑器、靶向病毒RNA的基因编辑器、及其组合；治疗裂解性病毒的组合物，该组合物包括编码分离的核酸的慢病毒载体，所述分离的核酸编码至少一种靶向病毒DNA的基因编辑器以及靶向病毒RNA的成分；用于治疗溶原性病毒和裂解性病毒的组合物，该组合物包括编码分离的核酸的慢病毒载体，该分离的核酸编码靶向病毒RNA的两种或更多种基因编辑器；用于治疗裂解性病毒的组合物；以及通过向具有病毒的个体施用上述组合物并灭活该病毒来治疗溶原性病毒或裂解性病毒的方法。