杆状病毒

摘要： 为了解决猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异毒株纤突蛋白(S蛋白)分子质量大、难以表达的问题,研究采用Signal 4.0软件预测S蛋白信号肽,构建表达替换信号肽S蛋白的重组质粒,鉴定正确后重组质粒转化DH10Bac感受态细胞并进行蓝白斑筛选,挑取白斑进行菌落PCR检测,检测无误后提取Bacmid DNA转染Sf9细胞,制备重组杆状病毒。采用杆状病毒表达系统表达目的蛋白,采用免疫印迹法(Western blot)和串联式飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)技术鉴定表达蛋白,采用SDS-PAGE半定量方法测定蛋白含量;以Balb/c小鼠为材料进行免疫试验,应用中和试验、ELISPOT试验测定小鼠抗体滴度及细胞因子水平。结果表明,S蛋白氨基端20个氨基酸为蛋白信号肽,重组质粒经双酶切鉴定构建成功,经菌体PCR检测验证表达骨架构建完成,转染Sf9细胞后获得重组病毒rB-PEDV-S;重组病毒表达蛋白经Western-blot和MALDI-TOFTOF鉴定为目的蛋白,蛋白质量浓度可达0.008 6μg/μL;替换原有信号肽可有效提高S蛋白产量,以0.86μg/只剂量免疫小鼠后,可刺激小鼠产生IL-4,但血清抗体水平与PBS组无明显差异。替换信号肽有助于S蛋白表达,利用表达蛋白免疫小鼠可有效刺激IL-4产生。

摘要： 为探究非洲猪瘟病毒(ASFV)EP153R蛋白的功能和建立ASFV抗体间接ELISA方法,本试验构建了EP153R蛋白杆状病毒表达系统,采用Western blot与IFA鉴定rEP153R蛋白的表达和免疫原性。结果显示,杆状病毒能高效表达rEP153R蛋白且可被小鼠多克隆抗体识别,具有良好的免疫原性。以此重组蛋白为抗原进行间接ELISA方法的建立,经方阵ELISA确定当抗原包被量2.5μg/mL,ASFV阳性血清稀释比1∶1000时为最佳反应条件;以优化后的条件确定了抗体阳性临界值为0.259;特异性试验结果表明,该方法仅与ASFV阳性血清发生反应,具有较强的特异性;重复性试验结果显示变异率小于10%,重复性良好。利用该方法对46份猪血清进行检测,与商品化试剂盒检测结果对比显示,符合率为91.3%,能较好的区分ASFV阴性血清与阳性血清。本研究的结果为后续EP153R功能研究和ASFV临床血清学诊断奠定了基础。

摘要： 为了表达猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)Cap蛋白,按照昆虫细胞密码子偏嗜性对ORF2基因进行优化并在N端加上His标签基因,合成的ORF2基因片段克隆入pFastBac Dual杆状病毒穿梭载体;将重组质粒转化大肠杆菌DH10-Bac感受态后通过蓝白斑筛选获得重组杆粒Bacmid-C2;将重组杆粒转染至SF9细胞5 d后收集细胞上清液;连续传代3次观察细胞病变。将接毒后的SF9细胞样通过Western blot及间接免疫荧光(IFA)进行Cap蛋白表达的鉴定。利用蔗糖密度梯度离心对病毒样颗粒的Cap蛋白纯化后进行透射电镜观察。结果显示:SDS-PAGE和Western blot检测发现重组杆状病毒在昆虫细胞中能够有效表达Cap蛋白,且与His-tag单抗及PCV3阳性血清发生特异性反应;IFA进一步鉴定感染了重组病毒的昆虫细胞与His单抗产生特异性荧光;透射电镜可以明显观察到14~17 nm左右形态规则的病毒样颗粒(VLPs)。PCV3 Cap蛋白的成功表达和鉴定将为研究Cap蛋白的免疫原性和空间结构奠定基础,也为探讨开发PCV3的亚单位疫苗提供了可能。

摘要： 本研究利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了小反刍兽疫病毒(PPRV)重组H蛋白,并以该H蛋白为包被抗原建立了检测PPRV抗体的间接ELISA方法。通过检测已知背景的绵羊血清,评价了间接ELISA的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该ELISA对其他相关的羊类病原无交叉反应,组内与组间变异系数均低于10%。利用建立的I-ELISA法和血清中和试验分别对550份绵羊临床样本进行检测,结果显示,Ⅰ-ELISA法检测的阳性率为76.55%,血清中和试验检测的阳性率为76.73%,敏感性符合率为98.58%;Ⅰ-ELISA法检测的阴性率为23.45%,血清中和试验检测的阴性率为23.27%,特异性符合率为96.09%,两种方法的总符合率为98%。上述结果表明,本研究建立的检测小反刍兽疫病毒血清中和抗体的间接ELISA方法与血清中和试验比较,具有良好的特异性、敏感性和重复性,可开发为临床适应的检测试剂盒。

摘要： 为探索敏感性高、特异性强、高通量、操作简便的羊痘病毒(CaPV)检测方法,将编码CaPV P32抗原的核苷酸序列优化为适合在Sf9细胞中表达的偏好密码子,去除氨基酸序列跨膜区,优化蛋白表达条件,利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达出了重组CaPV P32蛋白,建立了检测CaPV血清抗体的间接ELISA方法。建立的间接ELISA方法对相关的羊类病毒血清抗体无交叉反应,敏感性可达1:1024,组内和组间变异系数均低于10%。利用建立的间接ELISA方法,对480份临床血清样品进行抗体检测并与血清中和试验进行比对,发现两种方法的敏感性符合率为98.18%,特异性符合率为93.33%,总符合率为96.67%。本研究建立的CaPV P32血清抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可进一步开发为商品试剂盒,用于现场高通量检测,具有较好的市场应用前景。

摘要： 为了表达具有反应原性的N9亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,本研究将DK/HuN/S11670/2015(H11N9)株NA基因克隆至杆状病毒转移载体中,构建重组转移载体pFastBacHT A-N9并经PCR和测序鉴定后转化DH10Bac感受态细胞,经PCR鉴定获得了重组杆粒rBacmid-N9,转染昆虫细胞sf21获得重组杆状病毒rBaculovirus-N9。将获得的P3代重组杆状病毒感染sf21细胞后经间接免疫荧光试验(IFA)检测N9蛋白的表达和定位,采用western blot鉴定N9蛋白的反应原性。将杆状病毒表达的重组N9蛋白包被ELISA酶标板,初步建立间接ELISA方法,利用该方法分别检测N9蛋白抗体阳性鸡血清和阴性鸡血清。IFA和western blot结果显示,N9蛋白正确表达且主要锚定在细胞膜上,表达的N9蛋白可以与鼠源N9蛋白单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA方法结果显示,初步建立的间接ELISA方法可以检测鸡血清中的N9抗体。上述结果表明,经杆状病毒—昆虫细胞表达的N9蛋白具有良好的反应原性,为N9 AIV检测试剂盒的研发奠定了基础。

摘要： MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的非编码RNA,约22 nt,是基因表达的关键调节因子,参与生物体中一系列重要的生物学过程。大多数DNA病毒编码miRNA,包括杆状病毒。杆状病毒由双链环状DNA组成,能特异性感染鳞翅目、膜翅目和双翅目等昆虫,在农业害虫防治和生物学研究中广泛应用。介绍了miRNA的生物合成和作用机制,并综述了杆状病毒感染宿主后病毒和昆虫宿主编码的miRNA以及其在杆状病毒侵染过程中的功能,为杆状病毒杀虫剂的研发和应用提供理论依据。

摘要： 目的 为解决杆状病毒作为基因传递载体瞬时表达缺陷,拟构建睡美人(SB)转座子介导的杆状病毒表达载体,通过检测绿色荧光蛋白EGFP的表达变化来评价该系统在哺乳动物体内外的表达效率.方法 以pFastBac DUAL质粒为骨架,将pPh启动子替换为CMV-SB100X-SV40 PA表达元件,然后在其下游插入IR/DR-CMV-EGFP-SV40 PA-IR/DR表达元件,获得的质粒命名为pBacSB-CE;同时作为对照构建pBac-CE,在pPh启动子下游插入CMV-EGFP表达元件.将构建好的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac,经蓝白斑筛选后转染Sf-9细胞,获得重组杆状病毒BacSB-CE和Bac-CE.将重组病毒转导人胶质瘤U87细胞,通过MTT、倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的增殖以及EGFP的表达效率;建立裸鼠皮下胶质瘤肿瘤模型,通过组织免疫荧光进一步观察重组病毒在体内的转导效率.结果 经PCR鉴定成功获得了重组病毒BacSB-CE和Bac-CE;MTT结果证实重组病毒对U87细胞的增殖无副作用;倒置荧光显微镜和流式结果显示,EGFP在BacSB-CE转导的U87细胞中至少能表达60 d,在转导15 d后仍能检测到约109 a.u.总荧光强度,而在Bac-CE转导的细胞中,15d后已检测不到荧光细胞和荧光信号;体内组织免疫荧光检测进一步显示BacSB-CE组在第10天时仍能检测到绿色荧光细胞,而Bac-CE组在第5天时基本看不到荧光细胞.结论 该研究成功构建了SB转座子介导的杆状病毒基因传递系统,获得的重组病毒对哺乳动物细胞具有良好的安全性,并能介导EGFP在哺乳动物体内外持续稳定表达.

摘要： 核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV)应用广泛,已被开发成微生物杀虫剂和用于重组蛋白表达等.NPV具有两种病毒颗粒:包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus,ODV)和芽生型病毒粒子(budded virus,BV),两者的构成和组装存在差异.病毒包涵体在肠道中溶解后释放出ODV进行初级感染,子代核衣壳通过质膜出芽产生BV引发全身性的次级感染.病毒感染昆虫后能引发宿主的免疫反应,同时NPV病毒已进化出多种策略抑制或逃避宿主的免疫反应,如免疫信号通路、黑化和凋亡等过程.本文将总结鳞翅目特异性NPV与宿主的互作研究,着重介绍NPV的侵染机制、NPV与宿主免疫系统互作的研究进展.

摘要： 为合成与天然构象相似的干扰素γ蛋白,通过优化干扰素序列的密码子序列,利用杆状病毒表达系统合成真核重组牛IFN-γ蛋白.实验化学合成牛IFN-γ基因,并将该基因克隆至真核表达载体pFastBacHTA中,将构建成功的重组载体与DH10Bac感受态大肠杆菌进行转座形成穿梭载体,穿梭载体质粒瞬时转染至SF9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒,最后利用SF9昆虫细胞悬浮培养大量表达目的蛋白.蛋白纯化后经Western Blotting和BOVIGAM牛分枝杆菌IFN-γELISA检测试剂盒检测分析,具有较好的免疫原性和反应原性.研究结果为牛IFN-γ的单克隆抗体制备以及牛结核病临床诊断奠定了基础.

摘要： 杆状病毒AcMNPV侵染宿主细胞后,翻译起始因子eIF2的α亚基(eIF2α)会被eIF2α激酶磷酸化,抑制翻译起始,降低蛋白的合成,作为宿主细胞的一种抗病毒机制.杆状病毒的Ac-PK2蛋白可以通过竞争性的与eIF2α激酶结合形成异源二聚体,抑制其磷酸化eIF2α.对Ae-PK2蛋白在病毒侵染宿主细胞过程中的功能做了深入分析,明确了其对宿主细胞蛋白合成、能量代谢以及细胞凋亡的影响.首先,利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒重组表达系统构建了过表达Ac-PK2的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP,并通过实时荧光定量PCR检测了AcMNPV和AcMNPV-PK2-EGFP侵染sf9细胞过程中Ac-pk2基因转录水平表达谱的变化,结果表明AcMNPV-PK2-EGFP处理组Ac-pk2基因的转录水平从24h开始明显高于野生处理组.荧光显微镜观察与Western blot分析结果显示,AcPK2-EGFP的表达量随着感染时间的延长而逐渐增加,随着Ac-PK2-EGFP表达量的增加,eIF2α的磷酸化逐渐减少,说明过表达Ac-PK2蛋白可以抑制eIF2α的磷酸化.

摘要： 杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,在自然界中以节肢动物(主要是昆虫)作为专一性宿主进行感染和传播.杆状病毒的表型之一:包涵体衍生型病毒(ODV)主要通过宿主经口食入引起原发感染.多种ODV囊膜蛋白在原发感染过程中发挥作用,它们被称为经口感染因子(PIFs).本文从五个方面综述了最早被鉴定且研究最为深入经口感染因子P74的研究成果.P74含有三个跨膜结构域(TM)和两个功能结构域:Baclo_P74_N supeffamily和Baclo_P74superfamily.在ODV释放过程中,P74会分别受到OB自身的碱性蛋白酶和宿主中肠胰蛋白酶酶切,P74及其酶切产物和PIF1、PIF2、PIF3形成的稳定复合物有微弱相互作用.作为ODV结合蛋白,P74可以和BBMV中一个大小约为35kDa的蛋白结合,介导病毒结合到宿主细胞上.对P74结构和功能的深入研究将促进对昆虫杆状病毒原发感染详细分子机制的认识,并为农业生产病害控制提供参考.

摘要： 杆状病毒是一类衣壳呈杆状、具有囊膜包被、基因组为双链闭合环状DNA病毒,专性侵染宿主主要为鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫,因此作为一类无公害杀虫剂在生物防治和植物保护方面有着广泛的应用前景,但由于它在虫体中肠建立感染的机制尚不明确而限制了它的改良和应用.杆状病毒对虫体口服感染的过程需要一类称为口服感染因子的参与。目前在研究得最广泛的杆状病毒AcMNPV中已经发现了9个pif因子，其中包括了最新鉴定的Ac110。Ac110是鳞翅目杆状病毒保守基因之一，将其缺失后，发现缺失型病毒在细胞水平仍旧可以正常复制并产生子代病毒和多角体，电镜实验也证明了在被病毒感染的细胞中，Ac110缺失型病毒的病毒形态发生与野生型的无异。而生物测定实验则发现当用病毒多角体对昆虫进行口服感染的时候，该病毒不能对虫体中肠成功感染，从而完全限制了病毒的杀虫能力。利用荧光增白剂破坏虫体中肠围食膜，发现该缺失型病毒仍然无法感染虫体中肠，说明围食膜并不是Ac110的作用靶标。研究表明Ac110不是杆状病毒在细胞中复制的必需基因，但却是一个决定病毒能否成功感染虫体的pif因子。

摘要： 杆状病毒表达系统是一个利用杆状病毒作为载体，在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。自1983年Smith GE等人利用A cNPV成功表达外源蛋白以来，经过不到30年的发展，杆状病毒表达系统己经成为当今基因工程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。其在生物医药、农业、疫苗研发等方面均获得广泛应用。通过对杆状病毒及其表达载体系统的描述，展开了系统流感疫苗，单纯疱疹病毒疫苗，肠道病毒疫苗，肝炎病毒疫苗以及人类免疫缺陷病毒疫苗研发。尽管昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)有着自己的特点和优势，但也不可避免的存在一定的不足，一是普遍存在于BEVS中重组蛋白易降解的问题;二是重组蛋白的表达量远远达不到理想的水平，为此，对杆状病毒表达载体系统进行了改进，随着对这一表达系统的基础理论研究的不断深入，新的调控因子及强的增强子也陆续被发现，杆状病毒表达载体系统必会发挥着不可估量的作用。

摘要： 杆状病毒(Baculovirus)是一类专门寄生节肢动物的病原微生物,杆状病毒基因结构与功能的研究是杆状病毒分子生物学领域研究的热点之一.BmNPV bm64及其同源基因存在于所有鳞翅目杆状病毒和2/3的膜翅目杆状病毒基因组中,但其基因功能至今尚未阐明.生物信息学分析Bm64蛋白具有一个跨膜结构域。5'RACE,3'RACE实验确定bm64基因的转录起始位点约位于起始密码子上游140bp位置，转录终止位点位于终止密码子下游lObp位置。Real-time PCR检测表明bm64基因与晚期基因vp39转录时相相似，bm64基因属于晚期基因。Western blot检测病毒感染过程中Bm64蛋白表达时相，与bm64基因的转录时相结果相符，确定Bm64是病毒的晚期基因。利用Red重组系统和Bac-to-Bac系统成功构建bm64基因缺失的杆状病毒。bm64基因缺失的重组杆状病毒不能产生感染性病毒粒子，说明bm64基因是病毒复制的必需基因。本研究为杆状病毒的基因表达调控机制，杆状病毒的生物防治应用提供理论参考。

摘要： 就目前所知的杆状病毒的非必需基因BmNPV orf98的功能方面的研究做一简单概述。BmNPV orf98基因位于BmNPV(T3株)基因组94123-94371nt，全长249bp，编码一个含82个氨基酸残基的蛋白，预测分子量约为9.5kD。经过PCR鉴定，实际值与理论大小相符;再利用Bac-to-Bac系统将BmNPV orf98基因重新补回到病毒基因组中，获得修复型病毒Bm98-re-Bacmid。经过PCR鉴定实际值符合理论预测大小。然后将野生型病毒wtBacmid, Bm98-ko-Bacmid和Bm98-re-Bacmid DNA分别转染家蚕BmN细胞，研究BmNPV orf98基因敲除对病毒基因组的复制和病毒基因转录的影响。同时构建原核表达载体pET 28a-Bm98，在BL21中表达BmNPV orf98蛋白，蛋白以包涵体形式存在沉淀中，纯化后的蛋白经过SDS-PAGE凝胶电泳验证，目的片段大小为12.SkD，为HIS标签大小和目的蛋白大小之和，纯化后蛋白大小与理论值一致。将纯化后蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，利用抗原抗体的特异性，从而对BmNPV orf98蛋白进行亚细胞定位。最后实验将通过电镜透射研究BmNPV orf98蛋白对病毒颗粒装配的影响。综合以上方法对家蚕杆状病毒BmNPV orf98基因功能进行初步研究。

摘要： 成功构建了共表达甲型流感病毒双基因的重组杆状病毒rBac-M1-M2、rBac-M1-NA及rBac-M1-HA，为研究流感病毒VLP的形成机制以及研发新型流感疫苗提供了新思路。

摘要： 猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的新生仔猪严重腹泻的高度接触性传染病,近年来中国新流行的PEDV毒株对新生仔猪的发病率和死亡率均较高,对养猪业的健康发展造成了极大的威胁.通过研究表明：在感染的sf9细胞胞浆中可观察到特异性绿色荧光;利用PEDV感染猪血清抗体对其表达产物进行Western blot鉴定，结果显示在约70KDa左右出现特异性条带。

摘要： 本试验之目的以杆状病毒表现一株台湾一型禽传染性支气管炎病毒(IBV)之纤突蛋白(S),并评价其对于台湾一型毒株的免疫保护力.本试验采用之IBV-3575毒株来源于免疫台湾一型毒株IBV-2575疫苗之禽场,该毒株表现强致病性,在病毒中和试验中表现与台湾一型毒株2575、台湾二型毒株2296及麻州疫苗株H120具有交叉保护力.以IBV-3575之纤突蛋白序列为模板,建构带有纤突蛋白基因之Baculovirus-S重组杆状病毒并感染Sf9昆虫细胞,收取昆虫细胞,并进行纯化,通过西方墨点法检测重组蛋白.将重组纤突蛋白作为抗原免疫7日龄SPF鸡,在免疫后4、8、12、16日检测其抗体水平,并在免疫后16日进行攻毒试验,通过临床症状、病理变化、病毒分布等指标评估其免疫保护性.

摘要： 为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白,本研究利用PCR方法扩牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒。将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经抗生素、PCR鉴定,获得转座杆粒Bacmid-E2.转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,最后用SDS-PAGE和Western blotting对重组的表达蛋白进行分析。结果表明,实验成功体外表达E2基因,重组E2蛋白大小为43.6kDa,与预期值相符,且该蛋白能与BVDV阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA检测试剂盒奠定物质基础。

摘要： 本发明提供了含有猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒及其制备方法和应用，属于兽用疫苗技术领域。含有猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，以HBM信号肽‑gD‑His标签或HBM信号肽‑gD‑IgGFc‑His标签为外源基因分别插入杆状病毒转移载体的BamHI与EcoRI之间的酶切位点处和SpeI和HindIII之间酶切位点处；所述gD为编码跨膜区片段缺失的gD蛋白的基因。所述载体促进猪伪狂犬病病毒gD蛋白和gD‑IgGFc融合蛋白的分泌表达。采用gD蛋白和gD‑IgGFc融合蛋白制备亚单位疫苗，具有安全性好、特异性强、攻毒保护率高的特点。

摘要： 本发明提供了含有猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因的重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒及其制备方法和应用，属于兽用疫苗技术领域。含有猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，以GP67信号肽‑gB‑His标签或GP67信号肽‑gB‑IgGFc‑His标签为外源基因分别插入杆状病毒转移载体的BamHI与EcoRI之间的酶切位点处和XbaI与HindIII之间酶切位点处；所述gB为编码C端跨膜区片段缺失的gB蛋白的基因。所述载体促进猪伪狂犬病病毒gB蛋白和gB‑IgGFc融合蛋白的分泌表达。采用gB蛋白和gB‑IgGFc融合蛋白制备单亚基疫苗，具有安全性好、特异性强、攻毒保护率高的特点。

摘要： 本发明公开了一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用，该方法将埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，产生的重组病毒经过测定，可以明显提高杆状病毒的滴度，增强感染性，可以在病毒繁殖扩增过程中，加入少量病毒可达到高的感染性，节省生产成本。本发明的使用不但可以降低杆状病毒扩增成本，同时获得的高感染性重组杆状病毒也可改善杆状病毒作为生物杀虫剂杀虫速度慢等缺点；本发明还可促进昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用、杆状病毒受体以及杆状病毒入侵宿主的机制等研究的发展，本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。

摘要： 本发明提供了一种杆状病毒基因组的合成方法及其在重组杆状病毒构建中的应用，属于生物技术领域。本发明提供的一种杆状病毒基因组的合成方法，包括使用引物组合和穿梭载体。引物组合包括杆状病毒全基因组扩增引物组合和线性载体扩增引物组合，应用该引物组合合成的基因片段，可在酵母中通过多片段的拼接合成出杆状病毒基因组，方便对杆状病毒基因组的任意位点进行改造；该方法中用于完整基因组拼接的穿梭载体带有能在昆虫细胞方便检测的基因，所合成的杆状病毒基因组可通过转染昆虫细胞获得有感染活性的病毒，方便用于拯救基因组改造后的杆状病毒；应用上述方法构建重组杆状病毒，方便快速高效，利于推广应用。

摘要： 本发明公开了一种重组杆状病毒和其应用及构建该重组杆状病毒的载体。所述载体包括杆状病毒表达供体质粒和外源蛋白融合表达载体，所述杆状病毒表达供体质粒以pFastBac1杆状病毒表达载体为骨架，在其多克隆位点连接有NEDD8基因；所述外源蛋白融合表达载体包括所述的杆状病毒表达供体质粒以及插入所述杆状病毒表达供体质粒的外源蛋白基因，所述的NEDD8基因与外源蛋白的N端或/和C端相连。所述重组杆状病毒由所述的外源蛋白融合表达载体同源重组到杆状病毒基因组中并转染昆虫细胞得到。本发明利用NEDD8基因能够使杆状病毒外源目的蛋白如GFP表达量增加4倍以上。

摘要： 本发明提供了含有猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒及其制备方法和应用，属于兽用疫苗技术领域。含有猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，以HBM信号肽‑gD‑His标签或HBM信号肽‑gD‑IgGFc‑His标签为外源基因分别插入杆状病毒转移载体的BamHI与EcoRI之间的酶切位点处和SpeI和HindIII之间酶切位点处；所述gD为编码跨膜区片段缺失的gD蛋白的基因。所述载体促进猪伪狂犬病病毒gD蛋白和gD‑IgGFc融合蛋白的分泌表达。采用gD蛋白和gD‑IgGFc融合蛋白制备亚单位疫苗，具有安全性好、特异性强、攻毒保护率高的特点。

摘要： 本发明提供了含有猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因的重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒及其制备方法和应用，属于兽用疫苗技术领域。含有猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，以GP67信号肽‑gB‑His标签或GP67信号肽‑gB‑IgGFc‑His标签为外源基因分别插入杆状病毒转移载体的BamHI与EcoRI之间的酶切位点处和XbaI与HindIII之间酶切位点处；所述gB为编码C端跨膜区片段缺失的gB蛋白的基因。所述载体促进猪伪狂犬病病毒gB蛋白和gB‑IgGFc融合蛋白的分泌表达。采用gB蛋白和gB‑IgGFc融合蛋白制备单亚基疫苗，具有安全性好、特异性强、攻毒保护率高的特点。

摘要： 本发明公开了一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用，该方法将埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，产生的重组病毒经过测定，可以明显提高杆状病毒的滴度，增强感染性，可以在病毒繁殖扩增过程中，加入少量病毒可达到高的感染性，节省生产成本。本发明的使用不但可以降低杆状病毒扩增成本，同时获得的高感染性重组杆状病毒也可改善杆状病毒作为生物杀虫剂杀虫速度慢等缺点；本发明还可促进昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用、杆状病毒受体以及杆状病毒入侵宿主的机制等研究的发展，本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。

摘要： 本发明公开一种杆状病毒表达系统中杆状病毒的灭活方法，包括在杆状病毒表达系统表达的含有目的产物的收获液中加入灭活剂的步骤；所述灭活剂由去污剂和有机溶剂组成，其中所述去污剂占所述收获液和灭活剂的总体积的0.5‑5％，所述有机溶剂占所述收获液和灭活剂的总体积的0.15‑1.5％，优选所述去污剂与所述有机溶剂二者的体积比为1:0.3。本发明的方法能对杆状病毒表达系统中的杆状病毒进行有效灭活，同时又能保持杆状病毒表达系统生产出的AAV病毒和重组蛋白的活性，为杆状病毒表达系统生产的AAV和重组蛋白的安全性提供新的保障。

摘要： 本发明提供了一种杆状病毒基因组的合成方法及其在重组杆状病毒构建中的应用，属于生物技术领域。本发明提供的一种杆状病毒基因组的合成方法，包括使用引物组合和穿梭载体。引物组合包括杆状病毒全基因组扩增引物组合和线性载体扩增引物组合，应用该引物组合合成的基因片段，可在酵母中通过多片段的拼接合成出杆状病毒基因组，方便对杆状病毒基因组的任意位点进行改造；该方法中用于完整基因组拼接的穿梭载体带有能在昆虫细胞方便检测的基因，所合成的杆状病毒基因组可通过转染昆虫细胞获得有感染活性的病毒，方便用于拯救基因组改造后的杆状病毒；应用上述方法构建重组杆状病毒，方便快速高效，利于推广应用。