细菌人工染色体

摘要： 目的期望获得含有全长hACE2基因序列的hACE2人源化小鼠模型,为心血管疾病、新冠肺炎发病机制研究、药物与疫苗研发提供重要工具。方法将纯化含有hACE2完整编码序列的BAC质粒,利用小鼠受精卵显微注射和输卵管移植技术获得多个首建鼠,分别育种建系,通过杂交育种获得稳定遗传F2代小鼠品系,进一步对F2代小鼠hACE2基因整合、基因拷贝数、相对荧光定量PCR、Western Blot和免疫荧光进行分析。结果育种获得hACE2-6-9、hACE2-14-3、hACE2-15-1和hACE2-15-2共4个小鼠品系。基因整合结果显示,hACE2-6-9、hACE2-15-1和hACE2-15-2小鼠品系含有完整的hACE2基因座位点及较长的基因调控区,hACE2-14-3含有完整的hACE2基因座位点及3’UTR较短的基因调控区。相对荧光定量PCR和Western Blot检测结果显示,hACE2-6-9、hACE2-15-1和hACE2-15-2品系小鼠肠道中hACE2 mRNA和蛋白表达水平较低,而整合较短调控序列的hACE2-14-3小鼠品系则表达水平较高。免疫荧光染色结果显示hACE2-15-1品系小鼠肾小管和肺血管内皮细胞中均有hACE2表达。结论获得了含有全长基因序列的hACE2人源化BAC转基因小鼠,保留完整的hACE2启动子及基因调控区,从而为心血管疾病、新冠肺炎发病机制研究、hACE2基因表达调控机制研究和药物、疫苗的研发提供重要工具。

摘要： 为了快速且准确地对疱疹病毒基因组进行基因敲除、插入或者点突变等修饰,通过同源重组将马立克氏病病毒(MDV)超强毒株Md5基因组克隆到细菌人工染色体(BAC).将筛选的阳性重组体DNA电转进DH10B菌株,用PCR及限制性片段多态分析(RFLP)方法鉴定含Md5全基因组的BAC克隆.将阳性重组体DNA转染入鸡胚成纤维细胞(CEF),拯救出重组病毒,命名为Md5BAC.进一步利用Red酶介导的两步法基因重组技术构建MDVlorf10基因敲除毒株.为了验证被敲除基因功能的特异性,将lorf10插入原位点以构建基因复原毒株.将构建的重组毒株分别感染CEF细胞,用间接免疫荧光试验确认重组病毒均包装成功;病毒生长曲线结果表明,lorf10敲除不影响病毒的体外增殖.总之,这为其他疱疹病毒的基因组编辑提供了技术参考.

摘要： 目的 比较细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)转基因小鼠研制中的几个关键因素如实验小鼠遗传背景、BAC质粒注射浓度、BAC质粒片段大小和BAC注射液存放时间等,优化BAC转基因小鼠研制技术.方法 采用相同的BAC DNA制备方法,分别选取C57BL/6J(B6)和FVB/N两种实验小鼠,用质量浓度分别为0.75、1.0、1.5和2.0 ng/μL的BAC注射液进行胚胎显微注射,分析不同BAC DNA片段大小和BAC载体DNA制备后至注射前的时间长度,比较小鼠出生率、转基因小鼠阳性率.结果 用FVB/N为背景的转基因小鼠阳性率较用C57BL/6J高(P1.5 ng/μL组>1.0 ng/μL组>2.0 ng/μL组.4个BAC质粒质量浓度注射时,C57BL/6J转基因小鼠阳性率由高到低排序依次为1.5 ng/μL>1.0 ng/μL>2.0 ng/μL=0.75 ng/μL,FVB/N转基因小鼠阳性率由高到低排序依次为1.5 ng/μL>1.0 ng/μL>2.0 ng/μL>0.75 ng/μL.当BAC片段大小为197 kb时,仔鼠出生率最高,为(22.49±9.41)％;片段大小为99 kb时仔鼠出生率最低,为(13.61±15.65)％;当BAC片段为197 kb时,转基因小鼠阳性率最高,为(13.56±12.88)％,极显著高于114 kb(P<0.01),显著高于99 kb(P<0.05).BAC注射液的存放时间与转基因小鼠阳性率并不呈线性关系.结论 相较于C57BL/6J,FVB/N背景更适于BAC转基因小鼠的研制.BAC注射液质量浓度为1.5 ng/μL时,阳性转基因小鼠的制备效率最高.BAC片段大小并非阳性转基因小鼠的限制因素.BAC载体DNA制备后1周内完成注射的效果最佳.

摘要： [背景]鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势.为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式(E451-dk,简称为Es)表达量最高.[目的]探讨不同启动子对Es在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础.[方法]将pCAG、pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA.在鸭瘟病毒(DEV)疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过"Red E/T两步重组"克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es.用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定.[结果]将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es.Western blotting分析表明外源蛋白Es在pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12％.[结论]完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV.同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es.

摘要： Objective To evaluate the applicability of Han strain bacterial artificial chromosome (Han-BAC) in small fragment mutation of the human cytomegalovirus (HCMV) genome. Methods A 31-bp long fragment of LUNA between UL80 and UL82 in the HCMV was chosen as the mutation target. Kanamycin resistance gene sequence flanking the homologous arms of the target neighbor sequence was used to replace the target sequence. Electronic transformation was used to rescue the mutated virus. Reverse transcription PCR and cDNA clone sequencing were used to identify the mRNA expression and the 3' terminal structures of LUNA,UL80,and UL82 transcripts. Results The 31 bp fragment was replaced precisely by the kanamycin resistance gene sequence. The efficiency of mutation was more than 3％. LUNA-mutated virus was rescued successfully. Transcriptions and 3' terminal structures of the UL80 and UL82 transcripts of the mutant virus were the same as those of its original virus. Conclusion The sequence at the transcription start site of LUNA was replaced successfully. The HCMV Han-BAC supports fragment mutation as small as 31 bp with a relatively high efficiency.%目的 评估细菌人工染色体技术在人巨细胞病毒(HCMV)基因组小片段序列突变中的作用.方法 选取HCMV LUNA基因位于UL80与UL82 2个基因之间的31 bp片段作为突变靶点,用含有同源臂的卡那霉素抗性序列对目的片段进行同源重组置换,电转化法对突变成功的病毒进行拯救,反转录PCR和cDNA克隆测序对LUNA,UL80及UL82 mRNA 转录情况和转录本3' 末端结构进行分析.结果 目的基因片段缺失成功,获得的单克隆中突变成功的比例>3％,LUNA转录起始端序列突变的病毒拯救成功,UL80与UL82的mRNA转录与转录本3' 结构未受影响.结论 通过人工染色体技术成功进行了HCMV Han株LUNA基因转录起始端序列突变,HCMV Han株细菌人工染色体支持有效缺失小至31 bp的基因片段.

摘要： 目的 利用 GalK为基础的同源重组方法,将 3 xflag添加到水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus ,VZV)开放读码框 7(open reading frame7,ORF7),构建携带3xflag与VZVORF7 融合基因的重组水痘带状疱疹病毒.方法 PCR扩增带有 50 bp VZVORF7 左右同源臂的 GalK及 3xflag基因片段,将所得片段纯化后电转到 VZV细菌人工染色体(SW1 02-VZVWTBAC)感受态细胞,通过同源重组、GalK 筛选及脱 GalK 筛选,获得带有 3 xflag 的 VZVORF7 细菌人工染色体(SW102-VZV ORF7-3xflag-BAC)克隆;将所得克隆进行质粒提取后,转染到 ARPE-19 细胞,观察带有3xflag基因的VZV对ARPE-19 细胞的影响.结果 获得了VZV ORF7 带有3xflag的细菌人工染色体克隆(SW102-VZVORF7-3xflag-BAC).将该质粒转染 AARPE-19 细胞,3 d 后,转染 SW102-VZVWTBAC 及 SW102-VZV ORF7-3 xflag-BAC的细胞可见带有绿色荧光的病毒斑块,Western blot检测结果显示 3 xflag时 ORF7 的表达水平有效增强.结论 获得了携带 3 xflag基因的重组 VZV,表明通过 GalK为基础的同源重组,可方便、快捷并准确地对感兴趣的病毒基因进行操作.%Objective To construct the recombinant varicella zoster virus (VZV)carrying 3xflag gene,3xflag was added to the VZV open reading frame 7 (ORF7)using GalK-based homologous recombination.Methods GalK and 3xflag gene fragments with 50 bp VZV ORF7 homologous arms were amplified by PCR.The obtained fragments were purified and transferred to the competent cells of VZV bacterial artificial chromosome (SW102-VZVWTBAC). The clones of VZV ORF7 with 3xflag (SW102-VZV ORF7-3xflag-BAC)were obtained by homologous recombination and selection from medium containing GalK and replaced GalK. The recombinant plasmids were extracted and transfected into ARPE-19 cells.The effect of VZV ORF7-3xflag on ARPE-19 cells was observed.Results The clones of VZV ORF7 with 3xflag (SW102-VZV ORF7-3xflag-BAC)were obtained.The virus patches with green fluorescence were observed three days after SW102-VZVWTBAC and SW102-VZV ORF7-3xflag-BAC were transfected into ARPE-19 cells.Western blot showed that ORF7 expression was effectively enhanced with 3xflag.Conclusion The recombinant VZV carrying 3xflag gene was obtained,which suggests that GalK-based homologous recombination is convenient,efficient and accurate in manipulating the gene virus of interest.

摘要： 目的:探讨将细菌人工染色体微球(Bobs)检测技术应用于胎儿染色体异常产前诊断的可行性.方法:选取7864例单胎中期妊娠孕妇(指征包括高龄、唐氏血清学筛查高风险、胎儿无创DNA检测高风险、不良生育史、胎儿超声结构或软指标异常、染色体病家族史等),用Bobs技术快速检测13、18、21、X、Y染色体的数目异常及9种微缺失综合征,并与常规羊水细胞染色体的G显带分析结果及基因芯片检测结果进行比较.结果:共检出302例各类异常,包括256例染色体非整倍体数目异常(含3例嵌合体及2例47,XXY合并Yq11.223、Yq11.23微重复),46例微缺失及微重复异常(含1例等臂X染色体),染色体非整倍体数目异常检测结果同G显带核型分析结果一致,有39例微缺失、微重复进行基因芯片检测,结果与Bobs一致.Bobs在检测数目异常十嵌合体及结构异常的灵敏度、特异性和准确性均为100.0％.结论:Bobs技术检测胎儿染色体非整倍体异常和9种微缺失综合征,是具有快速、可靠等特点的产前诊断方法.

摘要： 为构建猪源伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA的细菌人工染色体(BAC),本研究将转移载体pHA2-pUC19-H1-H2的DNA与PRV AH02LA株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,利用转移载体中的GFP为筛选标记,获得携带GFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV-AH02LA(gET/gI-)-pHA2.提取纯化的该重组病毒DNA转化E.coli DH10B,对获得的阳性克隆命名为BACPRV-G.提取BACPRV-G的DNA,将含gE、gI和其上下游同源片段的DNA与BACPRV-G的DNA共转染CEF,获得gE、gZ基因恢复的病毒命名为PRV-AH02LARec.比较亲本株PRV AH02LA、基因缺失株和恢复株的生长动力学,结果表明,恢复株的生长特性与亲本株无显著差异.本研究成功构建了PRV变异株AH02LA的BAC,并证实其为全基因组的感染性克隆,为PRV变异株的致病机理研究和新型疫苗研制提供了重要的平台.

摘要： Objective To construct human cytomegalovirus(HCMV)Han?ΔUS12?BAC strain and to study the role of US12 in HCMV replica?tion in human embryonic lung fibroblasts(HELF). Methods Kanamycin?resistant gene was amplified with primers containing homology arms se?quence flanking US12 and then electroporated into E.coli DY380?Han?wt?BAC competent cells. Successfully recombinant Han?ΔUS12?BAC clones were identified by PCR,sequenced for confirmation Han?ΔUS12?BAC plasmids were electroporated into HELF to produce infectious viri?ons. Han?ΔUS12?BAC and Han?wt?BAC were inoculated onto HELF at the multiplicity of infection of 0.1 pfu/cell. The viral titer in the supernatant was measured by TCID50 assay and growth kinetics of the viruses in HELF was studied. Results Han?ΔUS12?BAC clone was successfully con?structed. Han?ΔUS12?BAC was reconstructed in HELF to generate infectious virions. Growth kinetics assay indicated that Han?ΔUS12?BAC and Han?wt?BAC showed no differences in their growth and dissemination in HELF. Conclusion US12 in HCMV clinical strain Han is dispensable for HCMV growth and dissemination in HELF.%目的 构建人巨细胞病毒(HCMV)Han株US12基因缺失的BAC毒株,研究US12产物对HCMV Han株在人胚肺成纤维细胞(HELF)中复制的影响.方法 以侧翼含有US12基因同源序列的PCR引物扩增卡那霉素抗性基因,电转至含有Han株BAC质粒的大肠杆菌DY380?Han?wt?BAC,PCR及DNA测序验证US12缺失的病毒序列.将缺失突变质粒Han?ΔUS12?BAC?P电转至HELF,获得感染性病毒颗粒Han?ΔUS12?BAC.以MOI为0.1的Han?ΔUS12?BAC毒株及Han?wt?BAC毒株感染HELF,TCID50法测定上清中病毒滴度,绘制病毒增殖曲线.结果 成功构建了Han?ΔUS12?BAC克隆,转染HELF后成功获得感染性病毒.生长曲线实验结果表明,ΔUS12缺失和野生型毒株在HELF中复制增殖与扩散水平无明显差异.结论 US12为HCMV临床株Han在HELF中增殖和扩散过程中的非必需基因.

摘要： 稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统.实验通过采用95-23-4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA,用限制性内切酶部分酶解后,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接,通过转化E.coli DHIOB感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了95-23-4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体(BAC)基因组文库.通过进行酶切检测及Suthern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段29.1kb,该文库覆盖7.4倍基因组,此基因组文库的构建为该菌致病相关基因的克隆奠定了基础.

摘要： 促卵泡激素(FSH)是动物垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白生殖激素，它和促黄体素一起在调节性腺功能中扮演重要角色。在雌性动物中，促卵泡激素主要促进子宫内膜生长、排卵和刺激多卵泡发育。研究表明FSHβ基因是猪产仔数的主效基因。因此通过转基因小鼠模型这一强有利的工具来探讨FSH基因在生殖方面的功能。为了避开传统研究方法的弊端，利用FSH-BAC来构建转基因小鼠模型，获得外源促卵泡激素生理分泌量的转基因小鼠家系，以研究猪FSH在垂体中特异表达对雌性小鼠生殖的影响。

摘要： DNA芯片是惊人的基因组技术，它的出现在生物学和生物医学领域引起了广泛的关注.其巨大的应用前景以及对生物学理解的影响超出了人们的预测.本文介绍这方面概念、技术及其目前和潜在应用前景。

摘要： 以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶Ⅰ-SceⅠ切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性差等问题,以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题.

摘要： 以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶Ⅰ-SceⅠ切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性差等问题,以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题.

摘要： 以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶Ⅰ-SceⅠ切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性差等问题,以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题.

摘要： 以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶Ⅰ-SceⅠ切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性差等问题,以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题.

摘要： 以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶Ⅰ-SceⅠ切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性差等问题,以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题.

摘要： 以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶Ⅰ-SceⅠ切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性差等问题,以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题.

摘要： 以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶Ⅰ-SceⅠ切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性差等问题,以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题.

摘要： 本发明公开了人工半合成染色体整合方法及含有完整合成染色体的微生物，该方法包括：(1)分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，其中，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点；(2)将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。该方法能够有效地用于两条人工半合成染色体的整合。

摘要： 本发明涉及携带来源于人染色体的着丝粒、亚端粒序列和端粒序列的人类人工染色体(HAC)载体；包含HAC载体的人细胞药物或人细胞；制备HAC载体和人细胞的方法；以及用HAC载体生产治疗性蛋白的方法。

摘要： 本发明公开了人工半合成染色体整合方法及含有完整合成染色体的微生物，该方法包括：(1)分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，其中，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点；(2)将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。该方法能够有效地用于两条人工半合成染色体的整合。

摘要： 本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种鸭肠炎病毒人工染色体的构建及应用。本发明克隆得到一种鸭肠炎病毒人工染色体pBAC-C-KCE质粒，该质粒保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号为CCTCC NO：M2013377。本发明还公开了鸭肠炎病毒人工染色体pBAC-C-KCE在重组鸭肠炎病毒包装上的应用。

摘要： 本发明提供了一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法。利用pABRG重组质粒对含有目的基因的BAC进行同源重组，然后采用经哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子将重组后的BAC通过核转染技术转染宿主细胞，使重组后的含有目的基因的BAC整合到宿主细胞的基因组中。通过成功构建含有人类UBC启动子的eGFP标记基因和真核筛选抗性neo基因的BAC载体，并且载体两端有Loxp元件，为转染细胞后的标记和抗性去除做准备。此外，电转染BAC-Tol2-eGFP载体，转染效率达到了1%-6%，最高可到达10%，为大型哺乳动物BAC的使用和操作提供了一套完整的实验路线和方法。

摘要： 本发明属于生物医药技术领域，涉及基于细菌人工染色体BAC的新冠病毒SARS‑CoV‑2亚基因组复制子克隆、构建及应用。本发明提供了新冠病毒亚基因组复制子克隆的表达产物，其不含有新冠病毒的结构蛋白S、M或者E，还包括其编码序列、制备方法和应用。本发明涉及基于细菌人工染色体BAC的带有Gaussia荧光素酶报道基因的新冠病毒(SARS‑CoV‑2)DNA克隆；分别含有4个新冠病毒基因片段以及报道基因Gluc的4个DNA克隆；以及通过剔除病毒结构蛋白S，M和E，加入报道基因来构建新冠病毒(SARS‑CoV‑2)亚基因组复制子的制备方法；本发明的系统可用于筛选新冠病毒抗病毒药物。

摘要： 本发明提供一种新型火鸡疱疹病毒的细菌人工染色体、构建方法与应用，涉及动物医学领域。所述细菌人工染色体,是将HVT基因组中的gC基因敲除，并替换为mini‑F质粒序列。所述细菌人工染色体的构建方法：扩增HVT基因组中gC基因上、下游同源臂，插入pUC19载体内获得重组载体A；将mini‑F质粒片段插入重组载体A内，得到重组转移载体B，与HVT 的DNA共转染CEF，筛选得到mini‑F重组HVT；提取mini‑F重组HVT的DNA转化DH10B细胞，采用氯霉素筛选，获得阳性重组菌，培养后，提取质粒DNA。本发明细菌人工染色体具有较高的稳定性，构建方法简单、高效，可以应用于重组载体活疫苗的构建。

摘要： 本发明涉及细菌人工染色体(BAC)用于制备疫苗的应用，其中所述BAC包含：-诱导型细菌ori序列，其用于扩增所述BAC至每个细菌细胞多于10个拷贝，和-病毒表达盒，其包含减毒RNA病毒基因组的cDNA，并且包含用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cDNA和用于将转录的RNA加工成感染性病毒RNA的顺式-调节元件。

摘要： 本发明提供了一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法。利用pABRG重组质粒对含有目的基因的BAC进行同源重组，然后采用经哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子将重组后的BAC通过核转染技术转染宿主细胞，使重组后的含有目的基因的BAC整合到宿主细胞的基因组中。通过成功构建含有人类UBC启动子的eGFP标记基因和真核筛选抗性neo基因的BAC载体，并且载体两端有Loxp元件，为转染细胞后的标记和抗性去除做准备。此外，电转染BAC-Tol2-eGFP载体，转染效率达到了1%-6%，最高可到达10%，为大型哺乳动物BAC的使用和操作提供了一套完整的实验路线和方法。

摘要： 本发明涉及重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体转移载体，属于生物制药领域。从E.coli DH5α染色体DNA中扩增黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因gpt基因，与质粒pEGFP中的CMV启动子及poly(A)连接，，插入到质粒pUAB中，构建带有Egpt的重组克隆质粒pUAB-gpt。用pUC18克隆单拷贝BAC载体制备高拷贝BAC载体基本功能序列，插入到pUAB-gpt中，获得重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体转移载体pUAB-gpt-BAC，含gpt基因表达盒的核心序列BAC-gpt，具有氨苄青霉素和氯霉素双抗性。本发明构建的转移载体具有研制重组HVT活病毒载体基因工程疫苗的应用前景。