马立克氏病病毒

摘要： 临床症状主要感染2周龄以内的鸡,临床表现虚弱、精神沉郁、食欲减退、体重减轻、生长发育受阻、贫血和皮肤出血,有的可能会继发坏疽性皮炎。2周龄以上鸡感染通常表现无症状,该病引起的免疫抑制会继发感染其他病原,如马立克氏病病毒、呼肠孤病毒和传染性法氏囊病毒等,症状加重,死亡率增加。

摘要： 研究旨在快速有效地诊断鸡马立克氏病(MD),区分MD血清Ⅰ型病毒(MDV-Ⅰ)与疫苗毒株。试验对Gen Bank发表的140余株MDV序列进行全基因组比对,选定MDV-Ⅰ型特有的meq基因设计1对引物,通过优化退火温度等条件建立了MDV-Ⅰ的PCR诊断方法,评估该方法的特异性、灵敏度及重复性。结果显示,设定退火温度64°C、35个循环时,以MDV-Ⅰ型毒株为模板可扩增得到286 bp的片段;以CVI988或814疫苗毒株为模板时,可扩增得到463 bp的片段;该方法特异性强、灵敏度高,扩增结果稳定,可区分MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株。应用该方法诊断1例免疫后仍有MD症状的鸡,可同时扩增约286和463 bp的片段;2个片段的测序结果显示,扩增出的片段分别与MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株相匹配。研究表明,试验建立的PCR方法可快速有效地诊断MDV-Ⅰ型毒株感染鸡并筛选免疫失败的鸡群。

摘要： 为了研究马立克氏病病毒(MDV)抑制宿主天然免疫的机制,本试验构建了RLORF 1基因缺失MDV(CVI988△RLORF1和RB1B△RLORF1),结合RLORF 1基因的过表达方法探讨该基因对MDV复制以及Ⅰ型干扰素反应的影响。结果显示,MDV RLORF 1基因缺失一方面降低了病毒复制能力(P<0.001),另一方面上调了病毒诱导宿主的Ⅰ型干扰素反应的能力(P<0.05或P<0.001),而在鸡胚成纤维细胞(CEF)中过表达RLORF 1后,MDV病毒的复制能力明显增强(P<0.001),且RLORF 1基因转录蛋白可显著抑制宿主的干扰素-β(IFN-β)表达(P<0.001)。结果表明,MDV感染过程中可以通过RLORF 1基因编码蛋白抑制宿主的Ⅰ型干扰素表达,进而通过抑制宿主的天然免疫反应保证病毒感染后的早期复制。

摘要： 为了快速且准确地对疱疹病毒基因组进行基因敲除、插入或者点突变等修饰,通过同源重组将马立克氏病病毒(MDV)超强毒株Md5基因组克隆到细菌人工染色体(BAC).将筛选的阳性重组体DNA电转进DH10B菌株,用PCR及限制性片段多态分析(RFLP)方法鉴定含Md5全基因组的BAC克隆.将阳性重组体DNA转染入鸡胚成纤维细胞(CEF),拯救出重组病毒,命名为Md5BAC.进一步利用Red酶介导的两步法基因重组技术构建MDVlorf10基因敲除毒株.为了验证被敲除基因功能的特异性,将lorf10插入原位点以构建基因复原毒株.将构建的重组毒株分别感染CEF细胞,用间接免疫荧光试验确认重组病毒均包装成功;病毒生长曲线结果表明,lorf10敲除不影响病毒的体外增殖.总之,这为其他疱疹病毒的基因组编辑提供了技术参考.

摘要： 禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类一种重要免疫抑制性疾病,目前尚无有效的商品化疫苗预防该病.为研制表达RE病毒(REV)gp90蛋白的重组鸡马立克氏病病毒(MDV),本研究构建了含有REV保护性抗原基因gp90的pCAGGS-gp90表达质粒,将gp90表达框架克隆入pENTR1载体,获得重组质粒pENTR1-gp90.通过pENTR1-gp90与p814-5US2KanccdB重组粘粒的LR反应,将gp90表达框架插入p814-5粘粒中MDV 814疫苗株基因组US2基因内,构建重组粘粒p814-5-gp90.将该重组粘粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF),获得重组MDV r814-gp90株.将该重组病毒在CEF中连续传至20代后对第5、10、15、20代病毒经PCR扩增并测序鉴定;利用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测重组MDV感染细胞中gp90蛋白的表达;绘制重组MDV的生长曲线,分析其体外复制特性.结果显示,正确构建了含有gp90表达框架的重组粘粒p814-5-gp90.将该重组粘粒转染CEF后能够引起典型的蚀斑病变,且蚀斑形态大小与亲本病毒814株无明显差异.PCR及测序鉴定结果显示,重组病毒r814-gp90基因组中正确插入gp90基因表达框架,且其能够在该重组病毒中稳定存在.IFA及western blot检测结果表明,r814-gp90株能够在感染的CEF中表达gp90蛋白.体外生长曲线显示,r814-gp90株在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异.以上结果表明,本研究正确构建了表达REV保护性抗原gp90基因的重组MDV,为研制RE重组MDV活载体疫苗奠定了基础,对RE以及REV与MDV混合感染的防控具有重要意义.

摘要： 马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)糖蛋白C(glycoprotein C,gC)是参与MDV水平传播的重要毒力因子,但其具体作用机制尚未明确.研究gC蛋白所需的抗体在国内未见报道,为简化抗体制备程序,本研究采用合成抗原肽免疫的策略,通过生物信息学软件分析发现gC蛋白的优势抗原表位主要集中在其69～85氨基酸区段,据此合成肽段N-NSESTNEH-TITETTGKN-C作为抗原免疫日本大耳白兔.在有弗氏佐剂条件下,5次免疫后采集抗血清,斑点印迹试验显示制备的抗gC多克隆抗体与合成肽的反应效价为1:10000;经亲和层析柱纯化后的gC抗体具有良好的反应特异性,对转染或MDV感染的细胞中运用免疫荧光试验和免疫印迹技术均能检测到特异的阳性信号.与疫苗毒相比,广西野毒分离株gC蛋白的免疫荧光信号更强.本研究获得的MDV的gC多克隆抗体可用于后续对gC蛋白功能的研究.

摘要： 为了解从贵阳市某养殖场矮脚黄鸡病料中分离的马立克氏病病毒(MDV)的遗传变异情况及meq基因的分子特征,试验对临床病料进行MDV meq基因PCR检测、克隆及序列分析.结果:从检测样品中扩增出1020 bp MDV meq基因片段(命名为MDV GZ 2019 meq),将该片段克隆至pMD19-T载体,经测序为1020 bp序列.同源性分析结果显示:该病毒株与国内特超强毒MDV分离株GXY2株的核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性最高,分别为99.8％、99.4％;推导氨基酸序列比对结果显示存在5个突变位点,分别为第63位(R→G)、第80位(D→Y)、第139位(T→A)、第176位(P→R)、第217位(P→A).除第63位突变位点外,其余4个突变位点均与GXY2株一致.结论:本次分离的MDV贵州株与国内特超强毒MDV分离株GXY2株同源性最高,推测其为MDV强毒株.

摘要： 目的 建立检测马立克氏病病毒的双抗夹心液相芯片技术方法.方法 将捕获抗体偶联到19号微球,分别确定捕获抗体的偶联量、检测抗体和SA-PE抗体的工作浓度,用建立的液相芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及临床样品的分析.结果 1×106个荧光编码微球的抗体偶联量为2 μg,最佳的检测抗体与SA-PE的工作浓度分别为2 μg/mL和4μg/mL.该方法特异性强,只检出马立克氏病病毒,其他病毒未检出;灵敏度为125 pfu/mL;批内批间的变异系数分别为0.85％和2.4％;对58份临床样品检出率为31％.与PCR方法比较,符合率为94.8％.结论 建立的马立克氏病病毒液相芯片检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点.该方法可用于马立克氏病的监测,也可用于SPF鸡的筛选.

摘要： 为了进一步探讨马立克氏病病毒(MDV)诱导肿瘤发生发展机制，本研究采用基因芯片技术，筛选MDV诱导鸡肝脏肿瘤形成的相关基因表达谱，共得到269个差异表达基因，其中上调的有175个，下调的有94个。经实时荧光定量RT-PCR验证后，用生物信息学工具(IPA)对表达基因进行功能注释与分析。结果表明只有171个基因是已知的，98个基因是功能未知的，另外差异表达基因变化最显著的生物学功能有75种。基因网络分析发现了19个显著变化的网络，主要涉及细胞装配、DNA复制、重组与修复、细胞周期等方面。本研究利用基因芯片技术成功地筛选出MDV诱导鸡肝脏肿瘤形成相关基因表达谱，初步揭示了肿瘤形成相关基因表达的规律和功能互作关系，为研究MDV诱导的肿瘤发生发展的分子机制提供一定的基础依据。

摘要： 马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒血清1型(MDV1)引起的鸡高度接触性淋巴细胞增生性疾病。MDV1在体内的复制状况与其致病性强弱及传播能力直接相关。本实验选择近年从国内不同地区MD暴发鸡场分离的6株MDV1强毒株、弱毒疫苗“814”株和国内标准MDV1强毒J-1株，分别人工感染SPF鸡。采用双重实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法，检测感染后1d～28d病毒在淋巴细胞和羽髓中的复制状况。结果显示，接种1d后即可在淋巴细胞中检测到MDV1(102.6～105.2copies/106cells）；在检测期间，淋巴细胞中病毒载量略有上升的趋势，总体呈现不规律变化，且变化并不明显。接种7d后羽髓中病毒载量开始显著增加，14d～21d达到峰值，超强毒株峰值处病毒载量可达到107copies/106cells，峰值期病毒载量是感染前期(1d～7d)的100～10000倍。强毒株在体内的病毒载量高于弱毒株，即复制能力高于弱毒株。研究表明，MDV1国内流行的毒株有增殖速度快，病毒载量高的新特点；MDV1致病性的高低与在其在体内的复制能力的高低正相关。

摘要： 本文对整合有禽反转录病毒(REV)长末端重复序列(LTR)的马立克氏病病毒(命名为GX0101)的毒力进行了测定.对用HVT疫苗免疫的SPF鸡人工接种MDV野毒株GX0101及国际标准超强毒株rMd5毒力比较试验显示,rMd5对HVT免疫的SPF鸡的致死率高达64.63%而GX0101对HVT免疫的SPF鸡的致死率仅仅只有28.24%,比标准株rMd5低36.39个百分点,差异极显著.

摘要： 马立克氏病病毒(MDV)编码一种病毒性趋化因子——类白细胞介素8(vIL8)，其在致病致瘤中的作用尚不完全明了。本研究通过PCR方法克隆了vIL8 5’端潜在的启动子片段，构建不同长度的vIL8启动子控制下的pGL3-LUC表达载体，转染鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚法氏囊细胞(CEB)，并利用荧光素酶检测系统检测启动子的活性，分析病毒对vIL8的调控作用。结果表明：本研究成功克隆出vIL8启动子(-1362～+81)片段，并通过PCR方法克隆出不同大小片段(-1336～+10，-1094～+10，-882～+10，-630～+10，-470～+10，-176～+10)的调控序列，成功构建了6个pGL3/vIL8启动子报告基因表达载体；重组表达载体转染实验表明，vIL8启动子在CEF和CEB中均有活性，但在两种细胞中启动子活性有所差异，-470～+10片段在CEB中相对活性达23.2，但在CEF中相对活性近于0，提示在-470～-176区域存在淋巴组织特异性的转录调节元件结合区，vIL8基因的启动子具有淋巴组织特异性。这为深入研究vIL8转录表达的调控机制进而揭示vIL8在MDV致病致瘤中的功能提供了理论依据。

摘要： 马立克氏病病毒(MDV)被膜蛋白VP22被证实能在细胞间高效转导，为了进一步证明VP22能够作为蛋白转运的载体，将4种不同的异源蛋白与马立克氏病病毒1型(MDV-1)CV1988-/Rispens株VP22蛋白融合表达，通过观察这些融合蛋白的细胞定位以及它们的细胞间扩散能力来研究VP22转运蛋白的情况，结果发现，禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)、牛γ干扰素(BIFN-γ)及新城疫病毒(NDV)F蛋白能够被MDV-1 VP22转运，而鸡法氏囊病病毒(IBDV)蛋白VP2则不能被MDV-1VP22转运，上述结果说明MDV-1 VP22蛋白能够作为蛋白转运的载体，但对所转运的蛋白具有选择性。

摘要： 从山东省东营、日照、潍坊、聊城等地区肉种鸡群采集102份有肿瘤病变的病、死鸡肝脏样品，用特异性核酸探针对样品进行马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)、网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosisvirus，REV)、鸡传染性贫血病病毒(Chicken anemia virus，CAV)检测。结果，MDV、REV、CAV的检出率分别为88．24％、79．41％、47．06％，且存在严重的共感染现象，三重感染检出率达30．39％；二重感染检出率为59．80％，以MDV和REV共感染检出率最高，为44．12％：单一感染和阴性个体仅占3．92％和1．96％。上述结果表明，多种免疫抑制性病毒的共感染已普遍存在，是目前肿瘤性疾病发病率日趋上升的重要流行病学因素之一。

摘要： 从山东省东营、日照、潍坊、聊城等地区自然发病和临床健康AA商品肉鸡群中分别采集脏器样品，用特异性核酸探针对样品进行马立克氏病病毒(Marek’s diseasevirus，MDV)、网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotlleliosisvirus，REV)、鸡传染性贫血病病毒(Chicken anemia virus，CAV)和禽呼肠孤病毒(Avianreoviruses，ARV)检测。结果，自然发病从商品肉鸡群中MDV、REV、CAV和ARV的检出率均较高，分别为69．30％、57．46％、63．60％和67．11％；临床健康AA商品肉鸡群中MDV、REV、CAV的检出率分别为36．96％、43．48％和30．42％，且自然发病和健康鸡群中均存在不同病毒组合的多重感染，感染率分别为85．96％和43．46％。用X2检验进行分析发现，自然发病商品肉鸡群与临床健康商品肉鸡群中MDV、CAV、MDV+REV、REV+CAV的检出率和来检出的比例差异极显著(P<0．01)；REV、MDV+CAV检出率差异显著(P<0．05)。对自然发病商品肉鸡的肝脏、脾脏、法氏囊中4种病毒检出率进行X2检验分析发现，MDV在脾脏中检出率显著高于肝脏和法氏囊；REV在法氏囊中检出率显著高于肝脏和脾脏，而CAV和ARV分别在脾脏和肝脏中检出率较高。rn 上述结果表明，多种免疫抑制性病毒的共感染已普遍存在，是目前AA商品肉鸡易发病且生长缓慢的重要流行病学因素之一。

摘要： 本实验室于2009年在广东省某鸡场分离到一株强毒MDV，命名为GD0908。将GD0908的全基因组作为细菌人工染色体(BAC)克隆进大肠杆菌，构建了GD0908的感染性克隆。BAC载体通过同源重组插入MDV基因组的US2区，包含BAC载体的MDV DNA电转化大肠杆菌菌株DH10B，鉴定包含GD0908全基因组的BAc克隆后将BAC DNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，成功拯救出了重组病毒，命名为rGD0908，rGD0908与父代病毒GD0908在细胞上的生长速度没有差异。该感染性克隆为研究MDV致病机理提供了有效的技术平台。

摘要： 本实验室于2009年在广东省某鸡场分离到一株强毒MDV，命名为GD0908。将GD0908的全基因组作为细菌人工染色体(BAC)克隆进大肠杆菌，构建了GD0908的感染性克隆。BAC载体通过同源重组插入MDV基因组的US2区，包含BAC载体的MDV DNA电转化大肠杆菌菌株DH10B，鉴定包含GD0908全基因组的BAc克隆后将BAC DNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，成功拯救出了重组病毒，命名为rGD0908，rGD0908与父代病毒GD0908在细胞上的生长速度没有差异。该感染性克隆为研究MDV致病机理提供了有效的技术平台。

摘要： 本发明提供了一种抑制马立克氏病病毒复制的药物，包括去泛素化酶UL36抑制剂，以及一种预防或抗马立克氏病药物。通过抑制病毒编码的酶活性实验、CEF细胞水平上进行药物毒性实验、病毒CPE抑制实验和鸡马立克氏病模型实验，本发明首次筛选出去泛素化酶UL36抑制剂DUBs‑IN‑1及其衍生物，不仅能够在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制马立克氏病病毒的复制，还可在动物水平上抑制马立克氏病肿瘤生长和内脏出血，且具有效果极强，剂量小的优点，可作为抗MD药物广泛用于养禽业防御马立克氏病的生产实践中。

摘要： 本发明公开了新型重组多价非致病性马立克氏病病毒构建体及以及在家禽疫苗中使用它们的方法，所述构建体编码并表达传染性喉气管炎病毒蛋白抗原和传染性法氏囊病病毒蛋白抗原二者。

摘要： 本发明公开了一种表达J亚群禽白血病病毒(ALV‑J)Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，属于医学或兽医学技术领域。本发明利用重组克隆技术，将包含ALV‑J Gag和Env基因以及CAG启动子序列的基因片段CAG‑ALVGE插入到鸡马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因内部，构建获得在US2基因内部插入CAG‑ALVGE表达框的重组粘粒，由其拯救获得表达ALV‑J Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株。研究表明，本发明获得的疫苗株具有与亲本毒814疫苗株同等的体外复制能力以及良好的遗传稳定性，并且能够同时抵抗MDV超强毒株以及ALV‑J超强毒株的攻击。由此可见，本发明获得的表达ALV‑J Gag和Env基因的重组MDV疫苗株可以用于制备预防或治疗禽白血病和鸡马立克氏病的药物。

摘要： 本发明公开了一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物、试剂盒及方法。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病原。本发明方法，能够同时检测鉴别鸡传染性贫血病毒和鸡马立克氏病病毒，而且具有特异性强，灵敏度高，重复性好等优点，可实现同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测。本发明灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病原的种类。

摘要： 本发明提供了一种抑制马立克氏病病毒复制的药物，包括去泛素化酶UL36抑制剂，所述去泛素化酶UL36抑制剂为雷公藤提取物，以及一种预防或抗马立克氏病的药物。通过抑制病毒编码的酶活性实验、CEF细胞水平上进行药物毒性实验、病毒CPE抑制实验和鸡MD模型实验证明了所述雷公藤提取物能有效地抑制马立克氏病病毒的复制和鸡MD肿瘤的产生，在禽类养殖业具有良好的应用前景。

摘要： 本发明提供了一种抑制马立克氏病病毒复制的药物，包括去泛素化酶UL36抑制剂，以及一种预防或抗马立克氏病药物。通过抑制病毒编码的酶活性实验、CEF细胞水平上进行药物毒性实验、病毒CPE抑制实验和鸡马立克氏病模型实验，本发明首次筛选出去泛素化酶UL36抑制剂DUBs‑IN‑1及其衍生物，不仅能够在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制马立克氏病病毒的复制，还可在动物水平上抑制马立克氏病肿瘤生长和内脏出血，且具有效果极强，剂量小的优点，可作为抗MD药物广泛用于养禽业防御马立克氏病的生产实践中。

摘要： 公开了编码马立克氏病病毒的gp82多肽的核苷酸序列。可用作疫苗保护抗马立克氏病的重组病毒也被公开,该重组病毒优选含有位于禽痘病毒DNA中对于病毒生长不必要的区域中的、在痘病毒启动子调控下的两种或更多的编码如糖蛋白B和糖蛋白gp82的马立克氏病病毒抗原的基因。还提供了具有协同免疫保护作用的疫苗,其含有与火鸡疱疹病毒组合的表达马立克氏病病毒gB蛋白的重组禽痘病毒。还提供了包括施用任何本公开疫苗的免疫家禽的方法。

摘要： 本发明公开了新型重组多价非致病性马立克氏病病毒构建体及以及在家禽疫苗中使用它们的方法，所述构建体编码并表达传染性喉气管炎病毒蛋白抗原和传染性法氏囊病病毒蛋白抗原二者。

摘要： 本发明公开了二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列，其中引物7与引物1互补的探针、引物14为与引物8互补的探针，它们使扩增反应具有很高的特异性，能分别与MDV meq基因和ALV‑J gp85基因结合，反应后在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光，从而实现快速敏感特异的鉴别MDV和ALV‑J。据此，还研制了相应试剂盒并建立相应LAMP方法。总之，本发明具有特异性强、灵敏度高、快速简便的特点，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中快速检测，具有较好的应用前景。

摘要： 本发明公开了一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物、试剂盒及方法。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病原。本发明方法，能够同时检测鉴别鸡传染性贫血病毒和鸡马立克氏病病毒，而且具有特异性强，灵敏度高，重复性好等优点，可实现同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测。本发明灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病原的种类。