人类人工染色体(HAC)载体和包含人类人工染色体(HAC)载体的人类细胞药物

摘要

本发明涉及携带来源于人染色体的着丝粒、亚端粒序列和端粒序列的人类人工染色体(HAC)载体；包含HAC载体的人细胞药物或人细胞；制备HAC载体和人细胞的方法；以及用HAC载体生产治疗性蛋白的方法。

说明书

发明领域

本发明提供了包含来源于人染色体的着丝粒、亚端粒序列和端粒序列的人类人工染色体(HAC)载体。本发明也提供了包含HAC载体的人类细胞药物或人类细胞。所述人类细胞(药物)可以用于基因治疗和再生医学。本发明也提供了制备包含HAC载体的人细胞、HAC载体，和制备HAC载体的方法。此外，本发明提供了用HAC载体生产治疗性蛋白的方法。

发明背景

HAC载体

将基因导入哺乳动物细胞中时常用的常规载体，如质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或病毒载体具有在附加体的情况下导入的基因瞬时表达的问题。但是，当基因整合到宿主细胞的染色体中时，所述常规染色体有一些问题，如宿主染色体基因被破坏、导入的基因的拷贝数不受调控、导入的基因被灭活，或基因表达受到宿主染色体(基因整合到其中)的控制序列的影响。

作为解决所述问题的手段，由本发明人组成的研究小组构建了新的HAC(21HAC)载体系统，所述构建是使用人21号染色体作为起始材料，从中除去具有明显结构的不必要的基因，所述起始材料能够容易导入外源DNA(WO 2004/031385；Katoh et al.，Biochem Biophys Res Commun；321：280-290，2004)。在这些文件中，本发明人证明了21HAC载体能够在哺乳动物宿主细胞(包括人)中自主复制和分布，21HAC载体稳定保持，并且可以导入给定拷贝数的基因而不破坏宿主染色体。他们也证明作为意欲用于离体激素替代基因治疗模型而导入的、其中导入了治疗性基因，即人红细胞生成素(hEPO)的21HAC载体可以导入培养的正常原代人成纤维细胞中，EPO表达可以长时间保持，其表达水平可以抑制到CHO细胞水平的大约1/1,000的水平，导入了HAC的培养的正常原代人成纤维细胞可以从单集落扩增到最多3.8 x 10⁷个细胞，在非选择性条件下传代培养6-9次后可以保留65.5％-90.9％的基因(WO 2004/031385；Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)。

在离体EPO替代基因治疗的狒狒模型中，据报道，用逆转录病毒载体导入了hEPO基因的培养的原代狒狒MSCs(0.81-6.6×10⁶个细胞/kg)的胶囊的皮下移植导致了提高的血液EPO水平和从贫血的恢复(Bartholomew，A.et al.，Hum Gene Ther；12：1527-1541，2001)。但是，对于基因治疗的目的，需要每个细胞的表达水平的进一步改进。从限制培养的正常原代人成纤维细胞分裂的观点，细胞分裂事件的数目优选是小的。为了有效扩增可以在体内表现出效果的、导入了治疗性HACs的细胞，应该改进和增强载体的稳定性。

用于解决前述问题的手段的一个实例是使用高度稳定的人染色体作为起载体基本骨架作用的人类染色体，构建具有功能性端粒的HAC载体。

已知外源基因的表达受到染色质结构或插入位点附近存在或不存在控制序列的影响。也已知足够长度的功能性端粒是为了稳定保持染色体所必须的(Smogorzewska，A.et al.，Anuu.Rev.Biochem.，vol.73，pp.177-208，2004)。尽管存在用绝缘子来消除染色质结构或控制序列对HAC的影响的实例(Otsuki et al.，Biochem Biophys Res Commun；329：1018-1025，2005)，还没有检查到染色质结构或控制序列的影响的消除，并且所述绝缘子将不会调节端粒序列。同样，还没有检查到通过端粒序列调节对HAC载体稳定性的改进，如在HAC上的端粒酶的辅助下，添加端粒序列或恢复端粒长度。

同源重组效率的改进

当导入外源基因时，通常导入药物抗性基因，以选择导入了目的基因的细胞。在很多情况下，药物抗性基因与相同载体中的靶外源基因平行放置。当多个基因表达单位平行排列时，已知它们彼此干扰，并且外源基因的表达水平降低。到目前为止，当构建高水平表达/生产细胞时，药物抗性基因作为外显子放置，剪切，并且表达以降低药物抗性，并且选择以高水平表达导入的基因的细胞，以提高表达水平(Barnett，R.S.etal.，Antibody expression and engineering，第3章，p.27-40，AmericanChemical Society，1995)。但是，没有关于从药物抗性基因的消除导致外源基因的显著改进的表达的报道。

已知当在抗体轻链κ基因座中敲入外源基因时，除去位于下游的药物抗性基因能够改进小鼠ES细胞中的同源重组效率(JP PatentPublication(kokai)No.2006-94849(A))，但其目的不是改进外源基因表达。

人染色体和基因表达的稳定性

作为涉及小鼠ES细胞的实验的结果，已知导入细胞中的较大染色体片段导致单个嵌合体中所述细胞的较低贡献比。由本发明人组成的研究小组证明了通过将人14、2和22号染色体片段，包括抗体基因导入小鼠胚胎干细胞，可以制备单个嵌合体，在个体中功能性表达导入的抗体基因，人染色体片段在单个嵌合体中稳定保持，并且所述基因可以通过种系由下一代遗传(Tomizuka et al.，Nature Genet.，U.S.A.，vol.16，pp.133-143，1997；和Tomizuka et al.，P.N.A.S.，U.S.A.，vol.97，pp.722-727，2000)。检验来源于人14号染色体的天然片段，即SC20(其已经分离，以制备携带人抗体重链基因的小鼠)和通过将包含抗体轻链基因的人22号染色体区域克隆到SC20中制备的HAC在小鼠中的稳定性和种系传递(Kuroiwa et al.，Nature Biotech.，U.S.A.，vol.18，pp.1086-1090，2000)。此外，本发明人证明了可以在通过体细胞核移植制备的克隆的牛个体中稳定保持上述来源于SC20的HAC，并且可以在个体中功能性表达导入的抗体基因(Kuroiwa et al.，Nature Biotech.，U.S.A.，vol.20，pp.889-894，2002)。还没有检查上述来源于人14号染色体的天然片段和HAC在培养的正常原代人细胞或人细胞系中的稳定性和表达。此外，还没有完全检查其它来源于人染色体的天然片段和HACs(除了人21号染色体)在培养的正常原代人细胞或人细胞系中的稳定性和表达。尽管存在报道物的实例，其中人细胞系保持了来源于人X染色体的微染色体(Mills et al.，Hum.Mol.Genet.，U.K.，vol.8，pp.751-761，1999)，但发现这些微染色体在传代培养后导致显著数目的多拷贝，并且保持给定数目的拷贝仍然是困难的。

端粒对表达和稳定性的调节

端粒是位于染色体末端的重复序列，其在从酵母细胞到哺乳动物细胞，包括人的广泛生物物种中是保守的。在正常人细胞中，TTAGGG的重复序列达到15-0.4kb的大小。随着细胞分裂的进行，端粒变得更短，并且异染色体(即涉及融合、离去、分裂、染色体数目的改变等)随着端粒长度变得更短而出现或增加。因此，端粒被认为是染色体稳定性的保护和维持所必须的(Smogorzewska，A.et al.，Anuu.Rev.Biochem.，vol.73，pp.177-208，2004；和Ning，Y.et al.，Hum Mol Genet.，vol.12，pp.1329-1336，2003)。因此，认为具有足够长度的功能性端粒结构导致染色体稳定性的改进。

通过端粒酶的强制表达或端粒结合蛋白(POT·TRF2)的去除，可以人工延长端粒长度(Crisrofari，C.et al.，EMBO J，vol.25，pp.565-574，2006；Smogorzewska，A.et al.，Anuu.Rev.Biochem.，vol.73，pp.177-208，2004)。这些技术证明了细胞分裂事件的数目增加和在培养的正常原代人细胞和人细胞系中的寿命延长；但是，还没有阐明染色体稳定性是否可以恢复和改进。当在危机后内源性端粒酶活性升高并且缩短的端粒酶被延长以及保持在给定长度时，永生化细胞中出现异染色体的频率是恒定的，没有增加或减少(Counter，C.M.et al.，EMBO J，vol.11，pp.1921-1929，1992)。但是，在这种情况下，没有实现染色体稳定性的恢复和改进。

亚端粒是大约300-500kb的染色体区，其邻接染色体末端上的端粒(TTAGGG)n重复序列的着丝粒侧，并且具有断裂/重叠的结构域或(TTAGGG)n样重复序列。由于断裂/重叠的结构域结构的高度同源性，已知在相同染色体的亚端粒内或不同染色体的亚端粒之间高度可能发生置换或重组(Mefford，H.C.et al.，Nat Rev Genet.，vol.3，pp.91-102，2002；Riethman，H et al.，Chromosome Res.，vol.13，pp.505-515，2005；Linardopoulou，E.V.et al.，Nature，vol.437，pp.94-100，2005)。人14号染色体的长臂的亚端粒长度鉴定为499bp的断裂/重叠的结构域，并且提出了端粒序列(TTAGGG)n和亚端粒区之间存在未鉴定的20kb或更短的序列(Riethman H et al.，Genome Res.，vol.14，pp.18-28，2004)。由于亚端粒在缺乏端粒酶的情况下起作用，例如，通过利用高度同源性的重组加速而恢复和保持端粒，提出了由于亚端粒可塑性而适应新环境，并且诱导导致疾病的置换和缺失，但其细节还没有阐述。

关于端粒和基因表达之间的关联，或端粒和亚端粒以及基因表达之间的关联，在具有随机插入端粒序列后末端被端粒序列取代的染色体的细胞中观察到导入的外源基因在端粒近端侧的表达受到通过异染色体化进行的沉默的影响(即端粒位置效应(TPE))(Tham WH et al.，Oncogene，vol.21，pp.512-521，2002)。关于TPE，报道了端粒延长与沉默相关(BaurJA et al.，Science，vol.292，pp.2075-2077，2001)。但是，关于内源端粒区的基因表达，在传代培养之前和之后，在新生儿人包皮成纤维细胞中基因表达模式和端粒长度或离开端粒末端的距离减少之间没有关联(NingY et al.，Hum Mol Genet.，vol.12，pp.1329-1336，2003)。因此，还没有概括出关于端粒和基因表达之间的关联的讨论。

发明公开

本发明提供了人类人工染色体(HAC)载体，其在细胞中稳定保持，并且能够以高水平表达外源基因，并且提供了制备所述载体的方法。本发明也提供了用于基因治疗和再生医学的人类细胞药物(或药剂)及生产所述药物的方法。此外，本发明提供了生产用于治疗的蛋白的方法。

为了实现这些目的，本发明人致力于研究存在于人染色体中的端粒序列和亚端粒序列，并且他们尝试了构建包含位于人工染色体末端的端粒序列和/或亚端粒序列的人类人工染色体载体。

作为一个实例，本发明人制备了修饰的人染色体(14HAC)载体，这是通过从人14号染色体的长臂除去几乎所有已知的基因(着丝粒区、端粒序列和部分亚端粒序列除外)，并且以定点方式在长臂近侧区插入loxP序列(图1)。他们证实了在非选择性条件下长期传代培养携带14HAC载体的CHO杂交细胞使得能够维持14HAC载体的给定拷贝数，而不显著离去，并且所述传代培养可以实现与常规21HAC载体相比，14HAC载体稳定性的显著改进(WO 2994/031385)(图13)。此外，发现已经用Cre/loxP系统导入了人促红细胞生成素(hEPO)基因，即红细胞生长因子的携带14HAC载体的CHO杂交细胞表现出增强的hEPO表达，比用常规21HAC载体实现的表达高2.5倍。此外，发现导入了hEPO基因的携带14HAC载体的培养的正常原代人成纤维细胞表现出增强的hEPO表达，比用常规21HAC载体实现的表达高11.7倍(图21)。

为了检验所述效果的原因，本发明人比较了包含端粒序列和来源于人染色体的部分亚端粒序列的HAC载体的表达效率。结果，发现与仅仅包含位于去除了长臂的末端上的端粒序列的HAC载体相比，所述HAC载体在人正常成纤维细胞中使hEPO表达增强大约4倍。这些HAC载体在位于去除了长臂的末端上的亚端粒序列方面彼此不同，但是它们在染色体基本骨架和导入外源基因(如hEPO)的位点方面彼此相同。因此，认为上述表达的显著增强是由人14号染色体的修饰导致的，使得在去除了长臂的末端上包含亚端粒序列。

发现人类人工染色体载体中亚端粒序列的存在增强了外源基因或外源DNA的表达水平，并且积极影响转导的细胞中载体的稳定保持和遗传效率的增强。除人类人工染色体14载体外，在从人21号染色体制备的人类人工染色体(HAC)载体中也发现了所述效果。因此，以相同方式从除人14或21号染色体外的任何人染色体制备的HAC载体可以表现出类似于来源于人14或21号染色体的HAC载体实现的效果。

基于这些发现，本发明人发现了采用基于人染色体的HAC载体可以实现上述目的。这导致了本发明的完成。

为了实现上述目的，本发明人进一步进行了集中的研究，目的是构建能够以高水平表达导入正常人细胞或人细胞系并且可以在其中稳定保持的基因的染色体载体。已知当导入外源基因时，多个平行排列的基因表达单位会彼此干扰，并且减弱位于转录方向下游的单位的表达(Proudfoot，N.J.et al.，Nature，vol.332，pp.562-565，1986；Kadesch，T.etal.，Mol Cell Biol，vol.6，pp.2593-2601，1986)。在上述用于导入hEPO的21HAC载体(WO 2994/031385)中，neo抗性基因表达单位邻接hEPO基因表达单位下游的位点。作为用于增强hEPO基因表达的手段，邻接hEPO基因表达单位下游位点的neo抗性基因表达单位可以从HAC载体除去。更具体地，通过从长臂去除几乎所有已知的基因，从人染色体制备修饰的染色体。以定点方式将loxP序列、FRT序列和hCMV启动子插入修饰的染色体的长臂近侧区。用Cre/loxP系统将hEPO基因作为外源基因导入携带修饰的染色体的CHO杂交细胞中的修饰的染色体中。用FLPe/FRT系统除去neo抗性基因表达单位。然后，将产物导入携带修饰的染色体的培养的正常原代人成纤维细胞，所述修饰的染色体中导入了hEPO。结果，发现与常规21HAC载体相比，本发明的14HAC载体表现出hEPO表达平均改进了18.5倍(图21)。基于所述发现，本发明人发现采用去除了抗性基因表达单位的HAC载体可以实现上述目的。这导致完成了本发明。

具体地，本发明概括如下。

第一方面，本发明提供了包含人染色体片段的人类人工染色体载体，所述片段去除了长臂和/或短臂远侧区，并且包含添加到或结合于所述经去除的长臂和/或短臂远端来源于人染色体的着丝粒和端粒序列和/或亚端粒序列(优选来源于人染色体的亚端粒序列)。

在一个实施方案中，本发明提供了包含人14号染色体片段的人类人工染色体(HAC)载体，所述片段去除了长臂和/或短臂远侧区，并且包含(i)来源于人14号染色体的着丝粒，(ii)端粒序列，和(iii)亚端粒序列。

在另一实施方案中，本发明提供了包含人21号染色体片段的人类人工染色体(HAC)载体，所述片段去除了长臂和/或短臂远侧区，并且包含(i)来源于人21号染色体的着丝粒，(ii)端粒序列，和(iii)亚端粒序列。

在本说明书中，本发明的HAC载体不总是包含自发人染色体片段或天然存在的人染色体片段。当所述片段具有前述特性并且被人工分离时，所述片段解释为包含在本发明的范围内。

根据另一实施方案，HAC载体可以包含：(iv)插入给定位点中的外源DNA(或外源基因或核酸)。

在本发明的另一实施方案中，人染色体片段的大小通常是大约1Mb或更大；例如，大约1Mb-大约19Mb，优选大约18Mb或更小，更优选大约17Mb或更小，但大小不特别限于此。所述大小受到人染色体类型、去除长臂远侧区或短臂远侧区后染色体片段中保留的长臂近侧区的长度、短臂近侧区或短臂的长度等的影响。

根据本发明的另一实施方案，可以从人染色体片段去除人染色体的长臂远侧区，并且得到的染色体片段可以包含长臂近侧区与短臂。或者，人染色体片段可以由于去除而缺乏短臂远侧区，并且可以包含短臂近侧区。或者，人染色体片段可以由于去除而缺乏长臂远侧区与短臂远侧区这两者，并且可以包含长臂和短臂近侧区。

通过基于切割的靶区域的核苷酸序列，例如，保存在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的在线基因组数据库，人类基因组来源(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)中的核苷酸序列设计靶序列(即导向载体)并且使用该靶序列，可以切割和去除人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区。

根据本发明的另一实施方案，在人染色体长臂的q11区内或q11区与q12区之间去除人染色体片段的长臂远侧区。

根据本发明的另一实施方案，在人染色体短臂的q11区内或q11区与q12区之间去除人染色体片段的短臂远侧区。

例如，在14q区内，优选在14q11区内，进一步优选在AL391156，或在比AL391156更近侧的位点，特别是AL391156和CR383659之间，进一步优选在AL512310和CR383659之间，进一步优选在AL929601和CR383659之间，进一步优选在AL589182和CR383659之间，进一步优选在AL589743和CR383659之间，进一步优选在AL929602和CR383659之间，进一步优选在AL512624和CR383659之间，进一步优选在CR383657和CR383659之间，进一步优选在CR383659去除人14号染色体的长臂远侧区。

在例如14p区内，优选在14p11区与14p12区之间，进一步优选在14p11.1区与14p11.2之间，进一步优选在14p11.1区内，进一步优选在选自RNR2和PABPCP2的任何位置去除人14号染色体的短臂远侧区。

作为另一个实例，去除人21号染色体的长臂远侧区，例如，在21q区内，优选在21q11区内，进一步优选在21q11.1区与21q11.2区之间。去除的位置在例如比21q11.1的NT_011512更近侧的区域，优选在比含NT_011512的区域内的AL16202更近侧的区域，进一步优选在比含AL16202的区域内的AP001657或AP001657更近侧的区域。

也可以去除人21号染色体的短臂远侧区，例如，在21p区内，优选在21p11.1区与21p11.2区之间，进一步优选在21p11.1区内，进一步优选在AL163201。

根据另一实施方案，端粒序列是具有重复序列，例如TTAGGG的核苷酸序列。所述序列的实例包括但不特别限于人工合成的序列和来源于哺乳动物染色体(包括人染色体)的长臂或短臂的序列。端粒序列优选来源于人染色体，进一步优选与亚端粒序列来源于相同的染色体。

根据本发明的另一实施方案，端粒序列的长度是大约0.4-50kb，优选大约0.4-25kb，进一步优选大约0.4-15kb。

根据另一实施方案，端粒序列来源于人染色体的长臂或短臂，并且它是来源于任何人染色体，例如人14号染色体或人21号染色体的亚端粒序列。根据一个具体的实施方案，上述人染色体片段在一个位点包含来源于相同或不同(优选相同)人染色体的长臂的亚端粒序列，所述位点是长臂远端区去除的位点。

根据本发明的进一步的实施方案，亚端粒序列的大小是大约1-500kb，优选大约1-300kb，进一步优选约1-100kb，进一步优选约5-60kb，进一步优选5-40kb，进一步优选约25-60kb，更进一步优选约25-40kb。

根据一个优选实施方案，人14或21号染色体片段在长臂远侧区的一个位点中包含来源于人14或21号染色体的长臂的端粒序列和亚端粒序列，所述位点以上文描述的方式去除。

根据另一实施方案，来源于人14号染色体的亚端粒序列和端粒序列是人14号染色体的14q32区中的位点与14q-tel区之间的序列。所述序列优选是人14号染色体的14q32.33区与14q-tel区之间的序列，进一步优选是人14号染色体的选自AB019439、AB019438和AB019437的任何标记物与14q-tel区之间的序列。特别优选的是人14号染色体的AB019437与14q-tel区之间的序列。

根据另一实施方案，来源于人21号染色体的亚端粒序列和端粒序列是人21号染色体的21q22.3区与21q-tel区内的端粒末端和端粒序列之间的序列。亚端粒序列优选是人21号染色体的任意位点与21q-tel区内的端粒末端之间的序列，优选NT_011515与21q-tel区内的端粒末端之间的序列。

根据进一步的实施方案，本发明的人类人工染色体载体可以包含人染色体片段，所述片段进一步包含至少一个定点重组酶识别位点。例如，定点重组酶的识别位点插入人染色体片段的长臂近侧区与/或短臂近侧区中。

根据一个优选的实施方案，定点重组酶的识别位点插入比人染色体去除长臂或短臂的位点(缺失位置)更接近着丝粒侧的位点(即“近侧位点”)中。

例如，在人14号染色体的情况下，定点重组酶的识别位点插入14q区中，优选比人14号染色体的长臂近侧区的14q11区中的缺失位点更近侧的位点，进一步优选插入AL391156与CR383659之间的位点中，进一步优选插入AL512310和CR383659之间的位点中，进一步优选插入AL929601与CR383659之间的位点中，进一步优选插入AL589182和CR383659之间的位点中，进一步优选插入AL589743和CR383659之间的位点中，进一步优选插入AL929602和CR383659之间的位点中，进一步优选插入AL512624和CR383659之间的位点中，进一步优选插入CR383657和CR383659之间的位点中，进一步优选CR383659。根据另一实施方案，定点重组酶的识别位点插入比缺失位置更近侧的位点中；例如，人14号染色体的短臂14p区中，进一步优选人14号染色体的短臂近侧区的14p11区与14p12区之间，进一步优选人14号染色体的短臂近侧区的14p11区中。

例如，在人21号染色体的情况下，定点重组酶的识别位点插入比21q区中的缺失位置更近侧的位点中，优选插入人21号染色体的长臂近侧区的21q11.1区与21q11.2区之间的更近侧的位点中，例如，优选插入21q11.1的NT_011512区中的更近侧位点中，含NT_011512的区域中的AL16202区中的更近侧位点，进一步优选插入含AL16202的区域内的AP001657或AP001657中的更近侧位点中。根据另一实施方案，将至少一个定点重组酶识别位点插入比人21号染色体的短臂中的缺失位点更近侧的位点；例如，21p区中的21p11.1区与21p11.2区之间的位点，进一步优选人21号染色体的短臂近侧区的21p11.1区中的位点，进一步优选AL163201。

根据一个优选实施方案，定点重组酶是酶Cre，并且定点重组酶的识别位点是loxP序列。根据另一优选实施方案，定点重组酶是FLPe酶，并且定点重组酶的识别位点是FRT序列。

在本发明的另一实施方案中，本发明的人类人工染色体载体包含人染色体片段，该片段包含至少两类定点重组酶识别位点。例如，至少两类定点重组酶识别位点插入人染色体的长臂近侧区与/或短臂近侧区中。这使得能够用一个定点重组酶识别位点导入外源基因，并且用另一定点重组酶识别位点除去不必要的药物抗性基因表达单位。

在这种情况下，如上文所述，将多个定点重组酶识别位点插入比人染色体的长臂或短臂的缺失位置更接近着丝粒(即近侧位点)的位点中。

例如，在人14号染色体的情况下，定点重组酶的识别位点如上文所述。即，它插入14q区中，优选比人14号染色体的长臂近侧区的14q11区中的缺失位点更近侧的位点，进一步优选AL391156与CR383659之间的位点，进一步优选AL512310和CR383659之间的位点，进一步优选AL929601与CR383659之间的位点，进一步优选AL589182和CR383659之间的位点，进一步优选AL589743和CR383659之间的位点，进一步优选AL929602和CR383659之间的位点，进一步优选AL512624和CR383659之间的位点，进一步优选CR383657和CR383659之间的位点，进一步优选CR383659中的位点。根据另一实施方案，例如，定点重组酶的识别位点优选插入比人14号染色体的短臂中的缺失位置更近侧的位点中，进一步优选人14号染色体的短臂近侧区的14p11区与14p12区之间的位点，进一步优选比人14号染色体的短臂近侧区的14p11区中的缺失位置更近侧的位点。

例如，在人21号染色体的情况下，定点重组酶的识别位点插入21q区中，优选比人21号染色体的长臂近侧区的21q11.1区与21q11.2区之间的缺失位置更近侧的位点，例如，21q11.1的NT_011512区中的位点，优选含NT_011512的区域中的AL16202区中的位点，进一步优选插入含AL16202的区域中的AP001657的缺失的位点，或AP001657中的缺失位置。根据另一实施方案，将定点重组酶的识别位点插入人21号染色体的短臂，例如，21p区中，优选21p11.1区与21p11.2区之间的位点，进一步优选人21号染色体的短臂近侧区的21p11.1区中的位点，进一步优选比AL163201中的缺失位置更近侧的位点。

根据一个优选实施方案，定点重组酶是Cre酶和/或FLPe酶，并且定点重组酶的识别位点是loxP序列和/或FRT序列。

第二方面，本发明提供了携带人类人工染色体(HAC)载体的细胞。可以使用的细胞的实例包括哺乳动物细胞，优选人细胞(例如胚胎和体干细胞、体细胞、正常体细胞、上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞、良性或恶性肿瘤细胞、内皮细胞、真皮细胞、基底细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、间质细胞、骨髓瘤细胞、血细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、毛细胞、肝细胞、胰腺细胞、肾细胞、羊膜细胞、视细胞、听细胞、嗅细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、3T3细胞、BHK细胞、293细胞和A9细胞。

第三方面，本发明提供了制备人类人工染色体(HAC)载体的方法，包括以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；和

(d)在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列。

当用作为单个序列的端粒序列和亚端粒序列制备载体时，步骤(c)和步骤(d)可以作为单个步骤进行，从而将所述序列添加到长臂和/或短臂区的缺失位点。

根据本发明的另一实施方案，步骤(a)涉及使用具有高同源重组效率的携带人染色体或人染色体片段的细胞。根据一个优选实施方案，具有高同源重组效率的细胞来源于鸡DT40细胞。

根据本发明的另一实施方案，可以在步骤(b)中使用定点重组酶去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区。例如，可以通过使用定点重组酶，用端粒序列和/或亚端粒序列进行取代而去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区。

根据一个优选实施方案，从14q区，优选14q11区与14q12区之间去除人14号染色体或人14号染色体片段的长臂远侧区，并且在14p12区内去除短臂远侧区。根据进一步的优选实施方案，在AL391156或比AL391156更近侧的位点去除人14号染色体或人14号染色体片段的长臂远侧区，具体是AL391156和CR383659之间，进一步优选AL512310和CR383659之间，进一步优选AL929601和CR383659之间，进一步优选AL589182和CR383659之间，进一步优选AL589743和CR383659之间，进一步优选AL929602和CR383659之间，进一步优选AL512624和CR383659之间，进一步优选CR383657和CR383659之间，进一步优选CR383659和CR383659之间。在另一实施方案中，在例如14p区内，优选14p11区与14p12区之间，进一步优选14p11.1区与14p11.2区之间，进一步优选14p11.1区内，进一步优选选自RNR2和PABPCP2的任何位点去除人14号染色体的短臂远侧区。

根据另一实施方案，从21q区，优选21q11.1区与21q11.2区之间去除人21号染色体或人21号染色体片段的长臂远侧区，并且在21p11.1区与21q11.2区之间去除短臂远侧区。从例如21q11.1的包含NT_011512的区域，优选包含NT_011512的区域中的AL16202，进一步优选包含AL16202的区域中的AP001657或比AP001657更近侧的位点去除人21号染色体或人21号染色体片段的长臂远侧区。同样，从例如21p区，优选21p11.1区与21p11.2区之间，进一步优选21p11.1区中的位点，进一步优选在AL163201去除人21号染色体的短臂远侧区。

根据本发明的进一步的实施方案，在步骤(b)和(c)中，可以通过用端粒序列取代而去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区，并且可以将端粒序列添加到人染色体片段。根据另一实施方案，在步骤(b)和(c)中，可以通过用端粒序列和来源于人染色体的亚端粒序列取代而去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区，并且可以将端粒序列和亚端粒序列添加到人染色体片段。来源于人染色体的亚端粒序列优选来源于人染色体，例如人14号染色体或人21号染色体，但来源不限于这些。

根据一个优选实施方案，在步骤(b)和步骤(c)中，可以切割人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区的至少两个位点，使得可以去除长臂和/或短臂远侧区，并且可以将端粒序列添加到去除的长臂和/或短臂的位点。

根据另一优选实施方案，在步骤(b)-(d)中，可以切割人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区的至少两个位点，使得可以去除长臂和/或短臂远侧区，并且可以将来源于人染色体或人染色体的端粒序列和亚端粒序列添加到去除的长臂和/或短臂的位点。

根据一个优选实施方案，端粒序列和亚端粒序列是各自包含人14号染色体的14q32区中的位点与14q-tel区之间的区域的序列，进一步优选是各自包含人14号染色体的14q32.33区与14q-tel区之间的区域的序列。

根据另一优选实施方案，来源于人21号染色体的亚端粒序列和端粒序列是包含人21号染色体的21q22.3区与21q-tel区中的端粒末端之间的区域和端粒序列的序列。亚端粒序列优选是包含人21号染色体的任意位点与21q-tel区中的端粒末端之间的区域的序列，进一步优选包含人21号染色体的NT_011515与21q-tel区中的端粒末端之间的区域的序列。

根据一个具体的实施方案，可以用定点重组系统，如Cre-loxP或FLPe-FRT系统来去除长臂和/或短臂远侧区，而保留作为基本骨架的起始材料，即，来源于人染色体的天然存在的端粒序列和/或亚端粒序列。例如，在步骤(b)-(d)中，从人染色体或人染色体片段的长臂的q11区或q11-q12区去除长臂远端区，并且将人染色体或人染色体片段的端粒序列添加到长臂的缺失位点。例如，在人14号染色体的情况下，添加各自包含14q32区中的位点与14q-tel区之间的区域的端粒序列和亚端粒序列。例如，在人21号染色体的情况下，添加各自包含21q22.3区中的位点与21q-tel区之间的区域的端粒序列和亚端粒序列。

例如，通过将定点重组酶的识别位点插入长臂远侧区和近侧区，并且通过定点重组去除这两种识别位点之间的间隔，去除人染色体或人染色体片段的长臂远侧区。

根据一个优选实施方案，将定点重组酶的识别位点插入比人14号染色体或人14号染色体片段的长臂远侧区的14q32区更远侧的位点和比长臂近侧区的14q11区更近侧的位点，进一步优选比长臂远侧区的AB019437更远侧的位点和比长臂近侧区的AL391156更近侧的位点。根据另一优选实施方案，将定点重组酶的识别位点插入比人21号染色体或人21号染色体片段的长臂远侧区的21q22区更远侧的位点和比长臂近侧区的21q11区更近侧的位点，进一步优选比长臂远侧区的21q22.3更远侧的位点，例如NT_011515，和比长臂近侧区的21q11.2更近侧的位点，例如，比NT_011512更远侧的位点，优选比AL16202更远侧的位点，例如，NT_011515，进一步优选AP001657或比AP001657更远侧的位点。

根据另一优选实施方案，定点重组酶是Cre酶，并且定点重组酶的识别位点是loxP序列。根据另一优选实施方案，定点重组酶是FLPe酶，并且定点重组酶的识别位点是FRT序列。

此外，通过例如将定点重组酶的识别位点插入短臂远侧和近侧区并且通过定点重组去除这两个识别位点之间的区域而去除人染色体或人染色体片段的短臂远侧区。根据一个优选实施方案，在比例如人染色体或人染色体片段的短臂远侧区的短臂p区内的位点更远侧的位点插入定点重组酶的识别位点，优选比p11区内的位点更远侧的位点，或比p11区与p12区之间的区域内的位点更远侧的位点，进一步优选比p11区内的位点更远侧的位点和比p11区内的位点更近侧的位点，或短臂近侧区的p11区与p12区之间的区域内的位点。

在人14号染色体或人14号染色体片段的情况下，例如，将定点重组酶的识别位点插入比短臂远侧区的14p区内的位点更远侧的位点，优选比14p12区与14p11区之间的区域内的位点更远侧的位点，进一步优选比14p11区内的位点更远侧的位点和比短臂近侧区的14p12区与14p11区的之间的区域内的位点更近侧的位点，优选比14p11区内的位点更近侧的位点，进一步优选比14p11.2区与14p11.1区之间的区域内的位点更近侧的位点，进一步优选比14p11.1区内的位点更近侧的位点，进一步优选比选自RNR2和PABPCP2的位置更近侧的位点。在人21号染色体或人21号染色体片段的情况下，例如，将定点重组酶的识别位点插入比人21号染色体的短臂的21p区内的位点更远侧的位点，优选比21p11.2区与21p11.1区之间的区域内的位点更远侧的位点，进一步优选比21p11区内的位点更远侧的位点和比短臂近侧区的21p12区与21p11区的之间的区域内的位点更近侧的位点，优选比21p11区内的位点更近侧的位点，进一步优选比21p11.2区与21p11.1区之间的区域内的位点更近侧的位点，进一步优选比21p11.1区内的位点更近侧的位点，进一步优选比AL163201的位置更近侧的位点。

根据一个优选实施方案，定点重组酶是酶Cre，并且定点重组酶的识别位点是loxP序列。根据另一优选实施方案，定点重组酶是FLPe酶，并且定点重组酶的识别位点是FRT序列。

根据另一实施方案，用于制备本发明的HAC载体的方法可以进一步包含步骤(e)，即，将至少一个定点重组酶识别位点插入人染色体或人染色体片段中。

根据本发明的另一实施方案，在步骤(e)中，定点重组酶是Cre酶，并且定点重组酶的识别位点是loxP序列。根据另一实施方案，在步骤(e)中，定点重组酶是FLPe酶，并且定点重组酶的识别位点是FRT序列。

在进一步的实施方案中，可以将定点重组酶的识别位点插入例如人14号染色体或人14号染色体片段的AL391156上的缺失位置或比AL391156更近侧的位点，进一步优选比人14号染色体或人14号染色体片段的短臂近侧区的14p12区中的缺失位置更近侧的位点。

定点重组酶的识别位点可以插入例如人14号染色体或人14号染色体片段的14q区，优选比长臂近侧区的14q11区中的缺失位置更近侧的位点，进一步优选比AL391156中的缺失位置更近侧的位点，进一步优选AL512310中，进一步优选AL929601中，进一步优选AL589182中，进一步优选AL589743中，进一步优选AL929602中，进一步优选AL512624中，进一步优选CR383657中，进一步优选CR383659中。也可以将识别位点插入例如比人14号染色体或人14号染色体片段的短臂近侧区的14p区内的缺失位置更近侧的位点，进一步优选比人14号染色体的短臂近侧区的14p12区内的缺失位置更近侧的位点，进一步优选比人14号染色体的短臂近侧区的14p11区内的缺失位置更近侧的位点。

根据另一实施方案，可以将定点重组酶的识别位点插入例如人21号染色体或人21号染色体片段的AP001657中的缺失位置，或比AP001657更近侧的位点，进一步优选比人21号染色体或人21号染色体片段的短臂近侧区的21p11与p12区之间的缺失位置更近侧的位点。

此外，第四方面，本发明提供了通过上文描述的方法制备的人类人工染色体(HAC)载体。

此外，第五方面，本发明提供了制备包含外源DNA的人类人工染色体载体的方法，包括以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；

(d)在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列；

(e)将至少一个定点重组酶识别位点插入人染色体或人染色体片段；和

(f)在定点重组酶的存在下，将外源DNA插入人染色体或人染色体片段。

第六方面，本发明提供了制备包含外源DNA的人类人工染色体载体的方法，包括以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列或端粒序列与亚端粒序列的组合；

(d)将至少两类定点重组酶识别位点插入人染色体或人染色体片段；

(e)在定点重组酶的存在下，将外源DNA插入人染色体或人染色体片段；和

(f)在与步骤(e)使用的定点重组酶不同的定点重组酶存在下，从人染色体或人染色体片段除去药物抗性基因。

根据一个优选实施方案，人染色体是人14号染色体或人21号染色体。

根据另一实施方案，至少两类定点重组酶及其识别位点是Cre酶和loxP序列，以及FLPe酶和FRET序列。根据另一实施方案，药物抗性基因是新霉素抗性基因。

根据上述第五和第六方面，外源DNA的插入位置，即定点重组酶的插入位置，与上文描述的定点重组酶的插入位置相同。例如，在人14号染色体的情况下，它是比长臂近侧区的14q11更近侧的位点，并且优选比长臂近侧区的AL391156(GenBank编号)中的缺失位置更近侧的位点。同样，它可以在人14号染色体的短臂上，优选比短臂近侧区的14p12区中的缺失位置更近侧的位点。应该注意，插入位置不限于此。在人21号染色体的情况下，例如，它是比长臂近侧区的21q11.2更近侧的位点，优选比21q11.1更近侧的位点，进一步优选比长臂近侧区的AL16202(GenBank编号)更近侧的位点，进一步优选比长臂近侧区的AP001657(GenBank编号)或AP001657的缺失区更近侧的位置。同样，它可以在人21号染色体的短臂上，优选比短臂近侧区的21p11.2区中的缺失位置更近侧的位点。应该注意，插入位置不限于此。

根据一个优选实施方案，外源DNA的插入位置是来自人染色体片段末端的端粒序列的大约1-500kb，优选大约1-300kb，进一步优选约1-100kb，进一步优选约5-60kb，进一步优选5-40kb，进一步优选约25-60kb，更进一步优选约25-40kb的区域。

第七方面，本发明提供了通过上述方法获得的包含外源DNA的人类人工染色体载体。

第八方面，本发明提供了携带包含外源DNA的人类人工染色体载体的细胞。可以使用的细胞的实例包括哺乳动物细胞，优选人细胞(例如胚胎和体干细胞、体细胞、正常体细胞、上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞、良性或恶性肿瘤细胞、内皮细胞、真皮细胞、基底细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、间质细胞、骨髓瘤细胞、血细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、毛细胞、肝细胞、胰腺细胞、肾细胞、羊膜细胞、视细胞、听细胞、嗅细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、3T3细胞、BHK细胞、293细胞和A9细胞。

第九方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含携带HAC载体或包含外源DNA的HAC载体的细胞。在这种情况下，外源DNA的实例包括但不限于编码例如以下物质的基因：红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、冯维勒布兰德因子(von Willebrandvfactor，vWF)、肌养蛋白、多巴胺合成酶、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、抗体、端粒酶、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生长素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配体、干扰素、腺苷脱氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生长抑制因子(GIF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制癌蛋白M、Flt3配体(Flt3L)、基质衍生因子(SDF)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(angiopoietin)、神经生长因子(NGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、激活蛋白、转化生长因子(TGF)、Wnt、R-spondin、单克隆抗体、寡克隆抗体和多克隆抗体。

第十方面，本发明提供了将外源DNA导入受体细胞的方法，包括以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的供体细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；

(d)在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列；

(e)将至少一个定点重组酶识别位点插入人染色体或人染色体片段；

(f)在定点重组酶的存在下，将外源DNA插入人染色体或人染色体片段；

(g)从携带人染色体或人染色体片段的供体细胞制备微细胞；

(h)使微细胞与受体细胞融合；和

(i)证实外源DNA导入了融合的受体细胞。

根据本发明的另一方面，受体细胞是动物细胞，优选哺乳动物细胞。受体细胞可以是多能细胞，例如胚胎干细胞(ES)细胞、间质干细胞和组织干细胞/前体细胞。

第十一方面，本发明提供了制备表达外源DNA的细胞的方法，包括以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的供体细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；

(d)在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列；

(e)将定点重组酶的识别位点插入人染色体或人染色体片段；

(f)在定点重组酶的表达下，将外源DNA插入人染色体或人染色体片段；

(g)从携带人染色体或人染色体片段的供体细胞制备微细胞；

(h)使微细胞与受体细胞融合；和

(i)在融合的受体细胞中选择表达外源DNA的细胞。

根据本发明的另一方面，受体细胞是动物细胞，优选哺乳动物细胞。受体细胞可以是多能细胞，例如胚胎干细胞(ES)细胞、间质干细胞，或组织干细胞/前体细胞。

第十二方面，本发明提供了制备蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的供体细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；

(d)在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列；

(e)将定点重组酶的识别位点插入人染色体或人染色体片段；

(f)在定点重组酶的表达下，将编码蛋白的外源DNA插入人染色体或人染色体片段；

(g)从携带人染色体或人染色体片段的供体细胞制备微细胞；

(h)使微细胞与受体细胞融合；

(i)在培养基中培养融合的受体细胞；和

(j)从得到的培养产物进行蛋白取样。

根据本发明的另一方面，前述蛋白的实例包括红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、第八因子、第九因子、冯维勒布兰德因子(vWF)、肌养蛋白、多巴胺合成酶、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、抗体、端粒酶、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生长素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配体、干扰素、腺苷脱氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生长抑制因子(GIF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制癌蛋白M、Flt3配体(Flt3L)、基质衍生因子(SDF)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、神经生长因子(NGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、激活蛋白、转化生长因子(TGF)、Wnt、R-spondin、单克隆抗体、寡克隆抗体和多克隆抗体。

本文所用的术语定义如下。

本文所用的术语“人类人工染色体载体”或“HAC载体”是指基于人染色体而制备的人工染色体。

本文所用的术语“人染色体”是指来自人细胞的天然DNA和蛋白的复合体。已知有23对(46条染色体)正常的人染色体(在男性是24种类型)(即常染色体：1-22号染色体和性染色体：X和Y染色体)，每条染色体包含大约50-300Mb的DNA。术语“人染色体片段”是指能作为独立染色体而稳定复制和分配的染色体部分。所述片段大小通常为1Mb或更大，有时为1Mb或更小。

在本说明书中，术语染色体的“长臂”和“短臂”是指染色体着丝粒两侧的臂，按其长度所述臂称为长臂(q)或短臂(p)。术语人染色体的“长臂远侧区”或“长臂近侧区”是指远离长臂着丝粒的区域(即在端粒侧；远侧区)和邻近着丝粒的区域(近侧区)。具体地，在人14号染色体的情况下，长臂远侧区比AL359218更接近端粒，长臂近侧区比AL391156更接近着丝粒。在人21号染色体的情况下，长臂远侧区比21q22.2更接近端粒，长臂近侧区是21q11.2。此外，术语“短臂远侧区”和“短臂近侧区”分别是指指远离短臂着丝粒的区域(远侧区)和邻近着丝粒的区域(近侧区)。例如，在人14号染色体的情况下，在核糖体RNA区中有边界。

术语“定点重组酶”和“定点重组酶的识别位点”是针对以下现象使用的：其中特定酶识别特定的识别位点并在该识别位点上特异性地导致DNA重组。所述术语指出了以定点方式导致重组的酶和所述酶要识别的位点。

本文所用的术语“端粒序列”是指具有TTAGGG重复序列(TTAGGG)n的序列。端粒序列的长度是大约0.4-50kb，优选大约0.4-25kb，进一步优选大约0.4-15kb。所述端粒序列可以化学合成、人工制备或来源于染色体。

本文所用的术语“亚端粒序列”是指一个大约300-500kb的染色体区域，其邻近真核细胞的染色体末端上的端粒(TTAGGG)n重复序列的着丝粒，并且具有分段的/重叠的结构域或(TTAGGG)n样重复序列。亚端粒序列可以是来源于任意染色体的亚端粒序列的全部或一部分。或者，所述序列可以由多个彼此结合的、来源于任意染色体的亚端粒序列组成，或它可以由添加了另一序列的、来源于任意染色体的亚端粒序列组成。例如，在本发明中，可以通过端粒截短或利用定点重组易位，进行端粒序列或亚端粒序列的添加。

本文所用的术语“外源DNA”是指从外面引入靶细胞内的DNA。该术语指编码基因的DNA(希望所述DNA的表达用于制备材料、治疗疾病、功能修饰、功能分析等)，以及其他功能序列(例如启动子序列)。所述DNA可以是同种异体的或异种的。

在本说明书中，术语“细胞”是指来源于个体生物或组织的细胞。其实例包括体细胞、正常体细胞、生殖细胞、体干细胞、肿瘤细胞、永生化细胞系、胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)和种系干细胞(GS细胞)。细胞可以是同种异体的或异种的，并且可以使用前述来源于人的细胞(即人细胞)。

术语“供体细胞”和“受体细胞”是指当要转移或导入人类人工染色体载体时，首先携带载体的细胞(即供体细胞)和要从供体细胞导入载体的细胞(即受体细胞)。

说明书包括了作为本申请的优先权文件的日本专利申请号2006-188392的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容。

附图简述

图1图示了来源于人14号染色体的HAC载体的结构。在图中，“14A”图示了具有人14号染色体的经过去除的长臂远侧区的HAC载体，在其中添加了端粒序列。＂14N＂图示了具有人14号染色体的经过去除的长臂远侧区的HAC载体，其包含来源于人14号染色体的大约25kb的端粒序列和亚端粒序列，＂14gN＂图示了具有人14号染色体的经过去除的长臂远侧区的HAC载体，其包含来源于人14号染色体的大约60kb的端粒序列和亚端粒序列。

图2显示了用于端粒截短的pTELpuro-t1载体的结构。在该图中，＂tel＂表示端粒侧，＂cen＂表示着丝粒侧。同样，＂puro＂表示嘌呤霉素基因，＂Tel序列＂表示端粒序列，序列中的黑色箭头表示重复序列。

图3显示关于将pTELpuro-t1载体导入人染色体14q的PCR分析。

图4显示将pTELpuro-t1载体导入人染色体14q得到的等位基因。

图5显示关于携带导入人染色体14q的pTELpuro-t1载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图6显示关于携带导入人染色体14q的pTELpuro-t1载体的DT40杂交细胞的FISH分析的结果，其中：(A)代表携带人14号染色体的DT40杂交细胞；以及(B)代表携带具有经去除的长臂的人14号染色体片段的DT40杂交细胞。

图7显示用于插入loxP和3’neo序列的t1pSF1载体的结构。在该图中，＂Ori＂表示复制起点，＂Ap^r＂表示氨苄青霉素抗性基因，＂Sv40pA＂表示SV40聚腺苷酸。

图8显示关于将t1pSF1载体导入14AΔqHAC的PCR分析的结果。

图9显示将t1pSF1载体导入14AΔqHAC得到的等位基因。

图10显示关于携带导入14AΔqHAC的t1pSF1载体的DT40杂交细胞的DNA分析。

图11显示关于导入了14AΔqHAC载体的CHO杂交细胞的DNA分析的结果。

图12显示关于导入了14AΔqHAC载体的CHO杂交细胞的FISH分析的结果。图12A显示FISH图像，图12B显示14AΔqHAC载体的核型。

图13显示非选择条件下CHO杂交细胞中14ΔqHAC载体(14AΔqHAC，14NΔqHAC(G)和14gNΔqHAC(g))和21ΔqHAC载体的长期稳定性分析的结果。

图14显示由导入hEPO基因得到的14HAC载体的等位基因。在图中，＂hEPO＂表示人红细胞生成素基因，CMV表示巨细胞病毒启动子。

图15显示关于导入了14AΔqHAC载体的CHO杂交细胞的DNA分析的结果，所述载体包含导入其中的hEPO基因。

图16显示携带hEPO-14AΔqHAC载体的CHO杂交细胞中hEPO基因的表达。

图17显示关于携带hEPO-14AΔqHAC载体的CHO杂交细胞的FISH分析的结果。图17A显示FISH图像，图17B显示hEPO-14AΔqHAC载体的核型。

图18显示CHO杂交细胞中hEPO-14AΔqHAC载体的长期表达/稳定性分析的结果。

图19显示关于导入了hEPO-14A/N/gNΔqHAC载体的人正常成纤维细胞的DNA分析的结果，其中：(A)表示hEPO-14AΔqHAC；(B)表示hEPO-14NΔqHAC；并且(C)表示hEPO-14gNΔqHAC。

图20显示关于导入了hEPO-14AΔqHAC载体的人正常成纤维细胞的FISH分析的结果。图20A显示FISH图像，图20B显示hEPO-14AΔqHAC载体的核型。

图21显示导入了hEPO-14A/N/gNΔqHAC载体的人正常成纤维细胞HFL-1中的hEPO基因表达。

图22显示用于将loxP序列插入人14号染色体的长臂远侧区的端粒侧的ploxpPGK-14qtel载体的结构。

图23显示将ploxpPGK-14qtel载体导入人染色体14q得到的等位基因。

图24显示关于将ploxpPGK-14qtel载体导入人染色体14q的PCR分析的结果。

图25显示携带导入人染色体14q的ploxpPGK-14qtel载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图26显示用于将loxP序列插入人14号染色体的长臂近侧区的着丝粒侧的ploxPHYGOR/n1载体的结构。

图27显示将ploxPHYGOR/n1载体导入人染色体14q得到的等位基因。

图28显示关于将ploxPHYGOR/n1载体导入人染色体14q的PCR分析的结果。

图29显示携带导入人染色体14q中的ploxPHYGOR/n1和ploxpPGK-14qtel载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图30显示通过Cre-loxP定点重组导致的人染色体14q的远侧位点缺失而得到的染色体等位基因(Fig.30A：G/n1；Fig.30B：g/n1)。

图31显示携带14NΔqHAC的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图32显示携带14NΔqHAC的DT40杂交细胞的FISH分析的结果。图32A显示G94n56细胞，图32B显示G94n56Δp25细胞的FISH图像。

图33显示用于插入loxP和3’neo序列的pSF1(G+n1)载体的结构。

图34显示由(A)将pSF1(G+n1)或GnpSF1-FRT载体导入14NΔqHAC和(B)将pSF1(g+n1)或gnpSF1-FRT载体导入14gNΔqHAC得到的等位基因。

图35显示携带导入14NΔqHAC中的pSF1(G+n1)载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图36显示导入了14NΔqHAC载体的CHO杂交细胞的DNA分析的结果。

图37显示导入了14NΔqHAC载体的CHO杂交细胞的FISH分析的结果。图37A显示FISH图像，图37B显示14NΔqHAC载体的核型。

图38显示导入了14NΔqHAC载体的CHO杂交细胞的DNA分析的结果，所述载体导入了hEPO。

图39显示携带hEPO-14AΔqHAC载体的CHO杂交细胞的FISH分析的结果。图39A显示FISH图像，图39B显示hEPO-14AΔqHAC载体的核型。

图40显示携带hEPO-14NΔqHAC载体的CHO杂交细胞中的hEPO基因表达。

图41显示CHO杂交细胞中hEPO-14NΔqHAC载体的长期表达和稳定性分析。

图42显示导入了hEPO-14NΔqHAC载体的人正常成纤维细胞的FISH分析的结果。图42A显示FISH图像，图42B显示hEPO-14NΔqHAC载体的核型。

图43显示导入了hEPO-14ΔqHAC载体的人正常成纤维细胞中的hEPO基因的长期表达。

图44显示了用于将loxP序列插入人14号染色体的长臂远侧区的端粒侧的ploxpPGK-14qtel-2载体的结构。

图45显示了将ploxpPGK-14qtel-2载体导入人染色体14q得到的等位基因。

图46显示了关于将ploxpPGK-14qtel-2载体导入人染色体14q的PCR分析的结果。

图47显示携带导入人染色体14q的ploxpPGK-14qtel-2载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图48显示携带导入人染色体14q的ploxPHYGOR/n1和ploxpPGK-14qtel-2载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图49显示携带14gNΔqHAC的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图50显示携带14gNΔqHAC的DT40杂交细胞的FISH分析的结果。图50A显示FISH图像，图50B显示14gNΔqHAC载体的核型。

图51显示用于插入loxP和3’neo序列的pSF1(g+n1)载体的结构。

图52显示携带导入14gNΔqHAC中的pSF1(g+n1)载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图53显示导入了14gNΔqHAC载体的CHO杂交细胞的DNA分析的结果。

图54显示导入了14gNΔqHAC载体的CHO杂交细胞的FISH分析的结果。图54A显示FISH图像，图54B显示14gNΔqHAC载体的核型。

图55显示导入了14gNΔqHAC载体的CHO杂交细胞的DNA分析的结果，所述载体导入了hEPO。

图56显示携带hEPO-14gNΔqHAC载体的CHO杂交细胞的FISH分析的结果。图56A显示FISH图像，图56B显示hEPO-14gNΔqHAC载体的核型。

图57显示携带hEPO-14gNΔqHAC载体的CHO杂交细胞中的hEPO基因的表达。

图58显示CHO杂交细胞中的hEPO-14gNΔqHAC载体的长期表达和稳定性分析。

图59显示导入了hEPO-14gNΔqHAC载体的人正常成纤维细胞的FISH分析的结果。图59A显示FISH图像，图59B显示hEPO-14gNΔqHAC载体的核型。

图60图示了用FLP-FRT除去新霉素抗性基因。

图61显示将t1pSF1-FRT载体导入14AΔqHAC中得到的等位基因。

图62显示携带导入14AΔqHAC中的t1pSF1-FRT载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图63显示导入了14AΔqF-HAC载体的CHO杂交细胞的DNA分析的结果。

图64显示导入了14AΔqF-HAC载体的CHO杂交细胞的FISH分析的结果。

图65显示由导入hEPO基因得到的14AΔqF-HAC载体的等位基因。

图66显示导入了14AΔqF-HAC载体的CHO杂交细胞的DNA分析的结果，所述载体导入了hEPO基因。

图67显示了携带hEPO-14AΔqF-HAC载体的CHO杂交细胞的FISH分析的结果。图67A显示FISH图像，图67B显示hEPO-14AΔqF-HAC载体的核型。

图68显示由除去新霉素抗性基因单位得到的14AΔqF-HAC载体的等位基因。

图69显示携带hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体的CHO杂交细胞的DNA分析的结果。

图70显示携带hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体的CHO杂交细胞的FISH分析的结果。图70A显示FISH图像，图70B显示hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体的核型。

图71显示携带hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体的人正常成纤维细胞的DNA分析的结果。

图72A和72B各自显示携带hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体的人正常成纤维细胞的FISH分析的结果。

图73显示用于导入FRT序列的GnpSF1-FRT载体的结构。

图74显示携带导入14NΔqHAC中的GnpSF1-FRT载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图75显示用于导入FRT序列的gnpSF1-FRT载体的结构。

图76显示携带导入14NΔqHAC中的gnpSF1-FRT载体的DT40杂交细胞的DNA分析的结果。

图77显示21HAC载体的结构。上图显示通过端粒截短制备21AΔqHAC的程序，下图显示利用以Cre-loxP进行的去除，制备21NΔqHAC的程序。

图78图示了将loxP序列导入人21号染色体长臂的AP001657的方法。

图79图示了用于在人21号染色体长臂的AP001657进行定点切割的方法。

图80显示用于插入loxP、3’neo和FRT序列的pSF1(FRT)-C载体。

图81显示将pSF1(FRT)-C载体导入21AΔqHAC得到的等位基因。在该图中，＂5’HPRT＂代表5’-次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶，＂Hyg＂代表潮霉素基因，＂Tk＂代表胸苷激酶基因。＂FRT＂代表FLP重组酶靶，＂BS＂代表杀稻瘟素抗性基因，＂Apr＂代表氨苄青霉素抗性基因。

图82显示用FLP-FRT除去新霉素抗性基因。

图83图示了用于将loxP序列插入人21号染色体长臂的NT_011515的方法。

图84显示了人21号染色体的等位基因，从其上去除了由导入Cre载体得到的长臂。

图85显示了用于插入loxP、3’neo和FRT序列的pSF1(FRT)-D载体。

图86显示了将pSF1(FRT)-D载体导入21NΔqHAC得到的等位基因。

图87是显示EPO的体内效力随时间改变的图表。图87A显示红细胞(RBC)计数，图87B显示血红蛋白水平(HGB)计数，图87C代表血细胞比容(HCT)值。在该图中，菱形指出CMV(CHO细胞克隆t7S38-8E5，其携带导入巨细胞病毒启动子下游的位点中的包含hEPO基因的14AΔqHAC载体)的平均值(N＝3；第28周：N＝2；第32周和以后：N＝1)，正方形指出对照样品的平均值(N＝3；第20周、第28周和第44周＝2)。

图88图示了EGFP-14HAC载体的PCR分析的结果。图88A显示了将增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的基因导入人14号染色体载体得到的EGFP-14HAC载体的结构。图88B显示在14AΔq-HAC载体和14NΔq-HAC载体的着丝粒侧和端粒侧上存在或缺乏人标记物。

图89显示了当将pLN1IRESEGFP导入CHO杂交细胞系(+)或不导入pLN1IRESEGFP(-)时，通过DNA分析检查到的片段大小与在载体上的位置之间的关联。

图90显示检查嵌合小鼠是否携带HAC的PCR的结果，所述小鼠是从多个携带EGFP-14AΔq-HAC载体或EGFP-14NΔq-HAC载体的ES克隆制备的。

实施本发明的最佳方式

下面将详细描述本发明。

本发明涉及人类人工染色体载体(在下文也可以称为“HAC载体”)。所述HAC载体包含基于具有已去除的长臂远侧区和/或短臂远侧区的人染色体制备的人染色体片段，并且包含端粒序列和亚端粒序列，特别是亚端粒序列。

在本发明中，人染色体类型不特别限定，并且人染色体选自人1-22号染色体、X染色体和Y染色体。在本发明中，人染色体中多态性的变异等是可以接受的。在下文的实施例中，举例说明了人14号染色体和人21号染色体，解释了从这些人染色体或人染色体片段制备人类人工染色体载体。其中描述的方法、手段等也可以用于其它人染色体，以实现本发明的人类人工染色体的制备。

下文描述了HAC载体的制备、外源DNA在载体中的插入和HAC载体的应用。

1.制备人类人工染色体(HAC)载体

基于上文描述的人染色体制备HAC载体。HAC载体的制备包括以下步骤(a)-(d)：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；和

(d)在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列。

HAC载体的制备也可以包含以下步骤(e)：

(e)将至少一个定点重组酶识别位点插入人染色体或人染色体片段。

应该注意，步骤(b)、(c)和(d)的顺序和(b)、(c)、(d)和(e)的顺序并不特别限定。

步骤(a)：制备携带人染色体的细胞

当制备HAC载体时，制备携带人染色体(例如，所有人常染色体，包括人14号染色体和人21号染色体)或其片段的细胞。可制备专门携带人染色体或其片段并且具有高同源重组效率的细胞，以方便后续操作。因此，在本发明中，制备满足所述条件的细胞。

例如，可以通过选择携带来自包含人类单染色体的已知小鼠A9杂交细胞文库的人染色体的克隆，并且将所述染色体导入具有高同源重组效率的细胞中，来制备携带人染色体的细胞。小鼠A9杂交细胞文库含有用药物抗性基因标记的人类单染色体，并且已经描述于例如WO00/10383，Tanabe，H.et al.，(Chromosome Res.，8：319-334，2000)中。例如，携带人14号染色体的小鼠A9杂交细胞已经在日本研究生物资源保藏中心(the Japanese Collection of research Bioresources(JCRB))注册，注册号为JCRB2214(细胞名称：A9(Hygro14))，也可获得其详细信息和培养条件。

将由此获得的小鼠A9杂交细胞携带的人染色体导入具有高重组效率的细胞。本文所用的术语“具有高同源重组效率的细胞”是指当在目的细胞中进行同源重组时，显示出高同源重组频率的细胞。所述细胞的实例包括鸡DT40细胞(Dieken et al.，Nature Genetics，12：174-182，1996)和小鼠ES细胞(Shinichi Aizawa，Biomanual Series 8，Gene Targeting，Yodo-sha Co.，Ltd.，1995)。在本发明中，为了容易操作，特别优选采用鸡DT40细胞。

可以根据本领域已知的染色体导入的方法导入染色体。用于导入仅仅一个目的染色体的方法的实例是Koi et al.(Jpn.J.Cancer Res.，80：413-418，1973)中描述的微细胞介导的染色体转移方法。在该方法中，分离给定细胞中通过药物抑制性纺锤体形成而诱导的微细胞，将分离的微细胞与受体细胞融合，由此导入小量染色体。通过微细胞介导的染色体转移方法导入人染色体的一个特定程序描述于例如WO 97/07671和WO00/10383中。因此，可以制备携带人染色体的细胞。

或者，本发明中可以使用携带代替全长人染色体的部分片段化的染色体，例如人14号染色体的部分片段(SC20)的细胞(SC20；Tomizuka etal.，P.N.A.S.，97：722-727，2000)。据报道，SC20缺乏人14号染色体的长臂远侧区和长臂近侧区的主要部分(Tomizuka et al.，P.N.A.S.，97：722-727，2000；Kuroiwa et al.，Nature Biotech.，U.S.A.，vol.18，pp.1086-1090，2000)。具体地，SC20包含包括人14号染色体长臂的端粒序列到AL137229(GenBank编号)的区域和从AL121612(GenBank编号)(其比前一区域距离着丝粒侧更近)到距离AL157858(GenBank编号)的端粒侧24-26kb的位置的区域。SC20也缺乏AL137229(GenBank编号)与AL121612(GenBank编号)之间的区域和端粒侧上的24-26kb与AL157858(GenBank编号)的着丝粒之间的区域。SC20包含人14号染色体的短臂区。不利的是，SC20包含14号染色体的14q32区中的多个基因。但是，通过本说明书中描述的方法操作SC20，使得能够制备HAC载体，该载体在多种细胞系中稳定保持，并且不含过量基因。携带SC20染色体片段的鸡DT-49细胞(SC20)已经在2001年5月9日在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(the National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，the International PatentOrganism Depositary(Chuo 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan))进行了国际保藏，保藏号为FERM BP-7583。

步骤(b)：从人染色体去除长臂和/或短臂远侧区；

步骤(c)：添加端粒序列

步骤(d)：添加亚端粒序列

当制备HAC载体时，从携带人染色体或人染色体片段的细胞去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区。可以根据本领域已知的方法进行染色体的去除。例如，可以利用定点重组酶系统。当制备HAC载体时，例如，利用定点重组酶系统，可以将端粒序列和亚端粒序列添加到要从人染色体或人染色体片段去除长臂和/或短臂的位点。定点重组酶系统的利用是本领域公知的，并且例如可以利用下文描述的步骤(e)中举例说明的定点重组酶及其识别位点。例如，根据一个优选实施方案，定点重组酶是Cre酶，定点重组酶的识别位点是loxP序列。根据另一优选实施方案，定点重组酶是FLPe酶，定点重组酶的识别位点是FRT序列。

进行步骤(b)-(d)的顺序并不特别限制。例如，可以去除长臂和/或短臂远侧区，并且可以随后添加端粒序列和亚端粒序列。或者，可以通过用端粒序列取代而去除长臂和/或短臂远侧区，然后可以插入亚端粒序列。同样，可以通过用端粒序列和亚端粒序列取代而去除长臂和/或短臂远侧区。可以用任何顺序进行这些步骤并且任意重复，前提是可以最终获得靶HAC载体。

由去除长臂和/或短臂远侧区得到的人染色体片段的大小优选是大约18Mb或更小，进一步优选大约17Mb或更小，使得得到的人染色体片段的大小一般是1Mb或更大，例如，大约1Mb-大约19Mb，包括端粒序列和亚端粒序列。

要添加到人染色体片段的长臂和/或短臂区的端粒序列可以是任何序列，前提是它包含具有重复序列，如TTAGGG的核苷酸序列。端粒序列可以基于例如TTAGGG重复序列化学合成，或它可以通过已知方法从任意染色体(例如人染色体)制备。要添加的端粒序列的长度是大约0.4-50kb，优选大约0.4-25kb，进一步优选大约0.4-15kb。

要添加到人染色体片段的长臂和/或短臂区的亚端粒序列是来源于哺乳动物染色体的亚端粒序列，优选来源于人染色体的亚端粒序列，进一步优选来源于人常染色体的亚端粒序列，如来源于人14号染色体或人21号染色体的亚端粒序列。当使用来源于人染色体的亚端粒序列时，可以使用来源于任意染色体的长臂和/或短臂的亚端粒序列。在文献中详细描述了人染色体的亚端粒的结构、长度等，例如Linardopoulou，E.V.et al.，Nature，vol.437，pp.94-100，2005；Riethman，H.et al.，ChromosomeRes.，vol.13，pp.505-515，2005；或Mefford，H.C.et al.，Nat Rev Genet.，vol.3，pp.91-102，2002。本领域技术人员能够基于这些文献选择和设计足够的亚端粒序列。

要添加的亚端粒序列的长度是大约1-500kb，优选大约1-300kb，进一步优选大约1-100kb，进一步优选大约5-60kb，进一步优选5-40kb，进一步优选大约25-60kb，进一步优选大约25-40kb。要使用的亚端粒序列可以是任意人染色体中的完整或部分亚端粒区。对于HAC载体，为了在细胞中的稳定性，优选使用大约5-60kb的亚端粒序列的部分。亚端粒序列可以根据已知技术获自任意人染色体，如使用定点重组酶系统。优选地，人染色体片段包含来源于人染色体长臂的亚端粒序列，所述染色体与添加到或结合于去除了长臂远侧区的位点的人染色体相同或不同(优选相同)。

根据一个优选实施方案，人14号染色体片段包含添加到或结合于人14号染色体上去除了长臂远侧区的位点的端粒序列和来源于人14号染色体长臂的亚端粒序列。来源于人14号染色体的亚端粒序列是例如比人14号染色体的14q32区更远侧的区域(即，直到14q-tel区的区域)。具体地，亚端粒序列是人14号染色体的14q32.33区，AB019439与AB019437之间的区域，或AB019438与AB019437之间的区域，优选比人14号染色体的AB019437更远侧的区域。

根据另一优选实施方案，人21号染色体片段包含添加到或结合于人21号染色体上去除了长臂远侧区的位点的端粒序列和来源于人21号染色体长臂的亚端粒序列。来源于人21号染色体的亚端粒序列是例如比人21号染色体的21q22.3区更远侧的区域，例如，从NT_011515到21q-tel区内的端粒末端的序列。术语“端粒末端”是指从染色体延续的端粒的末端上的区域，并且该术语与术语“染色体末端”同义。端粒序列天然包含端粒末端。

例如，可以通过用WO 00/10383中描述的端粒序列进行取代(即端粒截短)而从人染色体或其片段去除长臂和/或短臂远侧区。也可以通过用端粒序列进行取代而从人染色体或其片段去除长臂和/或短臂远侧区。在步骤(b)和(c)中，更具体地，用端粒序列取代人染色体或其片段的长臂和/或短臂远侧区，从而向长臂和/或短臂区添加端粒序列。更具体地，可以通过例如以下方法去除长臂和/或短臂远侧区：在携带人染色体的细胞中构建包含端粒序列的导向载体，通过同源重组获得包含插入染色体的所需位置中的端粒序列的克隆，并且获得由端粒截短得到的缺失突变体(参见Itzhaki et al.，Nature Genet.，vol.2，pp.283-p287，1992；和Brownet al.，P.N.A.S.，vol.93，pp.7125-7130，1996)。术语“染色体的所需位置”是指切除靶长臂远侧区或短臂远侧区的位点，通过同源重组在该位置取代和插入端粒序列，然后去除长臂远侧区或短臂远侧区(即端粒截短)。通过在构建导向载体时设计靶序列，可以足够确定所需位置。

例如，参照从完整的人14号染色体去除长臂序列来进行描述。

基于人14号染色体长臂的14q区中，优选14q11区中，进一步优选AL391156与CR383659(GenBank编号)之间的核苷酸序列设计靶序列，并且在比得到的靶序列更接近端粒侧的位点诱导端粒截短。因此，可以在设计靶序列的区域中切割或去除长臂远侧区。靶序列的设计方式使得在AL391156或比AL391156更近侧的位置去除人14号染色体的长臂。具体地，基于AL391156与CR383659之间，进一步优选AL512310与CR383659之间，进一步优选AL929601与CR383659之间，进一步优选AL589182与CR383659之间，进一步优选AL589743与CR383659之间，进一步优选AL929602与CR383659之间，进一步优选AL512624与CR383659之间，进一步优选CR383657与CR383659之间，进一步优选CR383659上的核苷酸序列设计靶序列。例如，当要切除短臂远侧区时，可以基于例如人14号染色体的14p区中，优选14p11区与14p12区之间，优选14p11区中，进一步优选RNR2上，进一步优选PABPCP2(国家生物技术信息中心的在线基因组数据库(NCBI，U.S.A.，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi？ORG＝hum&CHR＝14&BEG＝0.00&ENI)上的核苷酸序列设计靶序列。人14号染色体的整个长臂区(排除着丝粒区)的核苷酸序列信息公开在上述数据库中(也参见图1)。靶序列的设计不限于上述区域，本领域技术人员以与制备所需HAC载体时的方式相似的方式可以足够设计靶序列。

例如，当在比SC20更接近着丝粒的区域从人14号染色体去除长臂序列时，基于AL157858的核苷酸序列设计靶序列，并且在比靶序列更接近端粒侧的位点诱导端粒截短。因此，可以在设计了靶序列的区域中切割或去除长臂远侧区。例如，当要去除短臂远侧区时，可以基于人14号染色体的14p区中，优选14p11区与14p12区之间，进一步优选14p11区中，进一步优选14p11.1区与14p11.2区之间，进一步优选14p11.1区中，进一步优选RNR2，进一步优选PABPCP2(国家生物技术信息中心的在线基因组数据库(NCBI，U.S.A.，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi？ORG＝hum&CHR＝14&BEG＝0.00&ENI)的核苷酸序列设计靶序列。靶序列的设计不限于上述区域，本领域技术人员以与制备所需HAC载体时的方式相似的方式可以足够设计靶序列。

或者，可以优选根据例如Zheng B.et al.，Mol Cell Biol.，vol.20，pp.648-p655，2000，从人染色体或其片段去除长臂和/或短臂远侧区。也就是说，可以去除两个定点重组酶识别位点之间的区域，优选去除长臂和/或短臂远侧区，同时允许保留作为基本骨架的、来源于起始人染色体或其片段的亚端粒序列，并且添加端粒序列。更具体地，在步骤(b)和(c)中，可以切割和去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区的至少两个位点，使得可以去除长臂和/或短臂远侧区，并且可以将端粒序列添加到经过去除的长臂和/或短臂的位点。在步骤(b)-(d)中，可以切割和去除人染色体或其片段的长臂和/或短臂远侧区的至少两个位点，使得可以从人染色体或人染色体片段去除长臂和/或短臂远侧区，并且可以将端粒序列和来源于人染色体的亚端粒序列添加到经过去除的长臂和/或短臂的位点。

具体地，通过例如以下方法去除长臂和/或短臂远侧区：在包含人染色体或人染色体片段的细胞中构建携带定点重组酶的识别位点的导向载体，通过同源重组获得包含插入染色体的所需位置的定点重组酶的识别位点的克隆，并且通过由定点重组酶导致的重组获得缺失突变体。本文用到的术语“染色体的所需位置”是指要去除的长臂远侧区和长臂近侧区或短臂远侧区和短臂近侧区的切割位点。取代定点序列，并且通过同源重组插入该位置，然后去除长臂远侧区或短臂远侧区。当构建导向载体时，通过设计靶序列可以足够确定所需位置。

例如，通过将定点重组酶的识别位点插入长臂远侧区和近侧位点，并且通过定点重组去除这两个识别位点之间的区域，从人染色体或其片段去除长臂远侧区。根据本发明的另一实施方案，去除长臂和/或短臂远侧区，以便保留构成来源于起始染色体的基本骨架的端粒序列，或端粒序列和亚端粒序列。例如，通过将至少两个定点重组酶识别位点插入长臂远侧区和近侧位点，并且通过定点重组去除这两个识别位点之间的区域，从人14号染色体去除长臂远侧区。根据一个优选实施方案，将所述定点重组酶识别位点插入比人14号染色体的长臂远侧区的14q32更远侧和比长臂近侧区的14q11区更近侧的位点，进一步优选插入比人14号染色体的长臂远侧区的AB019437更远侧和比长臂近侧区的AL391156更近侧的位点。

通过例如将定点重组酶的识别位点插入短臂远侧区和近侧位点，并且通过定点重组去除这两个识别位点之间的区域，从人14号染色体去除短臂远侧区。根据一个优选实施方案，将定点重组酶的识别位点插入人14号染色体中例如比14p区更远侧的位点，优选比14p12区更远侧的位点，进一步优选比短臂远侧区的14p11区更远侧的位点，以及比14p12区更近侧的位点，进一步优选比14p11区更近侧的位点，优选比14p11.2区更近侧的位点，进一步优选比14p11.1区更近侧的位点，进一步优选比短臂近侧区中选自RNR2和PABPCP2的位置更近侧的位点。

此外，可以将定点重组酶的识别位点插入例如人21号染色体或人21号染色体片段的AP001657中的缺失位点或比AP001657更近侧的位点，进一步优选比人21号染色体或人21号染色体片段的短臂近侧区的21p11-p12区中的缺失位置更近侧的位点。

如上文所述，制备具有经去除的长臂远侧区和/或短臂远侧区的人染色体片段，同时保留端粒序列或端粒序列和亚端粒序列，并且获得携带该片段的细胞。通过在人染色体片段的末端提供端粒序列或端粒序列和亚端粒序列，可以实现细胞中增强的表达水平和/或稳定性。

此外，按照上文所述制备具有经去除的长臂远侧区和/或短臂远侧区的人染色体片段，并且获得携带该片段的细胞。染色体大小的减少可以导致细胞中增强的稳定性。为了防止对携带HAC载体的细胞和要导入HAC载体的细胞的细胞功能、操作等的不利影响，可以除去可能有不利影响的染色体区域。

步骤(e)：插入定点重组酶的识别位点

当制备HAC载体时，将定点重组酶的识别位点插入人染色体或人染色体片段。可以在步骤(b)、(c)和(d)之前、之间或之后进行步骤(e)，进行这些步骤的顺序不特别限定。具体地，可以从人染色体或人染色体片段去除长臂远侧区和/或长臂远侧区，可以添加端粒序列和亚端粒序列，并且随后可以插入定点重组酶的识别位点。或者，可以首先插入定点重组酶的识别位点，然后可以去除长臂远侧区和/或长臂远侧区，并且可以添加端粒序列和亚端粒序列。此外，可以首先去除长臂远侧区和/或长臂远侧区，可以插入定点重组酶的识别位点，并且随后可以添加端粒序列和亚端粒序列。

发生在由给定酶特异性识别的给定识别位点上的DNA重组是本领域已知的。本发明涉及使用所述酶和所述识别位点系统，但其类型不特别限于下文描述的那些。已知的所述系统的一个实例是Cre/loxP系统(参见例如Sauer，B.et al.，P.N.A.S.，85：pp.5166-5170，1988)。Cre是属于重组酶的整合酶(Int)家族的来源于噬菌体P1的38KD蛋白。该酶识别loxP序列，所述序列是一个大约34bp的识别位点，并且该酶在该位点特异性导致DNA重组。已知loxP序列的方向导致DNA缺失或两个loxP序列之间的易位。其它识别特异性序列和导致重组的系统的实例包括来源于牙殖酵母的重组酶FLP(Broach et al.，Cell，21：501-508，1980)和来源于噬菌体phiC31的整合酶(Thorpe et al.，P.N.A.S.，95：5505-5510，1998)。据报道，通过哺乳动物细胞中的这些酶，将导致DNA重组(Kochet al.，Gene，249：135-144，2000；Thyagarajan et al.，Mol.Cell.Biol.，21：3926-3934，2000)。

可以通过已知的基因重组技术，如同源重组，将定点重组酶的识别位点插入人染色体中。本领域技术人员考虑例如不必要的基因的位置，可以足够确定定点重组酶的识别位点的插入位置。例如，将定点重组酶的识别位点插入人染色体的长臂近侧区或短臂近侧区的任意位置中。所述插入位置的实例包括比人14号染色体的长臂近侧区14q11更近侧的位点，进一步优选比长臂近侧区的AL391156(GenBank编号)中的上述缺失位点更近侧的位点，和比人14号染色体的短臂近侧区的14p12区中的上述缺失位点更近侧的位点，但插入位置不限于此。关于人21号染色体的其实例包括比长臂近侧区的21q11.2区更近侧的位点，优选比21q11.1区更近侧的位点，优选比AL16202更近侧的位点，比长臂近侧区的AP001657(GenBank编号)中的缺失位点更近侧的位点，或比AP001657更近侧的位点，和人21号染色体短臂上的位点，优选比短臂近侧区21p11.2中的缺失位置更近侧的位点，但所述位点不限于这些实例。

例如，对于下文描述的外源DNA的插入位置，可以采用定点重组酶的识别位点。因此，所述插入位置的实例包括比人14号染色体的长臂近侧区的14q11区更近侧的位点，进一步优选比长臂近侧区的AL391156(GenBank编号)中的缺失位点更近侧的位点，以及比短臂的14p12区中的缺失位置更近侧的位点，优选人14号染色体的短臂近侧区，但位置不限于此。在人21号染色体的情况下，所述位置的实例包括比长臂近侧区的21q11.2区更近侧的位点，优选比21q11.1区更近侧的位点，优选比AL16202更近侧的位点，进一步优选比长臂近侧区的AP001657(GenBank编号)中的缺失位置更近侧的位点，或比AP001657更近侧的位点，进一步优选比人21号染色体的短臂近侧区中的缺失位置更近侧的位点，优选短臂的21p11.2区中的缺失位置，但位置不限于此。

随后，可以根据下文所述用于导入外源DNA的方法导入报道基因，并且可以随后证实其表达。因此，可以通过证实人染色体上识别位点的定位，检验插入人染色体中的识别位点是否足够。

可以单独插入单个类型的上文举例说明的识别位点，或插入两种类型或更多的组合。或者，可以插入不同系统的多个识别位点。如下文所述，HAC载体包含定点重组酶的识别位点。因此，可以通过定点方式导入外源DNA，并且可以通过确定识别位点而确定要导入外源DNA的位置。这使得要导入外源DNA的位置保持恒定，并且可以避免位置效应。此外，用于外源DNA导入的程序变得简化。此外，不同系统的多个识别位点的插入使得能够顺序插入多个外源DNA。组合的多个类型的定点酶的识别位点的使用使得能够利用一类定点酶的识别位点导入外源DNA，然后利用不同类型的定点重组酶的识别位点去除/除去载体的不必要的基因，如药物抗性基因。

如此通过修饰人染色体制备的HAC载体可以包含插入其中的序列或元件，所述序列或元件通常是在构建载体时插入的，除定点重组酶的识别位点外，例如是启动子或药物抗性基因。同样，可以插入参与调节基因表达、细胞功能、组织功能、肿瘤发生和/或生物功能的序列或元件，例如绝缘子(如日本专利申请号2006-948494A)、基质附着区(MAR)或人或其它生物物种的基因组区。此外，可以插入控制细胞生命的基因，如端粒酶、自杀基因(如胸苷激酶)，和/或参与调节基因表达、细胞功能、组织功能、肿瘤发生和/或生物功能的基因。可以通过上文描述的同源重组，将所述序列、元件和/或基因插入HAC载体的所需位置。

此外，本发明人在不含选择剂的培养基中进行了携带以上述方式制备的HAC载体的细胞的长期传代培养，并且通过FISH测试了HAC载体随时间的保留。结果，他们证实了HAC载体可以在宿主细胞如CHO细胞中稳定保留，并且所述稳定性与常规21HAC相比显著增强。他们也证实了在传代培养过程中HAC载体的损失很小，并且导入的HAC载体可以稳定保留，而拷贝数目不过量增加/减少。

出乎意料地，使用HAC载体使得能够高水平表达外源DNA而不受到过去报道的经端粒位置效应(TPE)导致的外源基因表达抑制的影响，即使当外源DNA插入端粒序列附近的位点中也是如此。本文用到的术语“附近”是指从端粒末端朝向着丝粒的大约1-500kb的区域，所述区域优选是大约1-300kb，进一步优选大约1-100kb，进一步优选大约5-60kb，进一步优选5-40kb，进一步大约25-60kb，进一步优选25-40kb。

2.将外源DNA导入HAC载体(步骤(f))。

当制备HAC载体时，可以进行步骤(f)，即在定点重组酶存在下插入外源DNA，使得外源DNA可以导入HAC载体中。要在步骤(e)后进行步骤(f)；但是，进行与步骤(f)相关的步骤(b)、(c)和(d)的顺序不特别限定，并且步骤(f)可以在步骤(b)、(c)和(d)之前、之间或之后进行。因此，应该注意，步骤(b)-(f)的顺序不限定于本文描述的顺序。

术语“外源DNA”是指从外面导入靶细胞的DNA，并且它是编码基因和其它功能序列的DNA。在本发明中，要导入的外源DNA不特别限制，前提是所述DNA编码基因(所述基因的表达是材料产生、疾病治疗、功能修饰或功能分析的目的所需要的)和其它功能序列。术语“其它功能序列”是指为了基因表达而起作用的序列，其实例包括启动子、增强子和信号序列。

可以用定点重组酶系统导入外源DNA。例如，构建导向载体，其携带作为Cre酶的识别位点的loxP序列和外源DNA。随后，在携带HAC载体(人14号染色体片段)的细胞中表达Cre酶，并且用导向载体使夹心在loxP序列和端粒序列之间的区域进行定点重组，从而将外源DNA插入HAC载体中(Kuroiwa et al.，Nature Biotech.，18：1086-1090，2000)。

可以将携带定点重组酶的识别位点(loxP序列)的环状DNA插入HAC载体中。由此，可以插入通过存在的载体，例如利用大肠杆菌宿主的质粒、BAC或PAC载体或利用酵母宿主的环状YAC载体克隆的DNA。由于已经基于人染色体制备了载体，可以导入HAC载体的外源DNA的大小延伸到100kb。除了过去用于表达实验的、已经掺入质粒载体中的cDNA外，可以导入包含基因表达调节区的基因组DNA。

如上文所述，外源DNA的插入位置可以是例如定点重组酶的识别位点。所述插入位置的实例包括但不特别限于比长臂近侧区的14q11区更近侧的位点，进一步优选比长臂近侧区的AL391156(GenBank编号)的缺失位置更近侧的位点，优选比人14号染色体的短臂的区域中的短臂近侧区的14p12区内的缺失位置更近侧的位点。人21号染色体上的所述插入位置的实例包括但不特别限于比长臂近侧区的21q11.2区更近侧的位点，优选比21q11.1区更近侧的位点，优选比AL16202更近侧的位点，进一步优选长臂近侧区的AP001657(GenBank编号)的缺失位置，或比AP001657更近侧的位点，优选比短臂的区域中的短臂近侧区的21p11.2区的缺失位置更近侧的区域。同样，使用多个定点重组酶识别位点使得能够从HAC载体除去不必要的药物抗性基因表达单位、DNA元件等。例如，当除去位于用Cre-loxP系统导入的外源基因表达单位下游的新霉素抗性基因单位时，构建包含与loxP不同的识别位点(即FRT序列)的构建体，所述识别位点导入携带外源DNA的导向载体的外源基因表达单位的下游和HAC载体的新霉素抗性基因单位的下游。在携带导入了外源DNA的HAC载体的细胞中表达FLPe酶，使得可以通过定点重组切割和除去用FRT序列夹心的新霉素抗性基因单位的区域(参见例如图60)。

当基于任意人染色体(不限于人14号和21号染色体)制备人类人工染色体载体时，可以除去所述药物抗性基因。因此，本发明涉及制备包括外源DNA的人类人工染色体载体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列或端粒序列与亚端粒序列的组合；

(d)将至少两类定点重组酶识别位点插入人染色体或人染色体片段；

(e)在定点重组酶的存在下，将外源DNA插入人染色体或人染色体片段；和

(f)在与步骤(e)使用的定点重组酶不同的定点重组酶存在下，从人染色体或人染色体片段除去药物抗性基因。

根据上述方法制备的包含外源DNA的人类人工染色体载体缺乏药物抗性基因，并且它因此能够以高水平表达外源DNA(参见例如关于人14号染色体载体的图21)。

根据利用cDNA强制表达载体的常规基因导入方法，可能发生副作用，例如由超量表达或生长抑制导致的细胞毒性，并且通常不能获得组成型表达转基因的细胞系。为了克服这些缺陷，并且人工调节表达水平同时保持生理表达模式，优选的是应用基因表达诱导系统，该系统利用四环素等。为此，使得可以插入的插入序列的大小较大，并且可以稳定保留给定拷贝基因数目的HAC载体的特征是合适的。

在从编码基因的基因组区转录和修正、细胞外转运和转录物易位的阶段调节组织特异性/生理性基因表达。已知表达了组织特异性同工型，这是由于单个基因的多个启动子，所述启动子在剪接中带来了不同的转录起点或变异。克隆的cDNA仅仅是来源于单个基因的多个转录物的变体。为了重复生理性基因表达，优选将包含控制序列的基因区作为基因组DNA导入。HAC载体的使用对于所述目是适合的。

根据人类基因组计划，基因组DNA分离为BAC克隆，并且确定其核苷酸序列。因此，核苷酸序列在开放的数据库，如GenBank中在BAC方面注册。基因功能分析方法的一个实例是制备转基因小鼠。将BAC插入HAC载体平台使得能够在插入位置总是相同的条件下进行基因表达分析。由于很多BAC载体包含loxP序列，可以用阴性选择HAC载体中的插入的系统容易地将具有已知核苷酸序列的BAC插入作为盒的HAC载体。

除了上文所述，还有很多用于将外源DNA导入HAC载体的方法，所述导入的优点以及所述方法和优点在下文描述。

(1)通过相互易位导入部分染色体片段

定点重组(如通过Cre酶与loxP序列的定点重组)在线性染色体和环状插入序列(即外源DNA)情况下导致插入反应；但是，相互易位在线性染色体之间发生。采用此法，可以将不能克隆到环状插入序列中的Mb级或更大的染色体片段导入HAC载体中(Kuroiwa et al.，Gene Ther.，9：708-712，2002)。

(2)插入序列选择方法

在本说明书的实例描述的方法中，通过采用了作为指示物的药物抗性基因的重建的阳性选择(参见WO00/10383关于重组体的阳性选择)将外源DNA插入到HAC载体中。或者，可以通过例如胸苷激酶/更昔洛韦系统的阴性选择，获得包含插入其中的外源DNA的载体。在此情况下，要插入的环状DNA可能选择性包含定点重组酶的识别位点。由于用于基因组计划的BAC文库包含loxP序列，所述阴性选择系统的建立将使得能够容易将具有已知序列的基因组克隆插入HAC载体中。

(3)插入多个插入序列

本发明中优选使用的loxP序列是来自P1噬菌体的野生型序列，并且，由Cre酶将环状插入序列插入到HAC载体的loxP序列中的插入是可逆的。在本发明的一个实例中，Cre酶是瞬时表达的，并且将药物抗性的获得作为指示物，用于选择定点重组体，随后获得组成型插入序列。当插入了环状插入序列时，两个loxP序列保留在HAC载体中。在Cre酶重新表达后，这可以导致可逆反应(即环状插入序列的切除)，并且，HAC载体的进一步修饰(例如插入序列的第二次插入)难以进行。同时，报道了可以根据突变的loxP序列的组合限制反应方向和反应特异性，所述序列进行了核苷酸取代(Hoess et al.，Nucleic Acids Res.，14：2287-2300，1986；Araki et al.，Nucleic Acids Res.，25：868-872，1997；Lee et al.，Gene，216：55-65，1998)。使用这些突变的loxP序列，使得能够构建连续地插入多个环状插入序列的系统，而不导致如上所述的可逆反应。

(4)依赖于拷贝数的表达调节

根据使用α-珠蛋白基因转基因小鼠分析随机插入宿主染色体的基因拷贝数与mRNA表达水平之间的关联的报道(Sharpe et al.，Proc NatlAcad Sci USA，90：11262，1993)，在转基因的表达水平和拷贝数之间没有观察到关联。认为这是由称作位置效应的现象导致的，其中由于转基因动物品系以及发生与转基因的拷贝数成反比的表达，转基因的表达水平显著不同，并且当将基因导入转基因动物时经常发生所述现象。也存在关于转基因小鼠的报道，其中在定点重组酶的识别位点指定外源DNA插入位置，所述识别位点(如loxP位点)提前插入到宿主染色体中，并且通过定点重组(如Cre-loxP系统)从质粒载体导入靶DNA单位(Garricket al.，Nature Genet.，18：56-59，1998)，目的是比较，同时消除转基因的位置效应。但是，本文没有尝试依赖于拷贝数的表达调节。

尽管在用包含导入的酪氨酸酶基因组区的YAC制备的转基因小鼠中的导入的基因组区观察到了依赖于拷贝数的酪氨酸酶表达(Schedl etal.，Nature，362：258-261，1993)，但由于使用了包含生理表达调节区的基因组，认为位置效应的影响是不显著的。因此，与本发明不同，表达不是由于不含生理调节区的多拷贝的人工基因表达单位导致的。附加体载体独立于宿主染色体存在。尽管已经确定了外源DNA插入位置，附加体载体还不能严格调节细胞中的其拷贝数(Morlino et al.，ppl EnvironMicrobiol.，65：4808-4013，1999；Cooper et al.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，94：6450-6455，1997)。

在本发明中，偶联和平行排列了多拷贝的同种异体和/或异种靶基因表达单位，并且将产物导入HAC载体的预定位点(如loxP位点)。因此，可以用依赖于拷贝数的方式进行表达控制，而不使宿主染色体突变。

因此，本发明的方法使得能够将多拷贝的靶基因作为外源DNA导入所需细胞，并且以依赖于拷贝数的方式使靶基因在细胞中表达。该方法也使得能够进行靶基因的依赖于拷贝数的表达(这在过去是困难的)，而不影响用所述细胞制备的转基因动物中的位置效应。

3.将HAC载体导入细胞

可以将细胞中保留的HAC载体或包含外源DNA的HAC载体转移到另一细胞。所述细胞不特别限制，一个实例是动物细胞(如哺乳动物细胞)。在本发明中，优选使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以在其中导入未破坏的人染色体(参见WO 00/10383)。已知CHO细胞有效形成微细胞(如Koi et al.，SCIENCE 260：361-364，1993)，由此，HAC载体可以进一步从CHO细胞转移到另一细胞(即除CHO细胞以外的细胞)。根据本发明，HAC载体可以导入多能细胞。本文用到的术语“多能细胞”是指能够在特定处理后分化成特化细胞或组织的细胞。实例是可以通过注射到宿主胚胎、形成聚集胚胎等而分化成嵌合动物的两种或多种类型的细胞或组织的细胞。具体实例包括胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)和种系干细胞(GS细胞)。其它实例包括能够通过在包含例如添加的生长因子(如转化生长因子(TGF))的诱导培养基中进行培养而分化成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞的细胞。一个具体实例是体干细胞(如间充质细胞)。

本文所用的术语“胚胎干细胞”也称作“ES细胞”，该术语是指来源于早期胚胎的培养细胞，其能够生长并同时保持未分化(全能性)。具体地，胚胎干细胞是一种建立的细胞，其能够在内细胞团的培养过程中保持生长，并且保持未分化，所述内细胞团是位于动物早期胚胎的胚泡内的未分化的干细胞。术语“胚胎生殖细胞”也称作“EG细胞”，并且该术语是指来源于原始生殖细胞的培养细胞，其具有与胚胎干细胞基本等同的能力。胚胎生殖细胞是一种建立的细胞，其能够在原始生殖细胞的培养过程中保持生长，并且保持未分化，所述原始生殖细胞获自受精后几天-几周的胚胎，例如，在小鼠的情况下是受精后约8.5天。

从安全性的观点，即，为了防止癌变，作为导向人的基因/细胞治疗或组织再生治疗材料的细胞优选是正常细胞而不是永生化细胞。在本发明中，发现来源于人染色体的HAC载体能够导入人正常成纤维细胞(HFL)。本发明的方法也使得能够将来源于人14号染色体的片段或来源于人染色体的HAC载体导入除成纤维细胞外的人正常体细胞。此外，根据本发明的方法制备的来源于人染色体的HAC载体能够导入人正常体细胞，而不限于人染色体。

可以通过微细胞介导的染色体转移方法将HAC载体导入细胞中。可以用描述于上文“1.制备人类人工染色体(HAC)载体”中的方式进行微细胞介导的染色体转移方法。

同样，可以通过体细胞核移植将HAC载体导入细胞中。可以通过Kuroiwa，Y.et al.，Natute Biotech，vol.20，pp.889-894，2002中描述的方式进行体细胞核移植。

可以在修饰细胞的步骤之前、之间或之后将人染色体(HAC)载体导入细胞中，所述细胞携带人染色体或最初制备为人染色体的染色体片段。

4.HAC载体的应用

本发明的一个目的是提供基本工具，即载体以及使用所述载体的技术。本发明预期在从科学研究到工业的非常广泛的领域中产生有说服力的作用。HAC载体的特征为：(1)它不插入到宿主染色体中而独立保持(不用担心宿主基因的突变或癌变)，(2)其给定拷贝数长期稳定保持(不用担心超量表达或表达猝灭)，和(3)可以导入的DNA长度不限(可以同时导入含有确保正常表达调节的DNA元件的基因或多个基因)。推导这些特征使得用常规载体难以完成的大量应用能够实现。HAC载体的应用的主要实例包括但不限于：(i)用于在培养的动物细胞中进行基因功能分析的载体，(ii)用于对人类疾病进行基因治疗的载体，(iii)用于将基因导入人器官干细胞或胚胎干细胞(ES细胞)的载体，和(iv)用于制备转基因动物(例如制备人类疾病的动物模型、与KO动物组合的给定基因的人源化)的载体。下面描述HAC载体的应用的实例：(1)将外源DNA导入受体细胞中；(2)制备表达外源DNA的细胞；(3)制备蛋白质；(4)用于基因功能分析的载体；(5)用于将基因导入干细胞的载体，(6)用于制备培养饲养细胞的载体；(7)用于治疗人类疾病的载体；和(8)用于制备转基因动物的载体。

(1)将外源DNA导入受体细胞

HAC载体能够将外源DNA插入细胞或能够将包含外源DNA的载体导入其它细胞。因此，可以将外源DNA导入需要的受体细胞。将外源DNA导入受体细胞包括例如以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的供体细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；

(d)在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列；

(e)将至少一个定点重组酶识别位点插入人染色体或人染色体片段；

(f)在定点重组酶的存在下，将外源DNA插入人染色体或人染色体片段；

(g)从携带人染色体或人染色体片段的供体细胞制备微细胞；

(h)使微细胞与受体细胞融合；和

(i)证实外源DNA导入了融合的受体细胞。

可以按照上文所述进行步骤(a)-(f)，并且进行这些步骤的顺序不限。

在步骤(g)和(h)中，通过微细胞介导的染色体转移方法将人染色体或其片段从携带所述人染色体或其片段的供体细胞转移到受体细胞。要导入的人染色体或其片段可以在步骤(b)-(f)的其修饰之前、之间或之后。因此，在步骤(f)中，在将外源DNA插入人染色体或其片段之前，可以通过例如微细胞介导的染色体转移方法将人染色体或其片段从携带所述人染色体或其片段的供体细胞转移到受体细胞。此后，在受体细胞中进行插入外源DNA的程序(即步骤(f))，并且包含插入其中的外源DNA的人染色体或其片段可以保留在受体细胞中。这些步骤可按不同的顺序进行，并且进行步骤(f)-(h)的顺序不限于上文。

可以按照描述于“1.制备人类人工染色体(HAC)载体”中的方式进行微细胞介导的染色体转移方法。本文用到的受体细胞不特别限制，优选动物细胞，特别是哺乳动物细胞，如小鼠或人细胞。同样，可以将上文描述的多能细胞，如胚胎干细胞(ES细胞)、间质干细胞和组织干细胞/前体细胞用作受体细胞。

在随后的步骤(i)中，证实受体细胞中是否包含转移的(转移的)外源DNA。可以通过本领域已知的方法进行所述证实，所述方法如采用相应于外源DNA的限制酶位点的DNA印迹分析，从而证实外源DNA的导入。

HAC载体的使用使得能够在细胞中导入和稳定保留更大的外源DNA。

(2)制备表达外源DNA的细胞

如上文所述，HAC载体能够将外源DNA插入细胞，或能够将包含外源DNA的HAC载体转移到另一细胞。因此，可以制备表达外源DNA的细胞。制备表达外源DNA的细胞包括例如以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的供体细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；

(d)在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列；

(e)将定点重组酶的识别位点插入人染色体或人染色体片段；

(f)在定点重组酶的表达下，将外源DNA插入人染色体或人染色体片段；

(g)从携带人染色体或人染色体片段的供体细胞制备微细胞；

(h)使微细胞与受体细胞融合；和

(i)在融合的受体细胞中选择表达外源DNA的细胞。

可以按照上文所述进行步骤(a)-(h)，并且进行这些步骤的顺序不限。

在步骤(i)中，在受体细胞中观察到了外源DNA的表达，并且选择表达外源DNA的细胞。可以通过本领域已知的方法证实外源DNA表达，并且所述方法的一个实例是涉及使用相应于外源DNA的探针的RNA印迹技术。或者，可以用与所述蛋白反应的抗体或能够检测所述蛋白活性的手段检测由外源DNA编码的蛋白，从而证实外源DNA的表达。

HAC载体的使用使得能够制备表达更大外源DNA的细胞。

(3)制备蛋白

按照上文所述，HAC载体的使用使得能够将外源DNA导入细胞或制备表达外源DNA的细胞。因此，可以制备由所述外源DNA编码的蛋白。蛋白的制备包括例如以下步骤：

(a)获得携带人染色体或人染色体片段的供体细胞；

(b)去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；

(c)在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；

(d)在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列；

(e)将定点重组酶的识别位点插入人染色体或人染色体片段；

(f)在定点重组酶的表达下，将编码蛋白的外源DNA插入人染色体或人染色体片段；

(g)从携带人染色体或人染色体片段的供体细胞制备微细胞；

(h)使微细胞与受体细胞融合；

(i)在培养基中培养融合的受体细胞；和

(j)从得到的培养产物进行蛋白取样。

可以按照上文所述进行步骤(a)-(h)，并且进行这些步骤的顺序不限。

在步骤(i)中，在培养基中培养步骤(h)中融合的受体细胞。用于培养受体细胞的培养基可以是天然存在的或合成的培养基，前提是所述培养基包含碳源、氮源、无机盐等，并且能够有效培养受体细胞。本领域技术人员可以任选选择合适的培养基并且通过足够的修饰制备培养基。同样，应该足够确定需氧条件，如振荡培养或通气搅拌培养、温度、pH水平、培养持续时间和其它条件。

培养后，按照步骤(j)的描述从得到的培养产物进行蛋白取样。术语“培养产物”是指除培养上清液以外，培养的细胞或断裂的细胞。完成培养后，可以通过例如常规蛋白纯化技术从培养产物进行蛋白取样。当在细胞中分泌培养产物时，例如，通过常规技术使细胞进行超声断裂、研磨、加压断裂等，以提取蛋白。根据需要添加蛋白酶抑制剂。当在培养上清液中分泌培养产物时，可以使用培养基。然后对该溶液进行过滤、离心和其它手段，以除去固体成分，然后根据需要通过鱼精蛋白处理或其它手段除去核酸。

随后，在其中添加硫酸铵、乙醇、丙酮等，用于分级分离，对沉淀物取样，并且获得粗蛋白溶液。对得到的蛋白溶液进行各种层析技术、电泳等，以获得纯化的酶样品。例如，足够选择或组合分级分离技术，如涉及使用Sephadex、ultra gel或bio gel的凝胶过滤、离子交换层析、使用聚丙烯酰胺凝胶的电泳、亲和层析、反相层析或其它手段，从而获得靶纯化蛋白。应该注意，这些培养或纯化方法仅仅是举例，技术不限于此。

在本发明中，要制备的蛋白不特别限定，前体是其制备是需要的。实例包括红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、冯维勒布兰德因子(vWF)、肌养蛋白、多巴胺合成酶、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、抗体、端粒酶、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生长素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配体、干扰素、腺苷脱氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生长抑制因子(GIF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制癌蛋白M、Flt3配体(Flt3L)、基质衍生因子(SDF)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、神经生长因子(NGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、激活蛋白、转化生长因子(TGF)、Wnt、R-spondin、单克隆抗体、寡克隆抗体和多克隆抗体。可以利用例如公共基因数据库获得编码所述靶蛋白的基因(即外源DNA)的序列信息。

(4)用于基因功能分析的载体

以依赖于拷贝数和稳定的方式，在细胞中表达插入到HAC载体中的外源DNA。因此，HAC载体可以用于分析基因功能。

通过表达包含与编码靶基因的核苷酸序列的一部分互补的序列的双链RNA(dsRNA)而抑制靶基因表达的技术，即RNA干扰，是已知的(关于短链干扰RNA(siRNA)，例如参见Elbashir et al.，Nature，411：494-498，2001；McCaffrey et al.，Nature，418：38-39，2002；andShinagawa，T.et al.，Genes & Development，17：1340-1345，2003)。可以用基因表达诱导系统将编码dsRNA的DNA导入HAC载体中，用于条件性抑制靶基因的功能。代替基因表达诱导系统，可以用基因组区抑制组织特异性/生理位点上的功能。同样，基因组中微RNA(miRNA)的功能分析是可行的。

当分析靶分子的作用时，可以将靶分子的剂量依赖性用作指示物来进行分析。在该技术中，编码靶分子的基因的表达单位的拷贝数可以改变，并且根据本发明的方法导入HAC载体中，将产物导入细胞，包括组织和生物中，并且可以基于所述细胞中依赖于拷贝数的调节来分析剂量依赖性。同样，可以用表达诱导系统或基因组区调节基因表达，以便进行条件性或组织特异性/生理功能分析。

(5)用于将基因导入干细胞中的载体

通过本发明的方法制备的HAC载体可以用作载体，用于将基因导入胚胎干(ES)细胞或间充质干细胞(MSC)中。HAC载体可以在ES细胞或MSC中长期稳定保持。

同样，HAC载体可以在组织或细胞中稳定保留，所述组织或细胞经过诱导以便从ES细胞分化，所述ES细胞中导入了通过本发明的方法制备的HAC载体。

近年来，已经鉴定了来自多种组织的干细胞和骨髓的多能细胞(Yokota et al.，Experimental Medicine(号外)，vol.19，No.15，2001，Yodosha Co.，Ltd.；Okano et al.，Experimental Medicine(号外)，vol.21，No.8，2003，Yodosha Co.，Ltd.；Li et al.，Nature Med.，online：2003年8月31日，doi：10.1038/nm925)。用本发明方法制备的HAC载体可以作为载体，用于将基因导入来源于组织干细胞/前体细胞，例如骨髓、血、神经、肌肉、肝、胰腺、皮肤或内耳细胞的多能干细胞/前体细胞中。

当考虑ES细胞、MSC和组织干细胞/前体细胞对人的临床应用时，有必要扩增治疗所需量的细胞，并且按感兴趣的分化状态来提供。过去，选择性大量扩增干细胞同时又保持多能性并不容易，并且所述扩增仍然是要实现的目标(Hino et al.，Experimental Medicine，vol.19，No.15，号外，10，2001，Yodosha Co.，Ltd.)。例如，当从生物组织进行造血干细胞或神经干细胞取样并培养时，除干细胞外，同时扩增前体细胞或从干细胞分化而来的成熟细胞。这样，所述细胞不适于临床应用(Hideyuki Okano，Experimental Medicine，vol.19，No.15(号外)：80-90，2001，Yodosha Co.，Ltd.)。

在本发明中，制备了HAC载体，其中导入了编码与多能性的保持相关的因子的DNA，所述因子例如转录因子，在小鼠ES细胞的情况下例如激活的Stat3、Oct-3/4或Nanog(Niwa et al.，Genes Dev.，12：2048-2060，1998；Matsuda et al.，EMBO J.，18：4261-4269，1999；Niwa etal.，Nature Genet.，24：372-376，2000；Mitsui et al.，Cell，113：631-642，2003；Chambers et al.，Cell，113：643-655，2003)，并且将所述载体导入干细胞。这样，可以将HAC载体用于容易地扩增干细胞，同时保持多能性而不改变宿主染色体。

当调节干细胞分化时，重要的是控制涉及的分子的表达水平。例如，当经过小鼠ES细胞中的Oct-3/4进行分化调节而将生理表达水平调节到100％时，保持了未分化状态。但是，当表达水平是50％或更低时，干细胞分化为滋养外胚层。在150％或更高的表达水平，干细胞分化为原始内胚层(Niwa et al.，Nature Genet.，24：372-376，2000)。当要根据表达水平的所述改变调节分化时，可以将基因表达开/关诱导系统(如通过四环素进行的表达诱导系统)导入通过本发明的方法制备的HAC载体，使得可以严格控制表达水平。

同样，可以将基因表达开/关诱导系统(如通过四环素进行的表达诱导系统)与多种分化诱导剂组合导入通过本发明的方法制备的HAC载体，从而将多能状态转换为分化状态。

当意欲用干细胞进行组织再生时，来源于供体的移植细胞或再生组织长时间(理想是一生)作为受体的一部分。因此，优选尽可能避免可能给供体细胞赋予诱导从生理调节偏离，例如癌变的原因(例如基因突变)的操作。由于HAC载体可能独立于宿主染色体而存在，可以进行基因导入而不使宿主染色体突变。如本说明书实施例中的描述，HAC载体可以稳定存在于人细胞中，因此它可以长时间稳定表达靶分子。

根据本发明的方法，制备了HAC载体，其中导入了包含基因组序列的DNA和与其融合的靶基因，所述基因组序列包含在分化的组织中生理表达的基因的基因组区或组织特异性表达调节区，并且使用导入了HAC载体的干细胞。因此，可以通过生理/组织特异性方式在再生的组织中表达靶分子。

在携带通过本发明的方法制备的HAC载体的干细胞被诱导分化后，如果被诱导的基因的表达是不必要的，则HAC载体可能偶尔变得不必要。在诱导分化后，可以通过使用例如药物抗性经选择培养，选择消除了HAC载体的克隆作为指示物，但选择方法不特别限制。因此，可以消除不必要的HAC载体。

(6)用于制备培养支持物饲养细胞的载体

作为细胞培养方法，以下方法是已知的：其中将靶细胞铺在培养支持物的饲养细胞中，其中贴壁细胞铺在孵育器底部，并且进行共培养(theJapanese Biochemical Society(ed.)，New biochemical experiment course14；Development，differentiation，and aging，1992，TOKYO KAGAKUDOZINCO.，LTD.)。例如，当需要造血前体细胞的生长时，将必须的因子，如SCF，Flt3L，TPO，IL-6和sIL-6R制备为重组蛋白，并且将所述蛋白加入培养基中，然后培养(Ueda et al.，J Clin Invest.，105：1013-1021，2000)。可以通过常规技术将已经加入培养物中的基因导入培养支持物饲养细胞中。但是，认为难以调节所有因子的所需表达水平并且提供它们，这是因为由于多拷贝表达单位的平行排列，下游基因随机插入宿主染色体、表达灭活和表达减弱导致的突变/位置效应。可以通过本发明的方法制备导入了编码所述必须因子的所有(或一些)DNA的HAC载体，然后可以将得到的HAC载体导入培养支持物饲养细胞。因此，通过共培养可以容易地补充所有必须因子，而不需要随后添加重组蛋白等。同样，使用基因表达诱导系统使得能够进行所述因子的条件性表达控制。

(7)用于治疗人类疾病的载体

迄今已经研究了多种类型的用于治疗人类疾病的病毒或非病毒载体，并且已经指出了多种问题，如免疫反应的引发、要导入的DNA的大小限制、宿主染色体的突变、低诱导效率、低表达效率和表达水平控制的困难(Yasufumi Kaneda，Clinical Immunology，vol.39：551-558，2003，Kagaku-Hyoronsha Co.，Ltd.，Keiya Ozawa(ed.)，Gene therapy，1997，Yodosha，Co.，Ltd.)。所述载体通常需要实现相同的目的；即，以需要的时间控制来调节需要的表达水平。

利用HAC载体进行基因/细胞治疗的策略的实例包括：(i)补充原来缺乏的酶或蛋白，(ii)补充继发减少的代谢产物的对症治疗，(iii)将新功能添加到细胞以增强细胞存活(例如，采用修饰的细胞，通过在组织再生中导入基因组，HAC载体能够调节生理/组织特异性基因表达。这使得能够预防因超量表达或表达不足导致的副作用，如功能障碍)，和(iv)抑制通过功能获得(gain-of-function)机制而进展的退化性疾病(例如帕金森病的GDNF补充)。

更具体地，HAC载体可以用作治疗人类疾病的载体，将导入了治疗性外源DNA的HAC载体导入细胞中，所述细胞是以药物组合物的形式制备的，用于将其施用于患者，并且，采用HAC载体的基因治疗是可获得的。所述用于治疗人类疾病的载体可以用于疾病预防，以及疾病治疗。

下文中，证实了用于治疗人类疾病的载体的应用的实例，但本申请不特别限于此。

(A)端粒酶的用途

出于安全的考虑，用于基因/细胞治疗或组织再生治疗的细胞优选是正常细胞，而不是永生化细胞。但是，已知正常体细胞在给定数目的分裂次数后停止增殖/分裂，并且它们最终死亡，即，它们会衰老(ToshinoriIde，Experimental Medicine，vol.16，No.18(号外)：18-24，1998，Yodosha，Co.，Ltd.)。为了延长治疗效果，需要在给定的时间段中，优选在患者的一生中保留治疗性细胞。已知作为染色体末端的端粒重复序列的修复酶的端粒酶在正常细胞中超量表达，并且由此抑制在细胞衰老时观察到的端粒缩短，并且延长细胞寿命(Bodnar et al.，Science，279：349-352，1998)。也证明了端粒酶如果在细胞中超量表达，不会导致永生化或癌变(Yoichi Shinkai，Experimental Medicine，vol.16，No.18(extra edition)：25-30，1998，Yodosha Co.，Ltd.；Jiang et al.，Nature Gent.，21：111-114，1999)。因此，根据本发明的方法将编码人端粒酶(hTERT)的基因导入HAC载体，并且将产物导入靶细胞，使得能够延长导入了HAC的细胞的寿命，并且可以长期保持治疗效果而没有永生化或癌变。同样，可以用表达诱导系统或基因组区调节基因表达，使得可以实现条件性或组织特异性/生理性端粒表达。

(B)抑制自身抗体的产生

当开发了重组蛋白制剂时，在施用时产生自身抗体(活性中和抗体)带来问题(Li et al.，Blood，98：3241-3248，2001)。将所述制剂施用于患者的方法不特别限制。首先将已经导入了编码通过本发明的方法制备的靶蛋白的基因组的HAC载体导入人细胞，如生殖组织的正常人细胞，然后将产物移植到患者。可以通过允许以生理/组织特异性方式表达并且从HAC载体提供靶蛋白，可以抑制患者中自身抗体的产生。

可以将组织特异性微RNA(miRNA)靶位点添加到导入的基因(Brown，B.D.et al.，Nature Medicine，vol.12，pp.585-591，2006)以猝灭导入到给定组织/细胞中的基因，并且可以抑制自身抗体和抗导入的基因的免疫应答的产生。

(C)用于导入用于免疫基因/细胞治疗的基因的载体

作为复发性白血病的治疗方法，已知供体淋巴细胞输注方法。该方法利用以下事实：移植的淋巴细胞作为肿瘤特异性细胞毒性T细胞，通过移植物抗白血病反应攻击白血病(Kolb et al.，Blood，76：2462-2465，1990)。移植物抗宿主疾病(其中移植的细胞攻击并且破坏受体组织)已知是所述治疗的副作用。作为克服所述副作用的手段，通过逆转录病毒载体将药物诱导型自杀基因导入供体淋巴细胞，并且通过施用药物除去供体淋巴细胞(Onodera et al.，Genomic Medicine，vol.3：45，2003 MedicalReview)。在所述情况下，突变可以不利地发生在供体淋巴细胞的染色体中。

通过本发明的方法制备的HAC载体可以用作用于导入用于免疫基因/细胞治疗的基因的载体，所述治疗不会使宿主染色体突变。所述HAC载体也可以在意欲加速抗肿瘤活性的治疗，如采用CD40配体的淋巴瘤免疫激活治疗(Kato et al.，Genomic Medicine，vol.3，53，2003，MedicalReview)和基于基因的接种中用于基因导入。

(D)完整的人单克隆抗体的补充

近年来，已经尝试了利用产生人抗体的小鼠的完整人单克隆抗体医学的发现(Ishida et al.，Bioventure，vol.2：44，2002，Yodosha，Co.，Ltd.，Mori et al.，Cell Death and Differentiation，in press，2003，Proceedings ofAmerican Association for Cancer Research，Volume 44，2nd Edition，July2003，p1285，#6422)。但是，所述医学在慢性疾病中的用途，使得必须进行医院随访，以便定期施用TPO，这可能妨碍患者的生活质量。同样，重组蛋白制剂的产生是非常昂贵的，并且因此高昂的医学费用将不利地加于患者。

将编码从产生靶抗体的杂交瘤分离的靶抗体的基因组区导入通过本发明的方法制备的HAC载体中，将HAC载体导入例如患者的造血干细胞或B细胞，然后将产物再移植到患者中。这样，可以补充完整的人抗体，并且通过生理表达控制来提供。这也减少了到医院的定期随访次数，并且改进了患者的生活质量。

(E)补充单基因疾病中的缺陷

(E-1)血友病

血友病A是由凝血因子VIII的突变导致的伴性、隐性出血疾病，血友病B是由凝血因子IX的突变导致的伴性、隐性出血疾病。作为治疗方法，通过施用因子VIII或IX的浓缩制剂进行的补充治疗是有效的。但是，出血后的施用可能不利地导致严重并发症，病原体污染浓缩制剂，由于重复施用产生自身抗体(活性中和抗体)，由于处理持续出血降低患者的生活质量，高医学花费，并且仍然遗留其它问题，并且推断通过基因治疗解决所述缺陷。到目前为止，已经临床研究了基于载体的基因治疗；但是，足够的表达不能持续长时间，并且还不能达到显著治疗效果。在直接施用逆转录病毒和腺伴随病毒(AAV)载体的临床研究中，在受试者的精液中检测到了载体基因，并且指出了将基因导入生殖细胞的危险(Mochizuki et al.，Genomic Medicine，vol.3：25，2003，MedicalReview)。编码因子VIII的基因的全长基因组是大约1.5Mb，cDNA是大约7kb。使用非病毒载体或腺病毒载体，可以导入全长cDNA，但表达水平不利地降低。采用AAV载体，要导入的DNA的大小限于大约4.9kb或更小，并且不利地，不能导入全长基因。

通过本发明的方法，可以制备HAC载体，其中导入了编码凝血因子VIII或因子IX的DNA。施用于患者的方法不特别限制，并且首先将HAC载体导入人细胞，然后将产物移植到患者，并且随后可以实现补充。施用于患者的方法不特别限制，并且，导入了凝血因子VIII或因子IX的基因组区的HAC载体是例如首先导入人细胞，然后将产物转移到患者，并且随后可以通过生理/组织特异性表达补充所述因子。

(E-2)X-SCID(X连锁重度联合免疫缺陷疾病)

重度联合免疫缺陷疾病(SCID)是由体液和细胞免疫的先天紊乱导致的。大约一半的SCID是X连锁的(即X-SCID)，并且已知由白介素-2家族的受体共有的共同γ-链中的突变是所述疾病的原因。作为治疗方法，已经进行了造血干细胞移植；但是，体液免疫的恢复是不足的，并且定期施用免疫球蛋白变得必要。因此，推断了通过基因/细胞治疗的解决方法，其中将共同的γ-链导入造血干细胞，然后将产物导入患者。从1999年开始，临床研究了造血干细胞的移植，所述细胞中通过逆转录病毒导入了共同γ-链，并且最近在法国报道了移植的细胞转化为白血病的多个实例(Hacein-Bey-Abina et al.，N Engl J Med.，348：255-256，2003；Marshall et al.，Science，299：320，2003)。在任何情况下，在导入基因的细胞染色体，即LMO2基因区中的原癌基因中观察到了由载体序列的插入导致的突变，并且怀疑LMO2激活与肿瘤发生之间的关联(Kume et al.，Genomic Medicine，vol.3：9，2003，Medical Review)。

可以通过本发明的方法制备导入了编码共同γ-链的DNA的HAC载体。同样，用HAC载体作为用于基因导入的载体使得能够防止由载体序列插入宿主染色体导致的突变。给患者施用的方法不特别限制。首先将HAC载体导入人细胞(如人骨髓来源的正常造血干细胞)，将产物移植到患者，然后可以通过生理/组织特异性表达补充共同γ-链的缺陷功能。

(E-3)杜兴肌营养不良

杜兴肌营养不良由肌养蛋白的功能异常导致，所述功能异常是由于肌养蛋白基因的突变，该疾病是X连锁隐性单基因病症(Hoffman et al.，Cell，51：919-928，1987)。由于肌养蛋白是细胞骨架蛋白，经直接施用补充不能治疗DMD，已经推断了基因治疗方法的开发。

肌养蛋白基因的全长基因组是大约2.3Mb，cDNA是14kb。采用非病毒或腺病毒载体，可以导入全长cDNA，但表达水平不利地降低(Liuet al.，Mol.Ther.，4：45，2001；DelloRusso et al.，Proc Natl Acad Sci，U.S.A.，99：12979-12984，2002)。采用AAV载体，要导入的DNA的大小限于大约4.9kb或更小，并且不能导入全长基因。不利地，通过将基因导入细胞骨架的实验诱导了免疫反应，并且在导入的基因产物的表达中观察到了降低(Yuasa et al.，Gene Therapy，9：1576-1588，2002)。

在用包含CMV启动子(其诱导遍在表达)控制下的、导入的肌养蛋白微基因的AAV载体将基因导入细胞骨架的实验中，诱导了免疫反应，并且在导入的基因产物的表达中观察到了降低。但是，采用细胞骨架特异性MCK启动子导致了改进的免疫应答(Yuasa et al.，Gene Ther.，9：1576-1588，2002)。这表明生理/组织特异性表达是肌养蛋白表达所必须的。

可以通过本发明的方法制备导入了编码肌养蛋白的基因组区的HAC载体。给患者施用的方法不特别限制。首先将HAC载体导入人细胞(如自体人正常成肌细胞，但实例不限于此)，将产物移植到患者，然后可以通过生理/组织特异性表达补充肌养蛋白。

(E-4)要治疗的疾病不特别限制，例如，可以治疗下文所示的单基因病症：α-1抗胰蛋白酶缺陷、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、慢性肉芽肿病、家族性高胆固醇血症、范科尼贫血(Fanconi’s amemia)、戈谢病(Gaucher’s disease)、亨特综合征(Hunter’s syndrome)、鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷、嘌呤核苷酸磷酸化酶缺陷、ADA-SCID、白细胞粘附缺陷、卡纳范病(Canavan disease)、胼胝体萎缩、法布莱病(Fabry′s disease)、肌萎缩性侧索硬化、溶酶体病、冯维勒布兰德病(von Willebrand′s disease)或地中海贫血。通过本发明的方法制备导入了作为原因的基因的HAC载体，给患者施用的方法不特别限制。例如，将HAC载体导入人细胞，然后将产物移植到患者。这样，可以补充和补足缺陷分子。关于致病基因的信息，可以参考美国国家生物技术信息中心(NCBI)的在线文献数据库，即PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝PubMed)或OMIM^TM-Online Mendelian Inheritance in Man^TM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)。

(F)其它疾病

(F-1)血小板生成素(TPO)是在血小板产生和造血干细胞/前体细胞增殖中起作用的因子。例如，推断将其施用于血液病，如再生障碍性贫血、化疗后的造血恢复等。但是，在施用TPO重组蛋白时产生活性中和抗体成为了开发药用产品的阻碍(Li et al.，Blood，98：3241-3248，2001)。因此，当将TPO用于慢性疾病时，需要患者去医院，以便定期施用TPO，这可能妨碍患者的生活质量。同样，重组蛋白制剂的制备不利地需要高花费，这随后并且不利地给患者施加了高医学花费的负担。

通过本发明的方法制备已经导入了TPO基因组的HAC载体，给患者施用的方法不特别限制。将HAC载体导入人细胞，例如，生殖组织的细胞，表达TPO，并且以生理/组织特异性方式提供，并且随后可以抑制自身抗体的产生。这可以减少定期医院随访的次数，并且可以改善患者的生活质量。

(F-2)红细胞生成素(EPO)是一种红细胞生长因子，它可以商购，作为由糖尿病、肾病等导致的肾性贫血的治疗剂。具有慢性病，例如由糖尿病导致的肾性贫血的患者需要去医院进行定期EPO施用，这破坏了患者生活质量。同样，制备重组蛋白制剂不利地需要高花费，这随后并且不利地给患者施加了高医学花费的负担。如本发明的实施例14中描述的，将导入了EPO cDNA的HAC载体导入人正常成纤维细胞中，将产物移植到患者，然后可以表达EPO并且给患者提供。同样，通过本发明的方法制备导入了hEPO基因组区的HAC载体，将得到的HAC载体导入人细胞，例如，生殖组织的细胞，但给患者施用的方法不特别限制。因此，可以表达EPO，并且以生理/组织特异性方式提供。这可以减少定期医院随访的次数，并且可以改善患者的生活质量。

(F-3)帕金森病

帕金森病是一种神经疾病，其中运动神经功能受到中脑黑质的致密部的多巴胺合成细胞进行性变性和损失的破坏。治疗方法的一个实例是L-DOPA施用方法，其目的是补充损失的多巴胺。但是，所述方法在以下方面是有问题的。在中度或晚期症状的情况下，药效减弱，并且副作用导致患者的生活质量受限和剂量降低。所述问题是由以下事实导致的：多巴胺浓度在纹状体中不恒定，并且施用的L-DOPA在纹状体外起作用。因此，需要纹状体中多巴胺的恒定生理表达(Takeda et al.，MedicalScience Digest，vol.29；20，2003，New Sciences)。目前，已经研究了使用AAV载体的基因治疗，所述载体中分别导入了3种类型的与多巴胺合成相关的酶。但是，任何得到的载体都不足以调节生理表达。目标在于抑制多巴胺合成细胞变性和损失的治疗方法的一个实例是施用来源于胶质细胞的神经元因子(GDNF)。尽管作为通过壳核内的留置导管连续施用的结果观察到其效果(Gill et al.，Nature Med.，9：589-595，2003)，但感染的危险或限制患者生活质量仍然是带来问题的。尽管通过基于动物模型的研究显示了基于AAV载体的基因治疗的效果(Wang et al.，Gene Ther.，9：381-389，2002)，但这不足以调节生理表达。

可以通过本发明的方法制备导入了与多巴胺合成相关的酶或GDNF基因组区的HAC载体。给患者施用的方法不特别限制，将HAC载体导入人细胞(如人正常神经干细胞/前体细胞)，将产物移植到患者，然后可以通过生理/组织特异性表达补充导入的基因产物。

(F-4)糖尿病

已经通过施用重组蛋白制剂治疗胰岛素依赖性糖尿病。具有慢性病的患者需要去医院进行定期施用，这破坏了患者生活质量。同样，制备重组蛋白制剂需要高花费，这随后不利地给带来了高医学花费。由于最优血液胰岛素水平的范围小，在过高或过低的血液胰岛素水平下可能发生副作用，并且胰岛素依赖性糖尿病可能偶尔威胁生命。尽管已经研究了基因治疗，但体内胰岛素水平的调节仍然是关注的问题(Moritani et al.，Protein，Nucleic Acid，and Enzyme，vol.40：2764，1995，Kyoritsu ShuppanCo.，Ltd)。

通过本发明的方法制备导入了胰岛素基因的HAC载体。尽管给患者施用的方法不特别限制，将HAC载体导入人细胞，如生殖组织的细胞，并且可以表达所述基因组，并且以生理/组织特异性方式提供。这可以减少定期医院随访的次数，并且可以改善患者的生活质量。

(F-5)要治疗的疾病不特别限制。例如，按照以下方式，可以治疗脑肿瘤、外周动脉病(例如局部缺血)、慢性类风湿关节炎、动脉再狭窄、肘管综合征、冠状动脉病、阿尔茨海默病、溃疡、骨盆骨折、肾病或恶性肿瘤。通过本发明的方法制备HAC载体，其中导入了编码认为治疗疾病所必须的物质的基因。尽管给患者施用的方法不特别限制，例如，将HAC载体导入人细胞，将产物移植到患者，并且可以补充和补足缺陷分子。(8)用于制备具有HAC载体的转基因动物和非人动物的载体

通过本发明的方法制备的HAC载体可以用作制备转基因动物的载体。例如，根据Tomizuka et al.，Nature Genet.，U.S.A.，vol.16，pp.133-143，1997，Tomizuka et al.，P.N.A.S.，U.S.A.，vol.97，pp.722-727，2000，或Kuroiwa et al.，Nature Biotech.，U.S.A.，vol.18，pp.1086-1090，2000中描述的方法，可以将包含外源基因的HAC载体导入小鼠胚胎干细胞，以制备嵌合个体。同样，可以在个体中功能性表达导入的外源基因，并且可以在嵌合个体中稳定保留包含外源基因的HAC载体，并且通过种系遗传给下一代。此外，根据Kuroiwa等(2002，如上文所述)的方法，包含外源基因的HAC载体能够通过体细胞核移植制备克隆的牛个体，并且在个体中稳定保留和功能性表达导入的外源基因。同样，可以通过已知技术(如本申请人提交的WO 97/07671、WO 03/041495和WO 03/097812中公开的涉及使用胚胎干细胞的方法或核移植方法)制备携带本发明的HAC的动物。动物物种不特别限制，优选是哺乳动物，特别优选牛、山羊、猪、绵羊、狗、大鼠、小鼠、猴等。

实施例

参照以下实施例更详细描述本发明，但本发明的范围不限于此。

在实施例1-5中，通过去除人14号染色体的长臂远侧区、在长臂远侧区添加端粒序列，以及插入定点重组酶的识别位点，制备HAC载体(此后所述HAC载体可以称作“端粒型14HAC”或＂14AΔqHAC＂)。检验了其安全性和导入的外源基因的表达。

在实施例6-11中，通过去除人14号染色体的长臂远侧区、在长臂远侧区添加端粒序列和来源于人14号染色体的大约25Kb的亚端粒序列，以及插入定点重组酶的识别位点，制备HAC载体(此后所述HAC载体可以称作“端粒·短亚端粒型HAC”或＂14NΔqHAC＂)。检验了其安全性和导入的外源基因的表达。

在实施例12-17中，通过去除人14号染色体的长臂远侧区、在长臂远侧区添加端粒序列和来源于人14号染色体的大约60Kb的亚端粒序列，以及插入定点重组酶的识别位点，制备HAC载体(此后所述HAC载体可以称作“端粒·长亚端粒型HAC”或＂14gNΔqHAC＂)。检验了其安全性和导入的外源基因的表达。

在实施例18-22中，从上述3种类型的HAC载体除去了新霉素抗性基因单位。

在实施例23-25中，通过去除人21号染色体的长臂远侧区、在长臂远侧区添加端粒序列，以及插入定点重组酶的识别位点，制备HAC载体(此后所述HAC载体可以称作“端粒型21HAC”或＂21AΔqHAC＂)。检验了其安全性和导入的外源基因的表达。

在实施例26-30中，通过去除人21号染色体的长臂远侧区、在长臂远侧区添加端粒序列和来源于人21号染色体的大约8Kb的亚端粒序列，以及插入定点重组酶的识别位点，制备HAC载体(此后所述HAC载体可以称作“端粒·亚端粒型HAC”或＂21NΔqHAC＂)。

实施例

实施例1

通过去除人14号染色体的长臂远侧区而制备端粒型14HAC(14AΔqHAC)载体

(1)通过端粒截短去除人14号染色体的长臂

(1-1)构建用于端粒截短的pTELpuro-t1载体

作为用于去除人14号染色体的长臂远侧区的端粒截短载体(导向载体)，使用pTELpuro(Kuroiwa et al.，Nature Biotech.，U.S.A.，vol.18，pp.1086-1090，2000)。基于从GenBank数据库获得的人14号染色体的长臂远侧区的核苷酸序列(编号AL391156)，设计了用于插入端粒截短载体的靶序列。下文示出了寡核苷酸引物的序列，所述引物包含添加的用于扩增靶序列的限制酶识别位点。

7791F Nhe1：5′-AGCTAGCTCAACTGGCTCCTGATTTCTCTC(SEQ IDNO：1)

10680R(XhoI)：5′-ATCTTCCTCGAGTCACCAAACTTG(SEQ ID NO：2)

10657F(XhoI)：5′-CAAGTTTGGTGACTCGAGGAAGAT(SEQ ID NO：3)

14620R BamHI：5′-GGGATCCTTTCAAGTGGAAGAGTGAGGTCC(SEQID NO：4)

培养携带人14号染色体的小鼠A9杂交细胞(A9c11-14chr，Shinohara et al.，Hum Mol Genet，10：1163-1175，2001)，用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System)从细胞提取基因组DNA。获得的基因组DNA用作模板，用上述引物通过PCR扩增要重组的靶序列。约0.1μg基因组DNA用作模板，用GeneAmp9700热循环仪(Applied Biosystems)根据Innis et al.(PCR Experimental Manual，HBJ Press，1991)进行PCR。使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，并且反应在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸10分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸10分钟，25个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸10分钟，并且72℃下延伸10分钟。用限制酶NheI和XhoI消化用7791FNhe1/10680R(XhoI)扩增的2.9-kb产物，用限制酶XhoI和BamHI(Roche)消化用10657F(XhoI)/14620RbamHI扩增的3.9-kb产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离具有粘端的DNA片段，然后纯化。将产物克隆到pTELpuro质粒的XbaI-BamHI位点中。最终的pTELpuro-t1构建体的大小是大约12.8kb。端粒截短载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因示于图2和图3。

(1-2)将端粒截短载体导入携带人14号染色体的DT40细胞

用携带人14号染色体的上述A9c11-14chr细胞作为染色体供体细胞，通过微细胞介导的染色体转移方法制备携带人14号染色体的DT40杂交细胞。染色体受体细胞DT40在日本研究生物资源保藏中心(JCRB)以编号JCRB2221注册，并且可以由其获得。下文简述其制备方法。

开始时，从大约1×10⁸个A9c11-14chr细胞制备微细胞。在含有秋水仙酰胺(0.075μg/ml，脱羰秋水仙碱，Wako Pure Chemical IndustriesLtd.)的培养基(20％胎牛血清；FBS，0.8mg/ml G418，DMEM)中将已经在12个25-cm²离心烧瓶(Nunc)中培养到高达约80％汇合的细胞密度的A9c11-14chr细胞培养48小时，以诱导微核形成。在下文的实施例中，使用了由Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.生产的DMEM。除去培养基后，将预热到34℃的松胞菌素B(在DMEM中为10μg/ml，Sigma)溶液装入离心烧瓶中，在34℃和8,000rpm下离心1小时。将微细胞悬浮于无血清的培养基(DMEM)中，回收，用装有孔径为8μm，5μm和3μm的滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)通过过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于6ml DMEM中。在含有10％ FBS，1％ CS(小牛血清)和0.1mM2-ME的RPMI 1640培养基中培养DT40细胞，用DMEM洗涤两次，将1×10⁷个细胞重悬于5ml DMEM中。室温和1,500rpm下将微细胞悬浮液离心5分钟，在其上覆盖DT40细胞悬浮液，室温和1,500rpm下离心5分钟，然后除去上清液。用聚乙二醇(PEG)1:1.4溶液对细胞进行融合处理90秒(Tomizuka et al.，Nature Genet.，U.S.A.，vol.16，pp.133-143，1997)。将融合的细胞悬浮在含10％ FBS，1％鸡血清(ChS)和0.1mM 2-巯基乙醇(ME)的60ml RPMI 1640培养基(Invitrogen)中，将得到的悬浮液铺板于6个96孔板中，培养24小时，在含有1mg/ml G418的培养基中进行选择培养约2周。分离作为两次微细胞融合实验的结果而发展的药物抗性集落。用PCR分析，证实了人14号染色体上NEK2P，LOC122727，AL390798，AL121820，AL157858，AL137190，AL137229，IGHMC，IGHV3和AB019437区的存在，进一步进行使用人特异性探针Cot1(Gibco BRL)的荧光原位杂交(FISH)分析，以鉴定和获得携带人14号染色体拷贝的克隆DT40(-14)1-2和DT40(-14)2-4。

通过用SrfI限制酶消化将pTELpuro-t1构建体转化为线性DNA，然后导入携带人14号染色体的DT40杂交细胞中。将1×10⁷个DT40(-14)1-2或DT40(-14)2-4细胞悬浮于0.5ml RPMI培养基中，使悬浮液在30μg DNA存在下在室温下静置10分钟，然后用Gene Pulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。将550V的电压施加于电容为25μF的电容器，然后用具有4mm的电极间距离的电穿孔细胞放电。使细胞在室温下静置10分钟后，将电穿孔的细胞悬浮于含10％ FBS，1％ ChS和0.1mM2-ME的RPMI 1640培养基中，将悬浮液铺板在20个96孔板(Falcon)中。24小时后，加入嘌呤霉素(二盐酸嘌呤霉素，Sigma)到终浓度为0.3μg/ml，此后使抗性集落发展2-3周。通过两次转染操作从DT40(-14)1-2细胞分离总共276个药物抗性集落，通过4次转染操作从DT40(-14)2-4细胞分离总共294个药物抗性集落，使分离的集落生长，然后进行随后的分析。

(1-3)PCR分析

将嘌呤霉素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR证实基因在人14号染色体上的存在，下面示出了STS标记物，即D14S272和6种基因或基因组区。STS标记物的寡核苷酸引物的序列可以获自国家生物技术信息中心(美国)的在线数据库UniSTS(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝unists)。STS标记物的编号是UniSTS:45129。基于获自Genbank数据库的核苷酸序列设计的基因的位置或基因组区中寡核苷酸引物的位置示于图3(其中引物用箭头指出)，其序列示于下文。

AL39 5409F：5′-GCATGCCTTCAATGTGTGAC(SEQ ID NO：5)

AL39 5811R：5′-CAGCAGAGCCAAGATCCAGT(SEQ ID NO：6)

AL39 7258F：5′-TCCACAGTTTCACCAGCATC(SEQ ID NO：7)

AL39 7656R：5′-AAGTGGGCGGATAACCTGAG(SEQ ID NO：8)

NEK2PF：5′-CAGCCAGTGTTTTCCTGGAT(SEQ ID NO：9)

NEK2PR：5′-TCTTTGCTCTTCTGCAACCA(SEQ ID NO：10)

LOC122727F：5′-CGATCAGAATGGGAAACCAG(SEQ ID NO：11)

LOC122727R：5′-TTGTCGCTGGAATTTGTTGA(SEQ ID NO：12)

70-5F：5′-TCACCATGATCGATTGAGTT(SEQ ID NO：13)

70-5R：5′-GCATTGCTGGGTCATATGGT(SEQ ID NO：14)

IGHV3F：5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG(SEQ ID NO：15)

IGHV3R：5′-CTTGTGCTACTCCCATCACT(SEQ ID NO：16)

将已知引物用于STS标记物，即D14S282。

将大约0.1μg基因组DNA用作模板，通过PCR扩增上述6种类型的基因或基因组区和D14S272标记物(总共7种类型)。使用Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，反应在94℃下进行5分钟，然后是35个循环的94℃下变性15秒，56℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒。当通过端粒截短去除长臂远侧区时，推断产物包含NEK2P、LOC122727和70-5，并且推断产物不包含AL395409-AL395811、AL397258-397656、D14S272标记物或IGHV3。根据AL397258-397656的存在或缺乏进行初次筛选后，分析其它标记物。在570个嘌呤霉素抗性株中，在6株(5个来源于DT40(-14)1-2的克隆和1个来源于DT40(-14)2-4的克隆)中达到了推断的扩增结果。

(1-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。在同源重组的靶序列中指定探针(图4)。为了制备探针，用下文显示的寡核苷酸引物对，和作为模板的、包含人14号染色体的A9c11-14chr细胞的基因组DNA进行PCR，分离产物，并且纯化。

AL39 15138F：5’-TGGCTTGGCATACATTTTGA(SEQ ID NO：17)

AL39 15738R：5’-AGGGAGTTCCTCACACAGGA(SEQ ID NO：18)

用SphI限制酶(Roche)消化从通过初次筛选获得的6个株提取的约5μg基因组DNA，通过Ausubel et al.(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。通过Typhoon9210图像分析仪(Molecular Dynamics)检测与³²P-标记的探针杂交的信号。代表性的结果示于图5。从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体形式是10.4kb，以野生型(即非重组)形式是11.1kb，从6个候选株证实了总共6株同源重组细胞。

(1-5)荧光原位杂交(FISH)分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)和FITC标记的PGK-puro片段(通过从pTELpuro载体切割而制备)作为探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。结果，在大多数观察的有丝分裂象中检测到了缩短的人14号染色体和位于Cot1染色的缩短的人14号染色体的长臂末端的两个FITC信号。代表性的FISH图示于图6a和图6b。在图6a中，白色箭头表明端粒截短前的全长人14号染色体。在图6b中，白色箭头表示长臂远侧区缺失的人14号染色体片段。基于与宿主DT40细胞染色体相关的大小，证实了人14号染色体的缩短。

因此，证实如上文所述获得的6个嘌呤霉素抗性株(即12t97，12t134，12t159，12t201，12t225和24t8)通过去除长臂并且在其末端具有端粒序列的方式，携带来源于人14号染色体的人工染色体(14AΔqHAC)。

(2)将克隆位点导入14AΔqHAC的长臂近侧区

(2-1)构建用于插入loxP和3’neo序列的t1pSF1载体

作为用于将loxP和3’neo序列插入实施例(1-1)制备的人类人工染色体(HAC)的基础质粒，使用pSF1(Lifetech)。将要插入loxP和3’neo序列的人14号染色体的长臂近侧区的核苷酸序列获自GenBank数据库(编号AL391156)。用于扩增用于同源重组的两个靶序列的寡核苷酸引物的序列如下所示。

49050F2longSalI：

5′-GACAGTGTCGACAGTGAGACTTGTAGGCTACAAGAAAAGG(SEQID NO：19)

53978Rlong2SalI：

5′-GACAGTGTCGACTCTGATAATGCGGAATGAGTAGGGAGGC(SEQID NO：20)

54023Flong2FseI：

5′-GATGGCCGGCCTGGTTGGTAAAGATTGCTACACTTACGGCA(SEQID NO：21)

56084RlongPacI：

5′-CTTAATTAACAAGAGCTCTACAACTGTCCATCGAAAC(SEQ IDNO：22)

从携带人14号染色体的A9c11-14chr细胞提取的基因组DNA用作模板，通过PCR扩增两个靶序列。用SalI限制酶(Roche)消化约5kb的DNA片段，用FseI和PacI(Roche)消化约2kb的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离具有粘端的DNA片段，然后纯化。将产物克隆到pSF1③质粒的SalI或FseI-PacI位点。按照以下方式构建pSF1③载体。即，通过用限制酶XhoI(Roche)和SalI(Roche)消化，从pCMV/Bsd(Invitrogen)切下用于选择同源重组的杀稻瘟素抗性基因的约1.3kb的片段，以与3′neo序列相反的转录方向插入pSF1质粒的XhoI位点。进一步，在用ApaI(Roche)消化后将导入了杀稻瘟素抗性基因的pSF1构建体导入平端化的区域，并且插入SNESPF接头(SalI-NheI-EcoRV-SrfI-PacI-FseI)。SNESPF接头的DNA序列如下所示。

SNESPF接头S

GTCGACGCTAGCGATATCGCCCGGGCTTAATTAAGGCCGGCC(SEQID NO：178)

SNESPF接头AS

GGCCGGCCTTAATTAAGCCCGGGCGATATCGCTAGCGTAGAC(SEQID NO：179)

最终构建体的大小是约13.4kb。导向载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因示于图7-9。由此获得的构建体称作t1pSF1载体。(2-2)将t1pSF1载体导入携带14AΔqHAC的DT40细胞

通过用SrfI限制酶(Roche)消化将t1pSF1构建体线性化，导入携带长臂远侧区被去除的14AΔqHAC的DT40杂交细胞中。将1×10⁷个12t97或12t134细胞悬浮于0.5ml RPMI培养基中，使细胞在30μg DNA存在下在室温下静置10分钟，然后用Gene Pulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。将550V的电压施加于电容为25μF的电容器，然后用具有4mm的电极间距离的电穿孔细胞放电。使细胞在室温下静置10分钟后，将电穿孔的细胞悬浮于含10％ FBS，1％ ChS和0.1mM 2-ME的RPMI 1640培养基中，将悬浮液铺板在20个96孔板(Falcon)中。24小时后，加入杀稻瘟素(杀稻瘟素S盐酸盐，Funakoshi)到终浓度为8μg/ml，此后使抗性集落发展2-3周。通过两次转染操作从12t9细胞分离总共56个药物抗性集落，通过单次转染操作从12t134细胞分离总共43个药物抗性集落，使分离的集落生长，然后进行随后的分析。

(2-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。通过将这两个靶序列夹心(在图7中，这两个序列命名为SalI-SalI序列和PacI-FseI序列)，分别在染色体上和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置由图8中的箭头指出。序列如下所示。

AL39 48691F：5’-GCAGTGACAGAAGTCCATGTTGAACTGTAC(SEQID NO：23)

ApaIlongFw1：5’-CACAGCAACCACAGTGCTTCTTGATGAG(SEQ IDNO：24)

ApaIlongRv1：5’-TCCAGAAGTGTTGGTAAACAGCCCACAA(SEQ IDNO：25)

AL39 56194R：5’-TAGTCTCTCTGGATGAATATCAGCAAAACT(SEQID NO：26)

使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，并且反应在下述条件下进行。5’基因组分析在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸10分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸10分钟，25个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸10分钟，并且72℃下延伸10分钟。3’基因组分析在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸6分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸6分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸6分钟，并且72℃下延伸10分钟。在PCR反应溶液中加入MgSO₄(终浓度：0.5mM)。

在99株获得的杀稻瘟素抗性DT40细胞中，发现12株产生具有可以从核苷酸序列推导的大小的扩增产物(5基因组：约5kb；3基因组：约2kb)。

(2-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。在同源重组的靶序列外指定两种类型的探针，即N5’(i)和N3’(ii)(图9)。为了制备探针，用下文显示的寡核苷酸引物对，和作为模板的、携带人14号染色体的A9c11-14chr细胞的基因组DNA进行PCR，分离产物，并且纯化。

AL39 46181F：5’-AAGACACCAGGGAGTAACCT(SEQ ID NO：27)

AL39 46778R：5’-GCTGAACCACTAAGGGTGAC(SEQ ID NO：28)

AL39 56451F：5’-GGAATAGGGATTAGGAAATG(SEQ ID NO：29)

AL39 57026R：5’-ACATGAGGTTTATTTGGTGG(SEQ ID NO：30)

用StuI限制酶(Roche)消化从通过初次筛选获得的12个株提取的约5μg基因组DNA，通过Ausubel et al.(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。通过Typhoon9210图像分析仪(Molecular Dynamics)检测与³²P-标记的探针杂交的信号。代表性的结果示于图10。从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度作为5’基因组分析和3’基因组分析的结果，以同源重组体的形式是24.6kb，以野生型(即非重组)形式是18.2kb。从12个候选杀稻瘟素抗性株证实了总共7株同源重组体。

作为上述实验(2-1)-(2-4)的结果，获得了7株携带通过同源重组而插入了克隆位点(即loxP序列)的14AΔqHAC载体的DT40杂交细胞(即12t97S1，12t97S38，12t134S1，12t134S2，12t134S3，12t134S5和12t159S1)。

(3)将14AΔqHAC载体导入CHO细胞

(3-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将14AΔqHAC载体导入CHO细胞

作为染色体供体细胞，使用实施例1(2)获得的DT40杂交细胞(12t97S1，12t97S38和12t134S2)，其携带14AΔqHAC载体，所述载体去除了长臂远侧区，在其中插入了克隆位点(loxP序列)。作为染色体受体细胞，使用来源于中国仓鼠的细胞系CHO-K1(编号JCRB9018)。

开始时，从大约10⁹个DT40杂交细胞制备微细胞。在含有秋水仙酰胺(0.05μg/ml，Invitrogen)的培养基(10％ FBS，1％ ChS，和0.1mM 2-巯基乙醇，RPMI 1640)中将已经培养到约60-70％汇合的细胞密度的DT40杂交细胞培养13-18小时，以诱导微核形成。通过离心回收细胞，重悬于无血清的DMEM中，铺于12个25-cm²离心烧瓶(Nunc)中，所述烧瓶提前用聚L-赖氨酸包被过。使细胞在37℃下静置1小时，在细胞贴壁后除去培养基，将在37℃预热的松胞菌素B(在DMEM中为10μg/ml，Sigma)溶液装入离心烧瓶中，将烧瓶插入离心机中，在34℃和8,000rpm下离心1小时。将微细胞悬浮于无血清的培养基(DMEM)中，回收，用装有孔径为8μm，5μm和3μm的滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)通过过滤纯化，将产物悬浮于5ml DMEM中。室温和1,500rpm下将微细胞悬浮液离心5分钟，在其上覆盖已经用DMEM洗涤两次然后悬浮于5ml DMEM中的约10⁷个CHO-K1细胞，室温和1,500rpm下离心5分钟，然后除去上清液。将细胞在含45％聚乙二醇1500(PEG 1500，Roche)和10％ DMSO(Sigma)的DMEM培养基中进行融合处理120秒，悬浮于120ml含10％ FBS的F12培养基(Invitrogen)中，铺板于5个48孔板(Falcon)中，此后在含杀稻瘟素(8μg/ml)的选择培养基(10％ FBS，F12)中培养24-36小时。选择培养进行约2周后，分离发展的药物抗性集落，进行随后的分析。通过6次微核细胞融合操作，获得了总共28株杀稻瘟素抗性CHO株(即，9个来源于12t97S1的株，10个来源于12t97S38的株，和9个来源于12t134S2的株)。

(3-2)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。根据实施例1(2-3)进行PCR。在获得的22株杀稻瘟素抗性CHO细胞株，发现20株产生具有从核苷酸序列推导的大小的扩增产物(即约5kb；5’基因组区和约2kb；3’基因组区)。

(3-3)DNA印迹杂交

为了证实导入的14AΔqHAC载体的结构，按照与实施例1(2-4)相同的方式进行DNA印迹分析。代表性的结果示于图11中。从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度作为5’基因组分析和3’基因组分析的结果，以同源重组体的形式是24.6kb，以野生型(即非重组)形式是18.2kb。从20个候选杀稻瘟素抗性株证实了总共19株同源重组体(6个来源于12t97S1的株，8个来源于12t97S38的株，和5个来源于12t134S2的株)。

(3-4)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。作为分析17株杀稻瘟素抗性CHO株的结果，发现总共8株(即1个来源于12t97S1的株：4-1，来源于12t97S38的株：3-3，-6，-8，-9，来源于12t134S2的株：-3，-5，-6)是正常核型，在大多数观察到的有丝分裂象中检测到Cot1染色的14AΔqHAC载体的拷贝。代表性的FISH图和14AΔqHAC载体的核型示于图12A和12B。

基于上述(3-1)-(3-4)的实验，发现8株获得的杀稻瘟素抗性CHO株携带14AΔqHAC载体。

实施例2

分析14AΔqHAC载体在CHO细胞中的长期稳定性

(1)在非选择性培养条件下长期传代培养

为了证实14AΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例1中描述的3个CHO细胞系(12t97S38-6，-8和-9；下文中12t7S缩写为＂t7S38-6，-8和-9＂)。非选择培养基是含有10％ FBS的F12培养基，选择培养基含有所述F12培养基和以8μg/ml添加的杀稻瘟素。将5.0×10⁵个CHO细胞铺于10-cm培养皿中，对已经培养至约80-90％汇合的细胞密度的细胞进行计数，将5.0×10⁵个细胞再次铺板在10-cm培养皿中，传代培养继续进行直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。第10次传代后回收CHO株，制备FISH染色体样品。

(2)FISH分析

用人特异性Cot1探针(Invitrogen)，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。以双份测量群体倍增水平和HAC保留，确定平均值。结果示于表1和图13。

表1：14AΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性

 

HAC细胞群传代培养次数HAC保留(％)无药物选择      有药物选择t7S38-6t7S38-8t7S38-9培养开始时10次传代培养开始时10次传代培养开始时10次传代-               9493              90-               9272              82-               9484              84

在图13中，＂21ΔqHAC＂表示关于来源于人21号染色体的HAC载体(WO2004/031385)的结果，＂14AΔqHAC＂表示关于实施例1或2制备的HAC载体的结果，＂14NΔqHAC(G)＂表示关于实施例6或7制备的HAC载体的结果，＂14gNΔqHAC(g)＂表示关于实施例12或13制备的HAC载体的结果。

14AΔqHAC载体在长期传代培养后在CHO细胞中稳定保留。作为中期染色体图的观察结果，每个细胞检测到1或2个信号。

实验(1)和(2)证明14AΔqHAC载体可以在非选择性培养条件下在CHO细胞中稳定保留，并且可以保持每个细胞的拷贝数。

实施例3

分析包含导入其中的hEPO-14AΔqHAC载体的CHO杂交细胞中的hEPO基因表达

(1)构建hEPO-14AΔqHAC载体

(1-1)将hEPO基因导入14AΔqHAC载体中

将hEPO基因表达单位插入实施例1中构建的14AΔqHAC载体中。具体地，制备含有loxP序列的hEPO表达质粒，瞬时表达Cre重组酶以便通过loxP序列之间的定点重组将基因表达单位插入人工染色体。用G418抗性的获得(即启动子-片段化的新霉素抗性基因表达单位的重建)作为指示物选择包含插入序列的重组体。其概要示于图14。

用胰蛋白酶处理实施例1制备的携带14AΔqHAC载体(t7S1-1，t7S38-6和t7S38-8)的CHO杂交细胞，将5×10⁶个细胞悬浮于0.8mlHank氏平衡盐溶液(HBSS)。在10μg含有loxP序列的hEPO表达质粒pLN1-EPO(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)和10μg Cre酶表达载体pBS185(Life-Tech)的存在下，用Gene Pulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。将450V的电压施加于电容为500μF的电容器，然后用具有4mm的电极间距离的电穿孔细胞放电。将电穿孔的细胞铺板在5个含有F12培养基(Invitrogen)的48孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养基包含添加在其中的10％ FBS。2天后，用含有0.8mg/ml G418(遗传霉素，Invitrogen)的培养基更换培养基。此后使G418抗性集落发展2-3周，分离总共113个集落(6个来源于t7S1-1的集落，70个来源于t7S38-6的集落，和37个来源于t7S38-8的集落)，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(1-2)PCR分析

使用SVpANp1和Neo Rp2引物，通过PCR检查hEPO基因表达单位是否插入到14AΔqHAC载体的loxP序列的位点中，从而选择包含插入其中的hEPO基因表达单位的重组体，所述引物是在pLN1-EPO载体和14AΔqHAC载体上设计的，以夹心loxP序列的位点。同样，用pBS226质粒载体的M13RV和Neo Rp2引物通过PCR检查插入的hEPO基因的扩增，从而选择它。根据Kakeda et al.(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法确定引物序列和PCR条件。在包含插入序列的重组体的情况下，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，并且用M13RV和Neo Rp2引物推导约2.7kbp的扩增。作为结果，在上文(1-1)中获得的G418抗性CHO杂交细胞的总共65株中观察到了推导的扩增(即6个来源于t7S1-1的株，37个来源于t7S38-6的株，和22个来源于t7S38-8的株)。因此，发现这65株G418抗性CHO杂交细胞是包含插入loxP序列中的hEPO基因表达单位的重组体。

(1-3)DNA印迹分析

为了检查hEPO-14AΔqHAC载体是否合适地携带hEPO表达单位，进行DNA印迹分析。根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行该方法。代表性的结果示于图15中。由核苷酸序列推导的XbaI消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hEPO表达单位(图15)。在(1-2)中获得的64株候选G418抗性CHO杂交细胞中的总共33株(即4个来源于t7S1-1的株，13个来源于t7S38-6的株，和16个来源于t7S38-8的株)中观察到了具有推导的大小的条带。

(2)插入14AΔqHAC载体中的hEPO基因的表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将33株实施例3(1-3)中分离的携带hEPO-14AΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞以约10⁵个细胞的量铺板在12孔组织培养塑料培养皿(Falcon)上，该培养皿包含2ml含有0.8mg/ml的G418的F12培养基，所述培养基中含有10％ FBS。细胞达到汇合后，用2ml含10％FBS的F12培养基更换培养基，培养进行2天，再次用1ml含添加的10％FBS的F12培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，确定细胞计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPOImmunoassay，R&D Systems)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验结果的平均值示于图16。

因此，在所有33株携带hEPO-14AΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞中观察到了hEPO表达。其表达水平高于长臂缺失的EPO-21ΔqHAC载体的表达水平。

(3)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法，用人特异性Cot1(Invitrogen)探针进行FISH分析。在(1-3)中获得的G418抗性CHO杂交细胞中，对14株进行分析。结果，在总共9株(即3个来源于t7S1-1的株：E4、E5和E6；3个来源于t7S38-6的株：E25、E30和E34；和3个来源于t7S38-8的株：E5、E7、E21)的大多数观察到的有丝分裂象中检测到了正常核型和Cot1染色的hEPO-14AΔqHAC载体的拷贝。

实验(1)证明了得到的9个G418抗性株是携带hEPO-14AΔqHAC载体的正常核型的CHO细胞。

实施例4

分析hEPO-14AΔqHAC载体在CHO杂交细胞中的长期稳定性

(1)在非选择性培养条件下长期传代培养

为了证实hEPO-14AΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下和选择性培养条件下(对照组)进行长期传代培养。使用了实施例3中获得的3株CHO杂交细胞(t7S38-6E25，t7S38-6E34和t7S38-8E5)。非选择培养基是含有10％ FBS的F12培养基，选择培养基含有所述F12培养基和以8μg/ml添加到其中的杀稻瘟素。将5.0×10⁵个CHO细胞铺于10-cm培养皿中，对已经培养至约80-90％汇合的细胞密度的细胞进行计数，将5.0×10⁵个细胞再次铺板在10-cm培养皿中，传代培养继续进行直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。第10次传代后回收CHO株，进行hEPO基因表达分析和FISH分析。

(2)长期传代培养后的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。根据实施例3(2)的方法分析上述(1)中进行了长期传代培养的3株携带hEPO-14AΔqHAC载体的CHO杂交细胞。结果，在长期传代培养后，在所有3株携带hEPO-14AΔqHAC载体的CHO杂交细胞中都观察到了hEPO表达。以双份进行的实验的结果的平均值示于图18中。示于图18中的克隆6E25、6E34和8E5各自表示t7S38-6E25、t7S38-6E34和t7S38-8E5。

(3)FISH分析

用人特异性Cot1探针(Invitrogen)，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。以双份测量群体倍增水平和HAC保留，确定平均值。关于上述3株的结果示于表2和图18。

表2：hEPO-14AΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性

 

HAC细胞群传代培养次数         HAC保留(％)无药物选择       有药物选择t7S38-6E25t7S38-6E34t7S38-8E5培养开始时10次传代培养开始时10次传代培养开始时10次传代-                94.095.5             97.8-                92.088.4             97.7-                98.094.2             97.8

hEPO-14AΔqHAC载体在长期传代培养后在CHO细胞中稳定保留。作为中期染色体图的观察结果，每个细胞检测到1或2个信号。

上述实验(1)-(3)证明hEPO-14AΔqHAC载体可以在非选择性培养条件下长期传代培养后在CHO细胞中稳定保留，可以保持每个细胞的拷贝数，并且可以保持hEPO基因表达。

实施例5

包含导入其中的hEPO-14AΔqHAC载体的人正常成纤维细胞中的hEPO基因表达

(1)制备导入了hEPO-14AΔqHAC载体的人正常成纤维细胞

(1-1)通过微核融合将hEPO-14AΔqHAC载体导入人正常成纤维细胞HFL-1

作为染色体供体细胞，在实施例3中获得的携带hEPO-14AΔqHAC载体的CHO细胞中，使用了具有形成微核的能力的克隆(t7S38-6E25，t7S38-6E34和t7S38-8E5)。作为染色体受体细胞，使用了人正常成纤维细胞HFL-1(获自RIKEN生物资源中心的细胞工程部门；编号RCB0521)。开始时，从约t7S38-6E25或t7S38-8E5的约10⁷个细胞制备微细胞。具体地，在含有秋水仙酰胺(0.1μg/ml，Invitrogen)的培养基(含20％ FBS和0.8mg/ml G418的F12培养基)中将已经在24个25-cm²离心烧瓶(Nunc)中培养到约80-90％汇合的细胞密度的t7S38-6E25或t7S38-8E5细胞培养3天，以诱导微核形成。除去培养基后，将预热到37℃的松胞菌素B(在DMEM中为10μg/ml，Sigma)溶液装入离心烧瓶中，将离心烧瓶插入离心机中，在34℃和8,000rpm下离心1小时。将微细胞悬浮于无血清的培养基(DMEM)中，回收，用装有孔径为8μm，5μm和3μm的滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)通过过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于2ml含有50μg/ml植物凝集素P(Difco)的DMEM中。将纯化的微核细胞添加到2个25-cm²培养烧瓶(Falcon)中，HFL-1细胞已经在所述烧瓶中培养到90％汇合，使细胞在37℃下静置15分钟，然后将细胞在含45％聚乙二醇1500(PEG 1500，Roche)和10％DMSO(Sigma)的DMEM溶液中进行融合1分钟。将细胞在含20％ FBS的DMEM培养基中培养24小时后，通过胰蛋白酶处理使细胞分散，将产物铺板在两个I型胶原包被的48孔组织培养塑料板(Falcon)上。次日，用含有杀稻瘟素(3μg/ml)的选择培养基(含20％ FBS的DMEM)更换培养基。选择性培养进行约4周。分离发展的药物抗性集落，进行随后的分析。作为28次微核细胞融合操作的结果(对t7S38-6E25进行13次操作，对t7S38-6E34进行2次操作，对t7S38-8E5进行13次操作)，获得了138个药物抗性集落(56个来源于t7S38-6E25的集落，26个来源于t7S38-6E34的集落，和56个来源于t7S38-8E5的集落)。在所述集落中，用t7S38-6E25细胞作为染色体供体细胞获得的细胞和用t7S38-8E5细胞获得的细胞在下文中分别称作＂t25H细胞＂和＂t5H细胞＂。(1-2)PCR分析

根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法，使用实施例3(1-2)的SVpANp1和Neo Rp2引物，和STS标记物，即D2S1334引物，通过PCR扩增检查人染色体是否携带hEPO-14AΔqHAC载体。同样，用CHO弗林蛋白酶基因特异性引物，即furin3’subF和furinEx6-28R，通过PCR扩增检查染色体供体CHO细胞的导入。设计的引物的序列如下所示。

furin3’subF：5’-ACTCAGAGATCCACTGCACCAGGATCCAAGGGAGG(SEQ ID NO：31)

furinEx6-28R_short

CTACACCACAGACACCATTGTTGGCTACTGCTGCC(SEQ ID NO：32)

反应在94℃下进行5分钟，然后是32个循环的94℃下变性20秒和随后的68℃下退火/延伸3分钟。当携带hEPO-14AΔqHAC载体的HFL-1细胞不包括染色体供体CHO细胞时，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，用D2S1334引物推导约0.6kbp的扩增，用furin3’subF和furinEx6-28R推导无扩增。结果，在来自上文(1-1)获得的138个杀稻瘟素抗性株的总共7个株(即t5H3，4，26，27，28，29和t25H2细胞)中观察到了推导的扩增。

这样，证实了6个杀稻瘟素抗性株是携带hEPO-14AΔqHAC载体的HFL-1细胞。

(1-3)DNA印迹分析

为了检查hEPO-14AΔqHAC载体是否合适地携带hEPO表达单位，对来自上述杀稻瘟素抗性株的5个株(即t5H3，7，26，27和28细胞)进行DNA印迹分析。该方法是根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行的。代表性的结果示于图19A。从核苷酸序列推导的由XbaI消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hEPO表达单位。结果，在上文(1-2)中获得的所有5个携带hEPO-14AΔqHAC载体的杀稻瘟素抗性株中发现了具有推导的大小的条带。

(1-4)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。使用人14号染色体和人22号染色体特异性α-卫星DNA探针(Q-Biogene，Funakoshi)。作为杀稻瘟素抗性株中的3个株(t5H3，26和28)的分析结果，发现这3个株(t5H3，26和28)是正常核型，在大多数观察的有丝分裂象中，在来源于宿主细胞的一对人14号染色体和人22号染色体的着丝粒区的4个位点中和来源于14AΔqHAC载体拷贝的位点中检测到了信号。结果示于图20A和图20B。

实验(1-1)-(1-4)证明了获得的3个杀稻瘟素抗性株是携带hEPO-14AΔqHAC载体并且具有正常核型的HFL-1细胞。

(2)携带hEPO-14AΔqHAC载体的HFL-1细胞中的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文(1)中分离的4个携带hEPO-14AΔqHAC载体的杀稻瘟素抗性HFL-1株以各自约10⁵个细胞的量铺板在I型胶原包被的24孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养皿中包含1ml含有杀稻瘟素(3μg/ml)的选择培养基(20％ FBS，DMEM)。在细胞达到汇合后，将细胞培养7天，用新鲜培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPOImmunoassay，R&D System)对培养上清液中的hEPO进行定量。其结果在图21中的＂14A-HAC＂中显示。

因此，在所有3个携带hEPO-14AΔqHAC载体的HFL-1株中观察到了hEPO表达。

实施例6

通过从人14号染色体去除长臂远侧区而构建14HAC(14NΔqHAC)载体

通过同源重组将loxP序列插入长臂远侧区和长臂近侧区，使得HAC载体将包含端粒序列和人14号染色体末端的短亚端粒序列(约5kb)，并且通过Cre进行定点重组，从而切割和去除loxP序列的两个位点之间的区域，以便用经过去除的长臂远侧区构建人工染色体载体(14NΔqHAC)。

(1)通过定点重组从人14号染色体去除长臂

(1-1)构建用于将端粒侧loxP序列插入人14号染色体的长臂远侧区的ploxpPGK-14qtel载体

作为用于插入loxP序列的载体(即导向载体)，通过将KpnI^*(用于消除KpnI位点的序列)-SrfI-PacI-PmlI-KpnI接头插入ploxPupBSD(WO 00/10383)的KpnI位点而制备ploxPupBSD-PGK。KpnI^*-SrfI-PacI-PmlI-KpnI接头的核苷酸序列如下所示。

Loxpupbsd kpnI S 5′-AGCCCGGGCTTAATTAACACGTGGGTAC(SEQID NO：33)

Loxpupbsd kpnI AS 5′-CCACGTGTTAATTAAGCCCGGGCTGTAC(SEQ ID NO：34)

基于获自GenBank数据库的人14号染色体的长臂远侧区的核苷酸序列(编号AB019437)，设计了用于插入ploxpPGK-14qtel载体的两个靶序列。通过PCR扩增端粒侧靶序列(总共约9.5kb)，同时用A9/#14基因组作为模板分成4个片段，将产物克隆到pUC18中，通过用限制酶消化，切割5’和3’靶序列片段。

通过LA-PCR扩增0kb-2.9kb(包含5’末端的SalI位点和3’末端的BamHI位点)的片段(i)，用SalI和BamHI限制酶消化，然后导入pUC18的SalI-BamHI位点。用于通过PCR对其进行扩增的寡核苷酸引物的序列如下所示。

AB019437 0 kb Fw(SalI)：5′-GCGTCGACGCAAGCTTAAATAGTGTTGC(SEQ ID NO：35)

AB019437 2.9 kb Rv：5′-GAGCCAACCAAAGTGGAGAA(SEQ ID NO：36)

通过LA-PCR扩增2.3kb-5.4kb(包含5’末端的BamHI位点和3’末端的AccI位点)的片段(ii)，用BamHI和AccI限制酶消化，然后导入pBluescript的BamHI-AccI位点。用于通过PCR对其进行扩增的寡核苷酸引物的序列如下所示。

AB019437 2.3 kb Fw：5′-TCACCATGTTGACCAGGCTA(SEQ ID NO：37)

A1019437 5.4 kb Rv：5′-AGCTCGAGAGGCACTGAATC(SEQ ID NO：38)

通过LA-PCR扩增4.5kb-6.7kb(包含5’末端的AccI位点和3’末端的KpnI位点)的片段(iii)，用AccI和KpnI限制酶消化，然后导入包含片段(ii)的pBluescript的AccI-KpnI位点。用于通过PCR对其进行扩增的寡核苷酸引物的序列如下所示。

AB019437 4.5 kb Fw：5′-AGGGTCTTCAAAATGCCTGA(SEQ ID NO：39)

IGHV7-81Fw        ：5′-GCCATGTCCTCAGCCTTTAG(SEQ ID NO：40)

通过LA-PCR扩增6.3kb-9.5kb(包含5’末端的KpnI位点和3’末端的EcoRI位点)的片段(iv)，用KpnI和EcoRI限制酶消化，然后导入包含片段(i)的pUC18的KpnI-EcoRI。用于通过PCR对其进行扩增的寡核苷酸引物的序列如下所示。

IGHV7-81Rv：5′-CTGGAGCATCCTCTTCTTGG(SEQ IDNO：41)

AB019437 9.5 kb Rv(EcoRI)：

5′-CGGAATTCCGGGAGTGGGTGGCATAAAC(SEQ ID NO：42)

用BamHI和KpnI限制酶消化包含片段(ii)和(iii)的pBluescript，并且导入包含片段(i)和(iv)的pUC18的BamHI-KpnI位点，然后克隆端粒侧靶序列(总共约9.5kb)。根据实施例1(1-1)的方法进行PCR，将携带人14号染色体的小鼠杂交细胞(A9c11-14chr)的基因组DNA用作模板，使用上述引物和LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，反应在94℃下进行1分钟，然后是30个循环的94℃下变性30秒、60℃下退火30秒和72℃下延伸3分钟，并且72℃下延伸10分钟。

通过用SphI限制酶消化而使含有上述端粒侧靶序列(总共约9.5kb)的pUC18线性化，从而将4.4kb的5’区(端粒侧)克隆到ploxPupBSD-PGK载体的KpnI-ApaI位点，添加KpnI-SphI接头，并且用KpnI和ApaI限制酶消化，然后纯化。KpnI-SphI接头的序列如下所示。

KS接头S：5′-[Phosp]CCCGCATG(SEQ ID NO：43)

KS接头AS：5′-[Phosp]CGGGGTAC(SEQ ID NO：44)

通过用EcoRI消化从含有端粒侧靶序列(总共约9.5kb)的pUC18切下4.0kb的3’区(着丝粒侧)，亚克隆到pBluescript的EcoRI位点中，用HindIII限制酶消化，平端化，进一步用BamHI限制酶消化，纯化，然后克隆到含4.4kb的5’区(端粒侧)的ploxPupBSD-PGK载体的NheI-EcoRV位点中。最终的ploxpPGK-14qtel构建体的大小是约15.7kb。图22显示ploxpPGK-14qtel载体，图23显示靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因。

(1-2)导入用于将loxP序列插入携带人14号染色体的DT40细胞的长臂端粒远侧区的ploxpPGK-14qtel载体

通过根据实施例1(1-2)的方法用SrfI限制酶消化，将ploxpPGK-14qtel构建体转化为线性化的DNA。将构建体导入携带人14号染色体的DT40(#14)2-4杂交细胞。用杀稻瘟素(终浓度：8ug/ml)进行选择培养，此后使药物抗性集落发展2-3周。分离通过两次转染操作获得的总共480个杀稻瘟素抗性集落，生长，然后进行随后的分析。

(1-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，根据实施例6(1-1)的方法通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。通过将这两个靶序列(在图23中标为“5’基因组”和“3’基因组”)夹心，分别在染色体和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置在图24中用箭头表示。序列如下所示。

#14qtel 550F：5′-CATTCATGGTAGTCATTGGTGCTGTTCTCC(SEQ IDNO：45)

PGK longRv1：5′-ACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTG(SEQID NO：46)

Bsd longRv2：5′-AGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCC(SEQ IDNO：47)

#14qtel 9640R：5′-TATGGAAATCTGAGATGTGCCCAGCCTCAG(SEQID NO：48)

从上述480个杀稻瘟素抗性株中，在3个株中观察到了两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。

(1-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。在同源重组的两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)外指定探针(IGH5’和IGH3’)(图23)。为了制备探针，用下文显示的寡核苷酸引物对，和作为模板的、携带人14号染色体的A9c11-14chr细胞的基因组DNA进行PCR，分离产物，并且纯化。

-14qtel 5′探针1Fw：5’-GTGGGTCCTGAGGAGAACAA(SEQ ID NO：49)

-14qtel 5′探针1Rv：5’-TTCTTCTCACCTCCATTGGC(SEQ ID NO：50)

-14qtel 3′探针1Fw：5’-CCTAAAGCACATACAGCAGC(SEQ ID NO：51)

-14qtel 3′探针1Rv：5’-TCTCCAGGGGAAATCCAATC(SEQ ID NO：52)

用限制酶BstEII(5’侧)或BamHI(3’侧)(Roche)消化从通过初次筛选获得的3个株提取的约5μg基因组DNA，通过Ausubel et al.(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。通过Typhoon9210图像分析仪(MolecularDynamics)检测与标记的探针杂交的信号。代表性的结果示于图25。对于5’靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是14.0kb，以野生型(即非重组)形式是10.6kb。对于3’靶序列，所述长度以同源重组体的形式是7.4kb，以野生型(即非重组)形式是9.0kb。从3个候选株鉴定了总共两株同源重组体(24G8和24G94)。

(2)将loxP序列插入人14号染色体的着丝粒长臂近侧区

(2-1)构建用于将loxP序列插入人14号染色体的着丝粒长臂近侧区的ploxPHYGOR/n1载体

作为用于插入loxP序列的载体(即导向载体)，通过将FseI^*(用于消除FseI位点的序列)-PmlI-PacI-SrfI-FseI接头插入ploxPdownPURO(WO 00/10383)的FseI位点而制备ploxPdownPURO-HYG。FseI^*-PmlI-PacI-SrfI-FseI接头的核苷酸序列如下所示。

Loxpdownhyg fseI S：5′-CCCACGTGTTAATTAAGCCCGGGCATCCGG(SEQ ID NO：53)

Loxpdownhyg fseI AS：5′-ATGCCCGGGCTTAATTAACACGTGGGCCGG(SEQ ID NO：54)

基于获自GenBank数据库的人14号染色体的长臂远侧区的核苷酸序列(编号AL391156)，设计了用于插入ploxPHYGOR/n1载体的两个靶序列。用于通过PCR对其进行扩增的、包含添加的限制酶识别位点的寡核苷酸引物的序列如下所示。

对于5’靶序列：

49050F2longSalI：

5′-GACAGTGTCGACAGTGAGACTTGTAGGCTACAAGAAAAGG(SEQID NO：55)

53978R2long2SalI：

5′-GACAGTGTCGACTCTGATAATGCGGAATGAGTAGGGAGGC(SEQID NO：56)

对于3’靶序列：

54023FlongFseI：

5′-AGGCCGGCCGTTGGTAAAGATTGCTACACTTACGGCA(SEQ IDNO：57)

56084RlongPacI：

5′-CTTAATTAACAAGAGCTCTACAACTGTCCATCGAAAC(SEQ IDNO：58)

根据实施例1(1-1)的方法，携带人14号染色体的小鼠A9杂交细胞(A9c11-14chr)的基因组DNA用作模板，并且用上述引物通过PCR扩增用于重组的两个靶序列，即5’靶序列和3’靶序列。使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)。5’靶序列在94℃下进行反应1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸10分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸10分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸10分钟，并且72℃下延伸10分钟。3’靶序列在94℃下进行反应1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸6分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸6分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸6分钟，并且70℃下延伸10分钟。用FseI和PacI消化3’靶序列的2.0-kb扩增产物，然后克隆到ploxPdownPURO-HYG载体的FseI-PacI位点。同样，用SalI限制酶消化5’靶序列的5.0-kb扩增产物，然后克隆到包含前述2.0-kb靶序列的ploxPdownPURO-HYG载体的SalI位点中。最终的ploxPHYGOR/n1构建体的大小是大约16.1kb。图26显示了ploxPHYGOR/n1载体，图27显示了靶序列和由同源重组得到的等位基因。

(2-2)导入用于将着丝粒长臂近侧区的loxP序列插入携带已经导入了ploxpPGK-14qtel的人14号染色体的DT细胞中的ploxPHYGOR/n1载体

根据实施例1(1-2)的方法，通过用SrfI限制酶消化，将ploxPHYGOR/n1构建体转化为线性化的DNA，并且将产物导入携带人14号染色体的DT杂交细胞24G8和24G94，所述人14号染色体中已经导入了实施例7(1-4)中制备的ploxpPGK-14qtel。用嘌呤霉素(终浓度：0.3ug/ml)进行选择培养，此后使药物抗性集落发展2-3周。通过6次转染操作分离总共230个嘌呤霉素抗性集落(50个来源于24G8的集落和180个来源于24G94的集落)，生长，然后进行随后的分析。

(2-3)PCR分析

将嘌呤霉素抗性株的基因组DNA用作模板，根据实施例6(2-1)的方法，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。通过将这两个靶序列夹心(在图27中表示为5’基因组和3’基因组)，分别在染色体上和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置由图28中的箭头指出。序列如下所示。

AL39 48691F：5′-GCAGTGACAGAAGTCCATGTTGAACTGTAC(SEQ IDNO：59)

Puro275R：5′-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT(SEQ ID NO：60)

HygpAF1：5′-CGTCTGTGGCTGCCAAACAC(SEQ ID NO：61)

AL39 56194R：5′-TAGTCTCTCTGGATGAATATCAGCAAAACT(SEQ IDNO：62)

从上述230个杀稻瘟素抗性株(14个来源于24G8的株和20个来源于24G94的株)中，在34个株中观察到了两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。

(2-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。在同源重组的两个靶序列外指定探针(即5’靶序列和3’靶序列；N5’(i)和N3’(i))(图27)。为了制备探针，用下文显示的寡核苷酸引物对，和作为模板的、携带人14号染色体的A9c11-14chr细胞的基因组DNA进行PCR，分离产物，并且纯化。

AL39 46181F：5’-AAGACACCAGGGAGTAACCT(SEQ ID NO：63)

AL39 46778R：5’-GCTGAACCACTAAGGGTGAC(SEQ ID NO：64)

AL39 56451F：5’-GGAATAGGGATTAGGAAATG(SEQ ID NO：65)

AL39 57026R：5’-ACATGAGGTTTATTTGGTGG(SEQ ID NO：66)

用StuI限制酶(Roche)消化从通过初次筛选获得的34个株提取的基因组DNA(约5μg)，以与实施例6(1-4)相同的方式分析。代表性的结果示于图29。对于5’靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是12.5kb，以野生型(即非重组)形式是18.2kb。对于3’靶序列，所述长度以同源重组体的形式是10.2kb，以野生型(即非重组)形式是18.2kb。从34个候选株鉴定了总共22株同源重组体(14个来源于24G8的株和8个来源于24G94的株)。其中，对来源于24G8的克隆24G8n7和来源于24G94的克隆24G94n18和24G94n56进行随后的步骤(3)。

(3)通过Cre-loxP定点重组去除长臂远侧区

(3-1)将Cre表达载体导入携带已经在长臂远侧区和近侧区导入了loxP序列的人14号染色体的DT40杂交细胞

根据实施例1(1-2)的方法，将Cre表达载体pCAGGS-Cre导入在实施例6(2)中获得的24G8n7、24G94n18和24G94n56细胞。用潮霉素(终浓度：1.25mg/ml)进行选择培养，此后使药物抗性集落发展2-3周。

在24G8n7细胞中，分离了通过2次转染操作获得的总共54个潮霉素抗性集落，生长，然后进行随后的分析。在24G94n18和24G94n56细胞中，将10个集落聚集成合并物，生长20个合并物，然后进行随后的分析。

(3-2)PCR分析

将潮霉素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR证实两个loxP序列之间的缺失。通过夹心长臂远侧区缺失后保留的loxP序列，分别在染色体上和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置由图30A中的箭头指出。序列如下所示。

B.D PGK Fw1：5′-GGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTC(SEQ ID NO：67)

B.D Hyg Rv1：5′-ATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTG(SEQ ID NO：68)

使用Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，反应在94℃下进行1分钟，然后是35个循环的94℃下变性15秒，60℃下退火30秒，和72℃下延伸1分钟。当通过去除loxP序列之间的区域除去长臂远侧区时，推导约0.8kb的扩增。在54个来源于24G8n7细胞的潮霉素抗性株中的16个株和20个来源于24G94n18和24G94n56细胞的合并物中的每一个中，随后观察到了推导的扩增产物。

(3-3)DNA印迹分析

进行DNA印迹分析，以证实和选择长臂远侧区缺失的结构。靶序列的位置、染色体等位基因、由长臂远侧区的缺失得到的探针示于图30A和图30B。在同源重组的两个靶序列外指定探针(即5’靶序列和3’靶序列；N5’(i)和N3’(i))。

按照与实施例6(1-4)相同的方式，从通过初次筛选获得的16个来源于24G8n7细胞的株、20个来源于24G94n18细胞的细胞合并物和10个来源于24G94n56细胞的细胞合并物提取基因组DNA。用BstEII(5’侧)和StuI(3’侧)进行限制酶(Roche)消化。代表性的结果示于图31。对于5’靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是7.6kb，以野生型(即非重组)形式是14.0kb。对于3’靶序列，所述长度以同源重组体的形式是8.3kb，以野生型(即非重组)形式是10.2kb。结果，在12个来源于24G8n7细胞的株和10个来源于24G94n56细胞的细胞合并物中观察到长臂远侧区缺失的染色体。

(3-4)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)描述的方法进行FISH分析。人特异性Cot1(Invitrogen)和通过用HindII限制酶消化、切割和纯化而从实施例6(1-1)中制备的ploxpPGK-14qtel载体制备的约4.2kb的5’靶序列片段用作探针。分析来源于获自上述(3-3)的24G8n7细胞的4个克隆(即G8n7Δc2，c5，d1和d4)和来源于24G94n56细胞的4个细胞合并物(即G94n56Δp21，p25，p28和p30)。结果，发现所有的克隆都是正常核型，并且在大多数观察的有丝分裂象中检测到了Cotl染色的信号和位于缩短的长臂末端的两个信号。代表性的FISH图示于图32A和32B中。

(3-1)-(3-4)的实验证明获得的潮霉素抗性DT40杂交细胞携带长臂远侧区缺失的人14号染色体片段(14NΔqHAC)，同时保留了端粒序列。

(4)将克隆位点导入14NΔqHAC的长臂近侧区

(4-1)构建用于插入loxP和3’neo序列的pSF(G+n1)载体

作为用于将loxP和3’neo序列插入实施例6(3)制备的人类人工染色体(HAC)的基础质粒，使用实施例1(2-1)制备的pSF1③。基于用于获自实施例7(1-1)的ploxpPGK-14qtel载体的序列设计将插入loxP和3’neo的同源重组的5’靶序列。基于获自GenBank数据库的人14号染色体的长臂近侧区的核苷酸序列(编号AL391156)设计3’靶序列。用于通过PCR对其进行扩增的寡核苷酸引物的序列如下所示。

54023Flong2FseI：

5′-GATGGCCGGCCTGGTTGGTAAAGATTGCTACACTTACGGCA(SEQID NO：69)

58830RlongSrfI：

5′-GATGCCCGGGCCAATAGCCAGTCAATCGAGAAACCAAGCCC(SEQ ID NO：70)

通过用XbaI和SnaBI(Roche)消化从ploxpPGK-14qtel载体切下5’靶序列，通过琼脂糖凝胶电泳分离和纯化，然后克隆到pSF1③质粒的NheI-SalII位点。采用从携带人14号染色体的A9c11-14chr细胞提取的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增3’靶序列。用FseI限制酶(Roche)消化约5.0kb的该DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离和纯化，然后克隆到已经插入了5’靶序列的pSF1③质粒的FseI位点。最终的pSF1(G+n1)构建体的大小是约15.0kb。导向载体如图33所示，靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因如图34A所示。

(4-2)将pSF(G+n1)载体导入携带14NΔqHAC的DT40细胞

通过用SrfI限制酶(Roche)消化，将pSF(G+n1)构建体线性化，然后导入6种类型的DT杂交细胞(G94n56Δp21/p25/p28/p30，G8n7Δc2/c5)，所述细胞包含长臂远侧区缺失的14NΔqHAC。该方法根据实施例1(2-2)进行。此后使杀稻瘟素抗性集落发展2-3周。分离通过2次转染操作获得的总共321个药物抗性G94n56Δp21/p25/p28/p30集落(117，153，46和7个集落)，并且分离通过单次转染操作获得的总共191个G8n7Δc2/c5药物抗性集落(96和95个集落)，进行随后的分析。

(4-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。通过将这两个靶序列夹心(在图34中表示为5’基因组和3’基因组)，分别在染色体上和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置由图34中的箭头指出。序列如下所示。

550F：5’-CATTCATGGTAGTCATTGGTGCTGTTCTCC(SEQ ID NO：71)

ApaIlongFw1：5’-CACAGCAACCACAGTGCTTCTTGATGAG(SEQ IDNO：72)

ApaIlongRv1：5’-TCCAGAAGTGTTGGTAAACAGCCCACAA(SEQ IDNO：73)

58950R：5’-AAGCAGAGCTACCATGCACTGTAGGATAAG(SEQ ID NO：74)

使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，PCR溶液包含MgSO₄(终浓度：0.5mM)。反应在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸8分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸8分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸8分钟，并且在72℃下延伸10分钟。

在获得的杀稻瘟素抗性株中，发现12个株(总共7个株；即2个来源于G94n56Δp21，1个来源于p25，2个来源于p28，和2个来源于p30的株；和总共5个株(1个来源于G8n7Δc2和4个来源于c5的株)产生从核苷酸序列推导的大小的扩增产物(即5’基因组序列：约4.5kb；3’基因组序列：约5.0kb)。

(4-4)DNA印迹分析

进行了DNA印迹分析以选择同源重组体。在同源重组的靶序列外指定探针IGH5’(i)(实施例6(1-4))，并且在3’靶序列外指定探针N3’(ii)(图34)。为了制备探针N3’(ii)，用下文显示的寡核苷酸引物对，和作为模板的、携带人14号染色体的A9c11-14chr细胞的基因组DNA进行PCR，分离产物，并且纯化。

AL39 60781F：5’-TCAAGGACTGTGAGCCTCCT(SEQ ID NO：75)

AL39 61387R：5’-TGCACTGAAAGCCAATTGAA(SEQ ID NO：76)

用BstEII限制酶(Roche)消化从通过初次筛选获得的12个株提取的基因组DNA(约5μg)，通过Ausubel et al.(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。通过Typhoon9210图像分析仪(Molecular Dynamics)检测与³²P-标记的探针杂交的信号。代表性的结果示于图35。作为5’基因组分析的结果，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是19.8kb，以野生型(即非重组)形式是7.6kb。作为3’基因组分析的结果，所述长度以同源重组体的形式是19.8kb，以野生型(即非重组)形式是8.8kb。在12个候选杀稻瘟素抗性株中鉴定了总共5株同源重组体。

通过上述实验(4-1)-(4-4)，获得了5株DT40杂交细胞(即G94n56Δp21S39，G94n56Δp25S61，G94n56Δp28S7，8，G8n7Δc2S202和G8n7Δc5S90)，其携带已经通过同源重组插入了克隆位点(即loxP和3’neo序列)的14NΔqHAC载体。其中，对4株，即G94n56Δp21S39，G94n56Δp25S61，G8n7Δc2S202和G8n7Δc5S90(下文分别缩写为G4S39，G4S61，G8S202和G8S90)进行了随后的步骤。

(5)将14NΔqHAC载体导入CHO细胞

(5-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将14NΔqHAC载体导入CHO细胞

作为染色体供体细胞，使用实施例6(4)获得的携带14NΔqHAC载体的DT40杂交细胞(G4S39，G4S61，G8S202和G8S90)，所述载体去除了长臂远侧区，在其中插入了克隆位点(loxP序列和3’neo序列)。作为染色体受体细胞，使用来源于中国仓鼠的CHO-K1细胞(编号JCRB9018)。使用根据实施例1(3-1)的方法。选择培养进行约2周后，分离发展的杀稻瘟素抗性集落，进行随后的分析。通过8次微核细胞融合操作(对G4S39两次，对G4S61两次，对G8S202两次，对G8S90两次)获得总共92个杀稻瘟素抗性CHO株(19个来源于G4S61的株，23个来源于G4S39的株，22个来源于G8S90的株，和28个来源于G8S202的株)。

(5-2)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。采用根据实施例6(4-3)的方法。为了检查DT40细胞的导入，基于获自GenBank数据库的鸡β-肌动蛋白基因(编号X00182)的核苷酸序列设计鸡β-肌动蛋白检测引物。用于通过PCR对其进行扩增的寡核苷酸引物的序列如下所示。

Ggbeta-actin1933F：5’-TCCGTTGGAGTTGATCCTTC(SEQ ID NO：77)

Ggbeta-actin2536R：5’-ACATGACACAGCAAGGAACG(SEQ ID NO：78)

使用Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，反应在94℃下进行1分钟，然后是35个循环的94℃下变性15秒，56℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒。在获得的杀稻瘟素抗性CHO细胞中，在67个株(15个来源于G4S61的株，23个来源于G4S39的株，20个来源于G8S90的株，和9个来源于G8S202的株)中观察到了具有从核苷酸序列推导的大小的扩增产物(5’基因组：约4.5kb；3’基因组：约5.0kb)，并且没有观察到DT40细胞的导入。

(5-3)DNA印迹分析

以与实施例6(4-4)相同的方式进行DNA印迹分析，以检查导入的14NΔqHAC载体的结构。代表性的结果示于图36中。作为5’基因组分析的结果，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是19.8kb，以野生型(即非重组)形式是7.6kb。作为3’基因组分析的结果，所述长度以同源重组体的形式是19.8kb，以野生型(即非重组)形式是8.8kb。从74个候选杀稻瘟素抗性株(即14个来源于G4S61的株，16个来源于G4S39的株，20个来源于G8S90的株，和24个来源于G8S202的株)中鉴定了总共52个同源重组体(即14个来源于G4S61的株，16个来源于G4S39的株，15个来源于G8S90的株，和7个来源于G8S202的株)。

(5-4)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)描述的方法进行FISH分析。分析了杀稻瘟素抗性CHO株中的23个株(即7个来源于G4S61的株，11个来源于G4S39的株，1个来源于G8S90的株，和4个来源于G8S202的株)。结果，发现总共9个株(G4S61-1，6，8，9，11，12，G4S39-13，G8S90-2，4)具有正常核型并且在大多数观察的有丝分裂象中检测到了Cot1染色的14NΔqHAC载体的拷贝。代表性的FISH图和14NΔqHAC载体的核型示于图37A和37B中。

实验(5-1)-(5-4)证明得到的9个杀稻瘟素抗性CHO株携带14NΔqHAC载体。

实施例7

(7-1)分析14NΔqHAC载体在CHO细胞中的长期稳定性

(1)在非选择性培养条件下长期传代培养

为了证实14NΔqHAC载体在CHO杂交细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例6中描述的携带14NΔqHAC载体的两个CHO株(G4S39-13和G4S61-1)。非选择培养基是含有10％ FBS的F12培养基，选择培养基含有所述F12培养基和以8μg/ml添加的杀稻瘟素。将5.0×10⁵个CHO细胞铺于10-cm培养皿中，对已经培养至约80-90％汇合的细胞密度的细胞进行计数，将5.0×10⁵个细胞再次铺板在10-cm培养皿中，传代培养继续进行直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。第10次传代后回收CHO株，制备FISH染色体样品。

(2)FISH分析

用人特异性Cot1探针(Invitrogen)，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。以双份测量群体倍增水平和HAC保留，确定平均值。关于这两个株的结果示于表3和图13。在图13中，结果在＂14ΔqHAC(G)＂项中显示。

表3：14NΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性

 

HAC细胞群传代培养次数HAC保留(％)无药物选择    有药物选择12G4S39-1312G4S61-1培养开始时10次传代培养开始时10次传代-             9699            99-             9896            98

14NΔqHAC载体到第10次传代结束时在CHO细胞中稳定保留。作为中期染色体图的观察结果，每个细胞检测到1或2个信号。

实验(1)和(2)证明14NΔqHAC载体可以在非选择性培养条件下在CHO细胞中稳定保留，并且可以保持每个细胞的拷贝数。

(7-2)通过移植携带导入了EPO的14AΔqHAC载体的CHO细胞导致的体内EPO效力

将实施例3制备的携带导入了EPO的14AΔqHAC载体的CHO细胞的t7S38-8E5克隆密封在免疫细胞封闭胶囊中，将产物皮下移植到由于B细胞缺陷而不能产生抗体的Igμ-/-敲除小鼠(Tomizuka，K.，et al.，PNAS，97，722-727，2000)中，分析外周血的红细胞计数、血红蛋白水平和血细胞比容值。这样，评估从t7S38-8E5细胞体内提供的EPO的效力。如果上述3个值与移植了细胞胶囊的组的值相比升高，可以认可EPO的效力。

根据实施例3的方法培养携带导入了EPO的14AΔqHAC载体的CHO细胞的t7S38-8E5克隆，根据包含的方案，将1 x 10⁶个细胞密封在免疫细胞封闭胶囊，即具有40μl容量的TheraCyte免疫分离装置(TheraCyte Inc.，Irvine，CA)中。在阿佛丁麻醉下经过左背部将胶囊皮下移植到Igμ-/-敲除小鼠中，随时间从眼眶取血，用ADVIA120(Bayermedical)测量外周血的红细胞计数、血红蛋白水平和血细胞比容值。作为对照组，分析了进行了手术而没有移植胶囊的组。结果示于图87。

从移植后2周开始，移植了细胞胶囊的组中的红细胞计数、血红蛋白水平和血细胞比容值开始升高，升高的值维持直到第44周。这样，通过移植携带EPO-14AHAC的CHO细胞证明了体内长期EPO效力。

(7-3)通过移植携带导入了EPO的14HAC载体的人正常成纤维细胞导致的体内EPO效力

将选自携带实施例19中制备的导入了EPO的14AΔqΔneoHAC载体的人正常成纤维细胞，即HFL-1细胞的tΔ63H克隆的tΔ63H15，或以与tΔ63H15的情况下相同的方式制备的HFL-1细胞的tΔ47H27、30和37克隆密封在免疫细胞封闭胶囊中，皮下移植到由于B细胞缺陷而不能产生抗体的Igμ-/-敲除小鼠中，分析外周血的红细胞计数、血红蛋白水平和血细胞比容值。这样，评估从HFL-1克隆提供的EPO的体内效力。如果与对照组相比，移植了细胞胶囊的组的这三个值升高，可以认可EPO效力。

根据实施例19的方法培养携带导入了EPO的14-HAC的HFL-1细胞的tΔ63H15或tΔ47H27、30或37克隆，根据包含的方案，将10⁶个细胞密封在免疫细胞封闭胶囊，即具有40μl容量的TheraCyte免疫分离装置(TheraCyte Inc.，Irvine，CA)中。通过将用于硅密封的适配器封固于1-ml注射器(Telmo)而包封细胞和珠子，将产物连接于胶囊口(即入口)，并且将产物导入胶囊。在6.5％ CO₂存在下37℃下用DMEM-20％FBS培养基在6孔板上将胶囊培养2-6周，在移植前两天和移植当天用人bFGF(0或10ng/ml)更换培养基，进一步进行培养。以与(7-2)相同的方式，在左背部将胶囊皮下移植到Igμ-/-敲除小鼠中，随时间从眼眶取血，以便用ADVIA120(Bio Medical)测量红细胞计数、血红蛋白水平和血细胞比容值。

这样，通过移植携带EPO-14HAC的人正常成纤维细胞，可以实现长期的EPO体内效力。

(7-4)14HAC载体传递到小鼠后代

为了检验14HAC载体的体内稳定性及其向后代的传递，制备导入了EGFP的14HAC载体，通过微细胞介导的染色体转移方法将产物导入小鼠ES细胞中，制备嵌合小鼠，并且进行杂交，以分析小鼠体细胞中的HAC保留。

(1)构建EGFP-14HAC载体

制备包含CAG启动子控制下的EGFP基因的pLN1-IRES-EGFP质粒，通过CHO细胞中的Cre-loxP系统将EGFP基因表达单位导入14AΔq-HAC和14NΔq-HAC载体。

(1-1)制备EGFP表达质粒pLN1-IRES-EGFP

为了制备pLN1-IRES-EGFP，以两步制备pLN1-PGK-EGFP。在步骤1中，用PGK启动子替代pLN1-EPO(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)的CMV-5’neo区中的CMV启动子，以制备pLN1-PGKEPO质粒，用SalI消化得到的质粒并且平端化，然后通过用EcoRI消化除去EPO表达单位。用AflII消化pEGFP-N1(Clontech)，平端化，进一步用EcoRI消化，以制备EGFP-Sv40polyA单位，将产物导入其中。在步骤2中，将通过用SalI和XbaI消化pCAGGS-Cre(Araki etal.，PNAS，92，160-164，1995)制备的早期CAG启动子，和通过用pCAGGS-Cre模板PCR扩增并且用XbaI和BamHI消化而制备的晚期CAG启动子同时导入在步骤1中用SalI和BamHI消化的区域。用于PCR的引物序列如下所示。

pCAGGSCre 2362F：5’-TTCGGCTTCTGGCGTGTGAC(SEQ ID NO：152)pCAG R1 BamHI：5’

-CGGGATCCCGTGGCGGCGGGTAATTCTTTGCCAAA(SEQ ID NO：153)

随后，制备pLN1-IRES-EGFP。用EcoRI和NcoI消化pLN1(Kakedaet al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)，除去CMV启动子和Sv40polyA。在该位点，同时导入通过用EcoRI和NotI消化pLN1-PGK-EGFP制备的含CAG启动子和EGFP的片段，和通过用NotII和NcoI消化采用来源于pcDNA3.0(Invitrogen)的IRES序列为模板经PCR扩增的DNA片段而制备的IRES片段。用于PCR的引物序列如下所示。

EGFP-IRESFw1：5’

-AAGCGGCCGCGACTCTAGGGATCCGCCCTCTCCCTCCC(SEQ IDNO：154)

FGFP-IRESRv1：5’-GACACCATGGTTGTGGCCATATTATCATCGTG(SEQ ID NO：155)

最终的pLN1-IRES-EGFP构建体的大小是约5.7kb。

(1-2)将EGFP基因表达单位导入14AΔqHAC载体

将包含EGFP序列的EGFP基因表达单位插入14AΔqHAC和14NΔqHAC载体。制备包含loxP序列的EGFP表达质粒pLN1-IRES-EGFP，并且瞬时表达Cre重组酶以便通过loxP序列之间的定点重组将基因表达单位插入人工染色体。用G418抗性的获得(即启动子-片段化的新霉素抗性基因表达单位的重建)作为指示物选择包含插入序列的重组体。根据实施例3或8的方法使用和分析携带14AΔqHAC载体的CHO细胞t7S38-6和携带14NΔqHAC载体的CHO细胞G4S39-13(实施例8)。此后使G418集落发展2-3周，分离总共80个集落(40个来源于1t7S38-6的集落和40个来源于G4S39-13的集落)，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(1-3)PCR分析

使用EGFP374F和Neo Rp2引物，通过PCR扩增来检查所述表达单位是否插入到14AΔq-HAC和14NΔq-HAC载体的loxP序列的位点中，从而选择插入了EGFP基因表达单位的重组体，所述引物是在pLN1-IRES-EGFP载体和14AΔqHAC以及14NΔq-HAC载体上设计的，以夹心loxP序列的位点。概要示于图88。

EGFP 374F：5’-GCATCGACTTCAAGGAGGAC(SEQ ID NO：156)

Neo Rp2：5’-CCTGCAGTTCATTCAGGG(SEQ ID NO：157)

在包含插入序列的重组体的情况下，用EGFP 374F和Neo Rp2引物推导约1.2kbp的扩增。作为结果，在上文(1-2)中获得的G418抗性CHO杂交细胞中的总共80株(即40个来源于t7S38-6的株和40个来源于G4S39-13株)中观察到了推导的扩增。因此，证实这80株G418抗性CHO杂交细胞是包含插入loxP序列中的EGFP基因表达单位的重组体。

(1-4)DNA印迹分析

为了检查EGFP-14AΔq-HAC和EGFP-14NΔq-HAC载体是否合适地包含EGFP表达单位，进行DNA印迹分析。根据Kakeda et al.(GeneTherapy；12：852-856，2005)进行该方法。通过PCR扩增EGFP编码区中核苷酸78-395的318bp的区域，制备探针。使用的引物序列如下所示。

EGFP-78F：ACGTAAACGGCCACAAGTTC(SEQ ID NO：158)

EGFP-395R：GTCCTCCTTGAAGTCGATGC(SEQ ID NO：159)

从核苷酸序列推导的由EcoRI消化得到的限制酶片段的长度是7.5kb，包括EGFP表达单位。概要示于图89。

在上文(1-3)中获得的80株候选G418抗性CHO杂交细胞中的总共70株(即34个来源于t7S38-6的株和36个来源于G4S39-13株)中观察到了具有推导的大小的条带。

(1-5)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法，用人特异性Cot1(Invitrogen)探针进行FISH分析。在上文(1-4)中获得的G418抗性CHO杂交细胞中，对15株(即8个来源于t7S38-6的株和7个来源于G4S39-13株)进行分析。结果，在总共11株(即6个来源于t7S38-6的株：t6EGI-2、6、9、11、24和30：和5个来源于G4S39-13株：G13EGI-1、5、15、17和20)的大多数观察到的有丝分裂象中观察到了正常核型和Cot1染色的EGFP-14AΔqHAC和EGFP-14NΔq-HAC载体的拷贝。

实验(1-1)-(1-5)证明了获得的11个G418抗性株是具有正常核型并且携带EGFP-14AΔq-HAC载体的CHO细胞(t6EGI-2、6、9、11、24和30)和具有正常核型并且携带EGFP-14NΔq-HAC载体的CHO细胞(G13EGI-1、5、15、17和20)。

(2)制备导入了EGFP-14AΔqHAC或EGFP-14NΔqHAC载体的小鼠ES细胞

(2-1)将EGFP-14HAC载体导入小鼠ES细胞TT2F

将上文(1)中制备的CHO克隆，即t6EGI-11，t6EGI-24，G13EGI-1和G13EGI-5(下文分别称作t11，t24，G1和G5)用作HAC供体细胞，并且通过微细胞介导的染色体转移方法(Tomizuka et al.，Nature Genetics，16，133-143，1997)将EGFP-14AΔq-HAC载体或EGFP-14NΔq-HAC载体导入小鼠ES细胞TT2F。结果，此后使G418抗性集落发展1-2周，分离总共12个集落，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(2-2)PCR分析

为了选择导入了EGFP-14AΔqHAC和EGFP-14NΔqHAC载体的克隆，根据(7-4)(1-3)的方法进行PCR分析。结果，在上文(2-1)分离的所有G418抗性小鼠ES杂交集落中观察到了推导的扩增。这样，证实了12株G418抗性小鼠ES杂交细胞携带EGFP-14AΔqHAC和EGFP-14NΔqHAC载体。

(2-3)DNA印迹分析

以与上文(7-4)(1-4)相同的方式进行DNA印迹分析，以检查EGFP-14AΔq-HAC和EGFP-14NΔq-HAC载体是否合适地包含EGFP表达单位。结果，在上文(2-2)中获得的12株候选G418抗性小鼠ES杂交株中的总共11株中观察到了具有推导的大小的条带。

(2-4)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法，用人特异性Cot1(Invitrogen)探针进行FISH分析。在上文(1-4)中获得的G418抗性小鼠ES杂交细胞中，对8株(1-t11，2-t11，3-t11，4-t11，32-G1，33-t24，34-t24和35-t24)进行分析。结果，在总共6株的大多数观察到的有丝分裂象中检测到了正常核型和Cot1染色的EGFP-14AΔqHAC和EGFP-14NΔq-HAC载体的拷贝。

实验(2-1)-(2-4)证明了获得的5株G418抗性小鼠ES杂交细胞(1-t11，2-t11，3-t11，33-t24和34-t24)是携带EGFP-14AΔq-HAC和EGFP-14NΔq-HAC载体并且具有正常核型的小鼠ES细胞。

(3)嵌合小鼠中的14HAC载体保留

根据Tomizuka et al.(Nature Genetics，16，133-143，1997)的方法，用(2)中获得的携带EGFP-14HAC的G418抗性小鼠ES杂交细胞获得嵌合小鼠。为了证实嵌合小鼠携带14HAC载体，根据(7-4)(2-2)的方法，用下文所示的一组引物进行PCR分析(在图88中图示)。

着丝粒侧

(i)CR383659 CR38_73435F GCAAAACAATAACTGTTGTT(SEQ ID NO：160)

            CR38_74060R CATTTATCTTCTCTGGCTTA(SEQ ID NO：161)

(ii)AL512320 NEK2PFw           CAGCCAGTGTTTTCCTGGAT(SEQ ID NO：162)

             NEK2PRv           TCTTTGCTCTTCTGCAACCA(SEQ ID NO：163)

(iii)AL39 1156-1 AL39_56451F   GGAATAGGGATTAGGAAATG(SEQ ID NO：164)

                 AL39_57026R   ACATGAGGTTTATTTGGTGG(SEQ ID NO：165)

(iv)AL39 1156-2  AL39_46181F   AAGACACCAGGGAGTAACCT(SEQ ID NO：166)

                 AL39_46778R   GCTGAACCACTAAGGGTGAC(SEQ ID NO：167)

(v)AL39 5409 AL39_5409F        GCATGCCTTCAATGTGTGAC(SEQ ID NO：168)

             AL39_5811R        CAGCAGAGCCAAGATCCAGT(SEQ ID NO：169)

端粒侧

(i)ABO19437-1 IGHV3-79Fw       GTGCCCTCTGCTCTCAGACT(SEQ ID NO：170)

              IGHV3-79Rv       TGAGCTGGGTTTCACAGTTG(SEQ ID NO：171)

(ii)ABO19437-2 IGHV7-81Fw      GCCATGTCCTCAGCCTTTAG(SEQ ID NO：172)

               IGH7-81Rv       CTGGAGCATCCTCTTCTTGG(SEQ ID NO：173)

(iii)ABO19437-3 IGHVIII-82Fw   GGTCTTGTCCTTGGCTTTCA(SEQ ID NO：174)

                IGHIII-82Rv    ATGGAGTCAGAGGGGGAAAC(SEQ ID NO：175)

(iv)ABO19437-4 AB01_to1.5kbFw  GACCATGACCCCACCTCTAA(SEQ ID NO：176)

               AB01_Oto1.5kbRv GGTGGGATGGAAGAGTCAGA(SEQ ID NO：177)

结果，在得到的嵌合小鼠中观察到了推导的扩增。其概要示于图90。这样，发现嵌合小鼠的体细胞包含EGFP-14AΔq-HAC和EGFP-14NΔq-HAC载体。

(4)EGFP-14AΔq-HAC和EGFP-14NΔq-HAC载体传递到后代

使上文(3)中获得的嵌合小鼠(雌性)和C57BL6小鼠(雄性)进行杂交，以检查EGFP-14AΔqHAC和EGFP-14NΔqHAC载体向后代的传递。以与上文(7-4)(3)相同的方式进行PCR分析，用HAC保留作为指示物评价结果。结果，发现在46.6％(N＝133)的F1小鼠个体和36.9％(N＝84)的F2小鼠个体中，EGFP-14AΔqHAC载体进行了推导的扩增。同样，发现在59.4％(N＝79)的F1小鼠个体中，EGFP-14NΔqHAC载体进行了推导的扩增。这样，证实了EGFP-14AΔqHAC和EGFP-14NΔqHAC载体向后代的传递。

此外，使上文获得的携带EGFP-14AΔqHAC载体的F1小鼠(雄性)和(雌性)进行了杂交。对后代小鼠的尾成纤维细胞进行取样，培养，在Carnoy溶液中固定，然后根据Matsubara et al.(FISH ExperimentalProtocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)的方法，使用人特异性Cot1(Invitrogen)探针进行FISH分析。结果，发现了在尾成纤维细胞中携带2个拷贝的EGFP-14AΔqHAC载体的个体。

实施例8

分析包含hEPO-14NΔqHAC载体的CHO杂交细胞中的hEPO基因表达

(1)构建hEPO-14NΔqHAC载体

(1-1)将hEPO基因导入14NΔqHAC载体中

将hEPO基因表达单位插入实施例6中构建的14NΔqHAC载体中。制备含有loxP序列的hEPO表达质粒，瞬时表达Cre重组酶以便通过loxP序列之间的定点重组将基因表达单位插入人工染色体。用G418抗性的获得(即启动子-片段化的新霉素抗性基因表达单位的重建)作为指示物选择包含插入序列的重组体。使用实施例6制备的携带14NΔqHAC载体的CHO杂交细胞(G4S61-1，9，G4S39-13和G8S90-4)，以与实施例3(1-1)相同的方式插入hEPO基因表达单位。此后使G418抗性集落发展2-3周，分离总共246个集落(61个来源于G4S61-1的集落，75个来源于G4S61-9的集落，73个来源于G4S39-13的集落，和37个来源于G8S90-4的集落)，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(1-2)PCR分析

使用SVpANp1和Neo Rp2引物，通过PCR检查hEPO基因表达单位是否插入到14NΔqHAC载体的loxP序列的位点中，从而选择包含插入其中的hEPO基因表达单位的重组体，所述引物是在pLN1-EPO载体和14NΔqHAC载体上设计的，以夹心loxP序列的位点。同样，用pBS226质粒载体的M13RV和Neo Rp2引物通过PCR检查插入的hEPO基因的扩增，从而选择它。根据Kakeda et al.(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法确定引物序列和PCR条件。在包含插入序列的重组体的情况下，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，并且用M13RV和Neo Rp2引物推导约2.7kbp的扩增。作为结果，在上文(1-1)中获得的总共116株G418抗性CHO杂交细胞中观察到了推导的扩增(即31个来源于G4S61-1的株，34个来源于G4S61-9的株，35个来源于G4S39-13的株，和16个来源于G8S90-4的株)。因此，发现上述116株G418抗性CHO杂交细胞是包含插入loxP序列中的hEPO基因表达单位的重组体。

(1-3)DNA印迹分析

为了检查hEPO-14NΔqHAC载体是否合适地携带hEPO表达单位，进行DNA印迹分析。根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行该方法。代表性的结果示于图38中。由核苷酸序列推导的XbaI消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hEPO表达单位。在(1-2)中获得的130株(即36个来源于G4S61-1的株，40个来源于G4S61-9的株，35个来源于G4S39-13的株，和19个来源于G8S90-4的株)候选G418抗性CHO杂交细胞中的总共60株(即13个来源于G4S61-1的株，18个来源于G4S61-9的株，19个来源于G4S39-13的株，和10个来源于G8S90-4的株)中观察到了具有推导的大小的条带。

(1-4)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法，用人特异性Cot1(Invitrogen)探针进行FISH分析。对(1-3)中获得的23株G418抗性CHO杂交细胞进行分析。结果，在总共15株(下文分别称作G4S61-1E6，9，G4S61-9E28，34，35，65，G4S39-13E3，4，5，16，55，61，71，G8S90-4E16和18)的大多数观察到的有丝分裂象中观察到了正常核型和Cot1染色的hEPO-14NΔqHAC载体的拷贝。代表性的FISH图示于图39A，核型示于图39B和图41。在图41中，41，13E4，13E55，1E6和4E16分别代表G4S39-13E4，G4S39-13E56，G4S61-1E6和G8S90-4E16。

实验(1-1)-(1-4)证明了得到的15株G418抗性CHO杂交细胞是携带hEPO-14NΔqHAC载体并且具有正常核型的CHO细胞。

(2)插入14NΔqHAC载体中的hEPO基因的表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文(1-3)中分离的48株携带hEPO-14NΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞(即11个来源于G4S61-1的株，16个来源于G4S61-9的株，19个来源于G4S39-13的株，和5个来源于G8S90-4的株)以约10⁵个细胞的量铺板在12孔组织培养塑料培养皿(Falcon)上，该培养皿包含2ml F12培养基，所述培养基中含有10％ FBS和以0.8mg/ml添加的G418。培养的细胞达到汇合后，用2ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养进行2天，再次用1ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay，R&DSystems)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验结果的平均值示于图40。基于上述结果，在所有携带hEPO-14NΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞中观察到了hEPO表达。

实施例9

分析hEPO-14NΔqHAC载体在CHO细胞中的长期稳定性

(1)在非选择性培养条件下长期传代培养

为了证实hEPO-14NΔqHAC载体在CHO杂交细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例8中获得的4株CHO杂交细胞(G4S61-1E6，G4S39-13E4，55和G8S90-4E16)。非选择培养基是含有10％ FBS的F12培养基，选择培养基含有所述F12培养基和以0.8mg/ml添加到其中的G418。将5.0×10⁵个CHO细胞铺于10-cm培养皿中，对已经培养至约80-90％汇合的细胞密度的细胞进行计数，将5.0×10⁵个细胞再次铺板在10-cm培养皿中，传代培养继续进行直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。第10次传代后回收CHO细胞，进行hEPO基因表达分析和FISH分析。

(2)长期传代培养后的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。根据实施例8(2)的方法分析了G4S61-1E6，G4S39-13E4，55和G8S90-4E16株。以双份进行的实验的结果的平均值示于图41中。这样，在所有4株携带hEPO-14NΔqHAC载体的CHO杂交细胞中在长期传代培养后观察到了hEPO表达。

(3)FISH分析

用人特异性Cot1探针(Invitrogen)，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。以双份测量群体倍增水平和HAC保留，确定平均值。关于上述4株的结果示于表4和图41。

表4：hEPO-14NΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性

 

HAC细胞群传代培养次数        HAC保留(％)无药物选择     有药物选择G4S61-1E6G4S39-13E4G4S39-13E55G8S90-4E16培养开始时10次传代培养开始时10次传代培养开始时10次传代培养开始时10次传代-              9897.6           100-              10089.7           95.2-              10097             98.2-              9887.6           97.6

hEPO-14NΔqHAC载体到第10次传代结束时在CHO细胞中稳定保留。作为中期染色体图的观察结果，每个细胞检测到1或2个信号。

上述实验(1)-(3)证明hEPO-14NΔqHAC载体可以在非选择性培养条件下长期传代培养后在CHO细胞中稳定保留，可以保持每个细胞的拷贝数，并且可以保持hEPO基因表达。

实施例10

包含hEPO-14NΔqHAC载体的人正常成纤维细胞中的hEPO基因表达

(1)制备导入了hEPO-14NΔqHAC载体的人正常成纤维细胞

(1-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将hEPO-14NΔqHAC载体导入人正常成纤维细胞HFL-1

从实施例9获得的携带hEPO-14NΔqHAC载体的CHO细胞中选择具有形成微核的高能力的克隆(G4S61-1E6，G4S39-13E4，55和G8S90-4E16)，并且用作染色体供体细胞。作为染色体受体细胞，使用了人正常成纤维细胞HFL-1(获自RIKEN生物资源中心的细胞工程部门；编号RCB0521)。按照与实施例5(1)相同的方式进行微核细胞融合。选择培养进行约4周后，分离发展的药物抗性集落，然后进行随后的分析。作为32次微核细胞融合操作的结果(8次×4株)，获得了47个药物抗性集落。在上述集落中，用G4S61-1E6细胞作为染色体供体细胞获得的细胞在下文中称作G6H细胞，用G4S39-13E4细胞获得的细胞在下文中称作G4H细胞，用G4S39-13E55细胞获得的细胞在下文中称作G55H，用G8S90-4E16细胞获得的细胞在下文中称作G16H细胞。

(1-2)PCR分析

根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法，使用实施例3(1-2)的SVpANp1和Neo Rp2引物，和STS标记物，即D2S1334引物，通过PCR扩增检查人染色体是否携带hEPO-14NΔqHAC载体。同样，用CHO弗林蛋白酶基因特异性引物，即furin3’subF和furinEx6-28R，通过PCR扩增检查染色体供体CHO细胞的导入。采用根据实施例5(1-2)的方法。

当携带hEPO-14NΔqHAC载体的HFL-1细胞不包括染色体供体CHO细胞时，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，用D2S1334引物推导约0.6kbp的扩增，用furin3’subF和furinEx6-28R推导无扩增。结果，在来自上文(1-1)获得的47个杀稻瘟素抗性株的总共17个株(即2个G6H株，4个G4H株，6个G55H株，和5个G16H株)中观察到了推导的扩增。

这样，证实了上述17个杀稻瘟素抗性株是携带hEPO-14NΔqHAC载体的HFL-1细胞。

(1-3)DNA印迹分析

为了检查hEPO-14NΔqHAC载体是否合适地携带hEPO表达单位，对上述杀稻瘟素抗性株的13个株进行DNA印迹分析。该方法是根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行的。代表性的结果示于图19B。从核苷酸序列推导的由XbaI消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hEPO表达单位。结果，在上文(1-2)中获得的9株携带hEPO-14NΔqHAC载体的杀稻瘟素抗性株中观察到了具有推导的大小的条带。

(1-4)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。使用人14号染色体和人22号染色体特异性α-卫星DNA探针(Q-Biogene，Funakoshi)。作为杀稻瘟素抗性株中的3个株(G4H2，G16H17和G55H7)的分析结果，在总共3个株的大多数观察到的有丝分裂象中检测到了正常核型以及在来源于宿主细胞的一对人14号染色体和人22号染色体的着丝粒区的4个位点中和来源于14AΔqHAC载体拷贝的位点中的信号。结果示于图42A和图42B。

实验(1-1)-(1-4)证明了获得的3株杀稻瘟素抗性株是携带hEPO-14NΔqHAC载体并且具有正常核型的HFL-1细胞。

(2)携带hEPO-14NΔqHAC载体的HFL-1细胞中的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文(1)中分离的9株携带hEPO-14NΔqHAC载体的杀稻瘟素抗性HFL-1细胞(G4H2，4，5，G6H3，G16H17，21，23，G55H7和9)以各自约10⁵个细胞的量铺板在I型胶原包被的24孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养皿中包含1ml含有杀稻瘟素(3μg/ml)的选择培养基(含20％ FBS的DMEM培养基)。在培养的细胞达到汇合后，培养进行7天，用新鲜培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVDHuman EPO Immunoassay，R&D System)对培养上清液中的hEPO进行定量。其结果在图21中的＂14N-HAC＂项中显示。

因此，在所有携带hEPO-14NΔqHAC载体的HFL-1细胞中观察到了hEPO表达。

实施例11

用hEPO-14NΔqHAC载体在人成纤维细胞中长期表达EPO

(1)非选择性培养条件下的长期传代培养

为了证实hEPO-14NΔqHAC载体在人正常成纤维细胞HFL-1中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例10中获得的4株携带hEPO-14NΔqHAC载体的HFL-1细胞(G4H2，G16H17，G16H21和G55H7)。非选择培养基是含20％ FBS的DMEM，选择培养基含有所述DMEM培养基和以3μg/ml添加的杀稻瘟素。将携带hEPO-14NΔqHAC载体的HFL-1细胞以1-3×10⁵个细胞的量铺于I型胶原包被的T-25烧瓶(Falcon)中，将细胞培养至约90％汇合的细胞密度，再次铺板1-3×10⁵个细胞，传代培养继续直到第6-10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。在第5次传代前和后以及第10次传代后回收细胞，进行hEPO基因表达分析和FISH分析。

(2)长期传代培养后的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文(1)中进行了长期传代培养的4株携带hEPO-14NΔqHAC载体的HFL-1细胞以约10⁴个细胞的量铺板在I型胶原包被的24孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养皿中包含2ml含有20％ FBS的DMEM培养基。在培养的细胞达到汇合后，培养进行7天，用1ml新鲜培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPOImmunoassay，R&D System)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验的结果的平均值示于图43中。

这样，在长期传代培养后，在所有4株携带hEPO-14NΔqHAC载体的HFL-1细胞中都观察到了hEPO表达。

上述实验证明了在长期传代培养后，hEPO-14NΔqHAC载体能够在HFL-1细胞中保持hEPO基因表达。

实施例12

构建包含亚端粒区的14HAC(14gNΔqHAC)载体

通过同源重组将loxP序列插入长臂远侧区和长臂近侧区，使得HAC载体将包含端粒序列和人14号染色体末端的约60kb的亚端粒区。通过Cre进行定点重组，从而切割2个loxP序列之间的区域，并且去除，以构建去除了长臂远侧区的人工染色体(14gNΔqHAC)载体。

(1)通过定点重组从人14号染色体去除长臂

(1-1)构建用于将loxP序列插入人14号染色体的端粒长臂远侧区的ploxpPGK-14qtel-2载体

实施例6(1-1)的ploxPupBSD-PGK载体用作用于插入loxP序列的载体(即导向载体)。基于获自GenBank数据库的人14号染色体的长臂远侧区的核苷酸序列(编号AB019437)，设计了用于插入ploxpPGK-14qtel-2载体的两个靶序列。用于通过PCR对其进行扩增的、包含限制酶识别位点的寡核苷酸引物的序列如下所示。

AB01 38KpnIFw：5′-AGGTACCTTAGAGACTTTGTGAGGCTTATCGGCT(SEQ ID NO：79)

AB01 40ApaIRv：

5′-AGGGCCCTAGTTAGATCTGGCAAGCCTAAAGCTG(SEQ ID NO：80)

AB01 42SpeIFw：5′-GACTAGTCGCTTGAGTCGTCATCATCAGATGAGT(SEQ ID NO：81)

AB01 45R：5′-AGGAGGATCCTTTATTGAGTGCAC(SEQ ID NO：82)

AB01 45F：5′-GTGCACTCAATAAAGGATCCTCCT(SEQ ID NO：83)

AB01 47EcoRV：5′-CGATATCGATGCTAAGAGATGCCCTAAGAAATCC(SEQ ID NO：84)

根据实施例1(1-1)的方法，将携带人14号染色体的小鼠A9杂交细胞(A9c11-14chr)的基因组DNA用作模板，用上述引物通过PCR扩增重组的两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)。使用LA Taq聚合酶(TakaraShuzo Co.，Ltd.)，并且反应用AB01 38KpnIFw/AB01 40ApaIFw在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸6分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸6分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸6分钟，并且70℃下延伸10分钟。同样，反应用AB01 42SpeIFw/AB01 47EcoRV在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸8分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸8分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸8分钟，并且70℃下延伸10分钟。用限制酶KpnI和ApaI消化用AB0138KpnIFw/AB01 40ApaIFw获得的2.0-kb扩增产物，然后克隆到ploxPupBSD-PGK载体的KpnI-ApaI位点。同样，用限制酶SpeI和BamHI消化用AB01 42SpeIFw/AB01 45R获得的3.0-kb扩增产物，用限制酶BamHI和EcoRV消化用AB01 45F/AB01 47EcoRV获得的2.0-kb扩增产物，将这两个片段亚克隆到pBluescript载体中，用SpeI和EcoRV消化产物，然后将产物克隆到包含上述2.0-Kb靶序列的ploxPupBSD-PGK载体的NheI-EcoRV位点。最终的ploxpPGK-14qtel-2构建体的大小是大约12.1kb。ploxpPGK-14qtel-2载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因如图44和图45所示。

(1-2)用于将loxP序列插入携带人14号染色体的DT40杂交细胞的端粒长臂远侧区中的ploxpPGK-14qtel-2载体的导入

根据实施例1(1-2)的方法，通过用SrfI限制酶消化，将ploxpPGK-14qtel-2构建体转化为线性化的DNA，并且将产物导入携带人14号染色体的DT杂交细胞DT40(-14)1-2和DT40(-14)2-4。用杀稻瘟素(终浓度：8ug/ml)进行选择培养，此后使药物抗性集落发展2-3周。在DT40(-14)1-2的情况下，通过6次转染操作获得总共1738个杀稻瘟素抗性集落。在DT40(-14)2-4的情况下，通过4次转染操作获得总共618个杀稻瘟素抗性集落。然后使分离的集落生长，然后进行随后的分析。

(1-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，根据实施例12(1-1)的方法通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。通过将这两个靶序列(在图45中标为“5’基因组”和“3’基因组”)夹心，分别在染色体和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置在图46中用箭头表示。序列如下所示。

AB01 37774F：5′-TATGGAGGAATGGCAGAGGGTGACACAGGC(SEQID NO：85)

PGKlongRv2：5′-ACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTG(SEQ IDNO：86)

BsdlongRv2：5′-AGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCC(SEQ IDNO：87)

AB01 47441R：5′-CTCTTGAAGAATCTGAGCCATCTGTATGCC(SEQ IDNO：88)

在来源于DT40(-14)1-2的1738个杀稻瘟素抗性株的2个株中和来源于DT40(-14)2-4的618个杀稻瘟素抗性株中的5株中观察到了两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。

(1-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。在同源重组的两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)外指定探针(g2-5’和g2-3’)(图45)。为了制备探针，用下文显示的寡核苷酸引物对，和作为模板的、携带人14号染色体的A9c11-14chr细胞的基因组DNA进行PCR，分离产物，并且纯化。

AB01 37 kbKpnIFw：5’-AGGTACCCTGTCTATTATGACCAGCATGGC(SEQ ID NO：89)

AB01 38 kbKpnIRv：5’-AGGTACCAGCCGATAAGCCTCACAAAGTCT(SEQ ID NO：90)

AB01 56561F：5’-CTGAAAATTTATCTGCGTGA(SEQ ID NO：91)

AB01 57054R：5’-AGAAGGAGGGTCCTTTGCAT(SEQ ID NO：92)

用限制酶SacI(5’侧)或BstEII(3’侧)(Roche)消化从通过初次筛选获得的从杀稻瘟素抗性株提取的基因组DNA(约10μg)，通过Ausubelet al.(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。通过Typhoon9210图像分析仪(Molecular Dynamics)检测与标记的探针杂交的信号。代表性的结果示于图47。对于5’靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是7.2kb，以野生型(即非重组)形式是4.8kb。对于3’靶序列，所述长度以同源重组体的形式是21.8kb，以野生型(即非重组)形式是18.6kb。从两个候选的来源于DT40(-14)1-2的菌株中，鉴定了一株同源重组体(12g5)，从5个候选的来源于DT40(-14)2-4的菌株中，鉴定了总共3株同源重组株(24g15，24g67和24g91)。

(2)将loxP序列插入人14号染色体的着丝粒长臂近侧区

(2-1)用于将loxP序列插入携带导入了ploxpPGK-14qtel的人14号染色体的DT40细胞的着丝粒长臂近侧区中的ploxPHYGOR/n1载体的导入

通过用SrfI限制酶消化，将实施例6(2-1)制备的ploxPHYGOR/n1构建体转化为线性化的DNA，并且将产物导入携带人14号染色体的DT杂交细胞，即12g5，24g15和24g67，所述细胞中导入了实施例13(1-4)中制备的ploxpPGK-14qtel-2。采用了根据实施例1(1-2)的方法。选择培养进行2-3周后，发展嘌呤霉素抗性集落。作为总共6次转染的结果(每种细胞两次)，分离了总共252个嘌呤霉素抗性集落(即78个来源于12g5的集落，128个来源于24g15的集落，和46个来源于24g67的集落)，然后进行随后的分析。

(2-2)PCR分析

将上述(2-1)获得的嘌呤霉素抗性株的基因组DNA用作模板，根据实施例7(2-1)的方法，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。通过将这两个靶序列夹心(在图27中表示为5’基因组和3’基因组)，分别在染色体上和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置由图28中的箭头指出。在来自上述嘌呤霉素抗性株的39个株(即13个来源于12g5的株，24个来源于24g15的株，和2个来源于24g67的株)中观察到了两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。

(2-3)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，根据实施例6(2-4)的方法进行了DNA印迹分析。代表性的结果示于图48。对于5’靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是12.5kb，以野生型(即非重组)形式是18.2kb。对于3’靶序列，所述长度以同源重组体的形式是10.2kb，以野生型(即非重组)形式是18.2kb。从上述(2-2)中获得的25个候选株中，总共鉴定了23株同源重组体(即11个来源于12g5的株，10个来源于24g15的株，和2个来源于24g67的株)。其中，对来源于24g15的克隆24g15n28(下文称作“g5n8”)和来源于24g67的克隆24g67n19(下文称作“g7n9”)进行以下步骤(3)。

(3)通过Cre-loxP定点重组去除长臂远侧区

(3-1)将Cre表达载体导入携带包含插入长臂远侧区和近侧区中的loxP序列的人14号染色体的DT40杂交细胞

根据实施例1(1-2)的方法，将Cre表达载体pCAGGSCre导入在实施例12(2)中获得的g5n8和g7n9细胞。用潮霉素(终浓度：1.25mg/ml)进行选择培养，此后使药物抗性集落发展2-3周。作为总共4次转染操作(每种细胞两次)的结果，分离了总共16个潮霉素抗性集落(11个来源于g5n8的集落和5个来源于g7n9的集落)，然后进行随后的分析。

(3-2)PCR分析

将潮霉素抗性株的基因组DNA用作模板，根据实施例6(3-2)的方法，通过PCR证实两个loxP序列之间的区域的缺失。通过夹心长臂远侧区缺失后保留的loxP序列，在染色体上和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置由图28中的箭头指出。结果，在上述16个潮霉素抗性株中的12个株(7个来源于g5n8的株和5个来源于g7n9的株)中，随后观察到了推导的扩增产物。

(3-3)DNA印迹分析

进行DNA印迹分析，以鉴定长臂远侧区缺失的染色体的结构，并且选择长臂远侧区缺失的染色体。靶序列的位置、染色体等位基因和由长臂远侧区的缺失得到的探针示于图30B。在同源重组的两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)外指定探针(g2-5’(i)和N3’(i))(图30B)。按照与实施例13(1-4)和(2-4)相同的方式，从实施例13(3-2)获得的9株潮霉素抗性株(即5个来源于g5n8的株和4个来源于g7n9的株)提取基因组DNA。用限制酶(Roche)消化涉及使用SacI(5’侧)或StuI(3’侧)。代表性的结果示于图49。对于5’靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是9.2kb，以野生型(即非重组)形式是7.2kb。对于3’靶序列，所述长度以同源重组体的形式是8.3kb，以野生型(即非重组)形式是10.2kb。结果，在总共5个株(3个来源于g5n8的株和2个来源于g7n9的株)中观察到了长臂远侧区缺失的染色体。

(3-4)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。作为上述(3-3)中获得的5个株(即g5n8Δc3，g5n8Δd1，g5n8Δd4，g7n9Δc1和g7n9Δc3)的分析结果，发现所有株都是正常核型，并且在大多数观察到的有丝分裂象中检测到Cot1染色的信号的拷贝。代表性的FISH图和HAC载体的核型示于图50A和50B。

实验(3-1)-(3-4)证明获得的潮霉素抗性DT40杂交细胞携带长臂远侧区缺失的人14号染色体片段(14gNΔqHAC)，同时保留了天然存在的端粒区。

(4)将克隆位点导入14gNΔqHAC的长臂近侧区

(4-1)构建用于插入loxP和3’neo序列的pSF(g+n1)载体

作为用于将loxP和3’neo序列插入实施例12(3)制备的人类人工染色体(HAC)的基础质粒，使用实施例1(2-1)制备的pSF1③。基于用于获自实施例12(1-1)的ploxpPGK-14qtel2载体的序列设计将插入loxP和3’neo的同源重组的5’靶序列。基于获自GenBank数据库的人14号染色体的长臂近侧区的核苷酸序列(编号AL391156)设计3’靶序列。用于通过PCR对其进行扩增的寡核苷酸引物的序列如下所示。

54023Flong2FseI：

5′-GATGGCCGGCCTGGTTGGTAAAGATTGCTACACTTACGGCA(SEQID NO：93)

58830RlongSrfI：

5′-GATGCCCGGGCCAATAGCCAGTCAATCGAGAAACCAAGCCC(SEQ ID NO：94)

通过用SalI和SrfI(Roche)消化从ploxpPGK-14qtel2载体切下5’靶序列，通过琼脂糖凝胶电泳分离和纯化，然后克隆到pSF1③质粒的SalI-SrfI位点。采用从携带人14号染色体的A9c11-14chr细胞提取的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增3’靶序列。使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，添加MgSO₄(终浓度：0.5mM)，反应在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸8分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸8分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸8分钟，并且在72℃下延伸10分钟。用限制酶FseI和SrfI(Roche)消化DNA片段(约5.0kb)，通过琼脂糖凝胶电泳分离和纯化，然后克隆到已经插入了5’靶序列的pSF1③质粒的FseI-SrfI位点。最终的pSF1(g+n1)构建体的大小是约13.2kb。导向载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因示于图51和图34B。

(4-2)将pSF(g+n1)载体导入携带14gNΔqHAC的DT40细胞

根据实施例1(1-2)的方法，通过用SrfI限制酶(Roche)消化将pSF(g+n1)构建体线性化，然后导入3种类型的携带长臂远侧区缺失的14gNΔqHAC的DT40杂交细胞(g5n8Δc3，g5n8Δd1和g7n9Δc1)。此后使杀稻瘟素抗性集落发展2-3周。作为3次转染操作的结果，分离了总共154个药物抗性集落(即99个来源于g5n8Δc3的集落，34个来源于g5n8Δd1的集落，和21个来源于g7n9Δc1的集落)，进行随后的分析。

(4-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。通过将这两个靶序列夹心，分别在染色体上和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置由图34B中的箭头指出。用于检测5’靶序列的引物的序列如下所示。

AB01 37931F：5’-AGCGGTACTGAGAGGCAATCTTTCATGGGC(SEQID NO：95)

ApaIlongFw2：5’-ACCAAATATCCTGCTCAAACTGTAACCC(SEQ IDNO：96)

采用根据实施例13(4-1)的方法。在以下反应条件下检测5’靶序列：94℃下1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸6分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸6分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸6分钟，并且72℃下延伸10分钟。在获得的杀稻瘟素抗性株中，发现13个株(即3个来源于g5n8Δc3的株，8个来源于g5n8Δd1的株，和2个g7n9Δc1株细胞)产生具有从核苷酸序列(5基因组：约2.0kb；3基因组：约5.0kb)推导的大小的扩增产物。

(4-4)DNA印迹分析

进行DNA印迹分析，以选择同源重组体。在同源重组的靶序列外指定探针g2-5’(i)(实施例12(1-4))和N3’(ii)(实施例6(4-4))(图34B)。按照与实施例12(1-4)相同的方式，从实施例12(4-3)获得的候选药物抗性株提取基因组DNA。用限制酶(Roche)消化涉及使用SphI(5’侧)或BstEII(3’侧)。代表性的结果示于图52。对于5’基因组靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是11.8kb，以野生型(即非重组)形式是4.6kb。对于3’基因组靶序列，所述长度以同源重组体的形式是15.8kb，以野生型(即非重组)形式是8.8kb。从13个候选药物抗性株中，鉴定了总共9株同源重组体。

通过上述实验(4-1)-(4-4)，获得了9株携带导入了克隆位点(即loxP和3’neo序列)的14gNΔqHAC载体的DT杂交细胞(即g5n8Δc3s13，g5n8Δd1s3，4，6，8，9，10，g67n19Δc1s9和21)。其中，对两个株，即g5n8Δc3s13和g67n19Δc1s9进行随后的步骤。

(5)将14gNΔqHAC载体导入CHO细胞

(5-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将14gNΔqHAC载体导入CHO细胞

作为染色体供体细胞，使用实施例12(4)获得的DT40杂交细胞(g5n8Δc3s13和g67n19Δc1s9)，其携带14gNΔqHAC载体，所述载体去除了长臂远侧区，并且具有插入其中的克隆位点(即loxP序列和3’neo序列)。作为染色体受体细胞，使用来源于中国仓鼠的CHO-K1细胞(编号JCRB9018)。使用根据实施例1(3-1)的方法。选择培养进行约2周后，分离发展的杀稻瘟素抗性集落，进行随后的分析。作为4次微核细胞融合操作的结果，总共获得了55株杀稻瘟素抗性CHO株(即32个来源于g5n8Δc3s13的株和23个来源于g67n19Δc1s9的株)。

(5-2)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。采用根据实施例6(5-2)的方法。在获得的杀稻瘟素抗性CHO细胞中，发现52个株(即29个来源于g5n8Δc3s13的株和23个来源于g67n19Δc1s9的株)产生具有从核苷酸序列推导的大小的扩增产物(5’基因组：约2.0kb；3’基因组：约5.0kb)，并且没有观察到DT40细胞的导入。

(5-3)DNA印迹分析

以与实施例12(4-4)相同的方式进行DNA印迹分析，以鉴定导入的14gNΔqHAC载体的结构。代表性的结果示于图53中。对于5’基因组靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是11.8kb，以野生型(即非重组)形式是4.6kb。对于3’基因组靶序列，所述长度以同源重组体的形式是15.8kb，以野生型(即非重组)形式是8.8kb。从36个候选杀稻瘟素抗性株中，鉴定了总共35株同源重组体(即17个来源于g5n8Δc3s13的株和18个来源于g67n19Δc1s9的株)。在图53和54中，“g5S13”和“g7S9”分别代表来源于g5n8Δc3s13的株和来源于g67n19Δc1s9的株。

(5-4)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)描述的方法进行FISH分析。作为分析15株杀稻瘟素抗性CHO株(即6个来源于g5n8Δc3s13的株和9个来源于g67n19Δc1s9的株)的结果，发现总共5株(即2个g5n8Δc3s13-9和12株(下文称作g5S13-9和g5S13-12)和3个g67n19Δc1s9-11、12、和17株(下文称作g7S9-11、g7S9-12和g7S9-17))是正常核型并且在大多数观察的有丝分裂象中检测到了Cot1染色的14gNΔqHAC载体的拷贝。代表性的FISH图和14gNΔqHAC载体的核型示于图54A和54B中。

实验(5-1)-(5-4)证明获得的5株杀稻瘟素抗性CHO株具有正常核型，并且携带14gNΔqHAC载体的拷贝。

实施例13

分析14gNΔqHAC载体在CHO杂交细胞中的长期稳定性

(1)在非选择性培养条件下长期传代培养

为了证实14gNΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例7中描述的两株携带14gNΔqHAC载体的CHO株(g5S13-9和g5S13-12)。非选择培养基是含有10％ FBS的F12培养基，选择培养基含有所述F12培养基和以8μg/ml添加到其中的杀稻瘟素。将5.0×10⁵个CHO细胞铺于10-cm培养皿中，对已经培养至约80-90％汇合的细胞密度的细胞进行计数，将5.0×10⁵个细胞再次铺板在10-cm培养皿中，传代培养继续进行直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。第10次传代后回收CHO株，制备FISH染色体样品。

(2)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。以双份测量群体倍增水平和HAC保留，确定平均值。关于这两个株的结果示于表5和图13。在图13中，结果示于“14gΔqHAC(g)”项中。

表5：14gNΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性

 

HAC           细胞群传代培养次数         HAC保留(％)无药物选择      有药物选择G5S13-9       培养开始时10次传代G5S13-12      培养开始时10次传代-               10099              98-               10099              98

14gNΔqHAC载体到第10次传代结束时在CHO细胞中稳定保留。作为中期染色体图的观察结果，每个细胞检测到1或2个信号。

实验(1)和(2)证明14gNΔqHAC载体可以在非选择性培养条件下在CHO细胞中稳定保留，并且可以保持每个细胞的拷贝数。

实施例14

分析包含hEPO-14gNΔqHAC载体的CHO细胞中的hEPO基因表达

(1)构建hEPO-14gNΔqHAC载体

(1-1)将hEPO基因导入14gNΔqHAC载体中

将hEPO基因表达单位插入实施例7中构建的14gNΔqHAC载体中。制备含有loxP序列的hEPO表达质粒，瞬时表达Cre重组酶以便通过loxP序列之间的定点重组将基因表达单位插入人工染色体。用G418抗性的获得(即启动子-片段化的新霉素抗性基因表达单位的重建)作为指示物选择包含插入序列的重组体。使用实施例13制备的携带14gNΔqHAC载体的CHO杂交细胞(即g5S13-12细胞和g7S9-11细胞)，以与实施例3(1-1)相同的方式插入hEPO基因表达单位。此后使G418抗性集落发展2-3周，分离总共169个集落(77个来源于g5S13-12的集落和92个来源于g7S9-11的集落)，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(1-2)PCR分析

使用SVpANp1和Neo Rp2引物，通过PCR检查hEPO基因表达单位是否插入到14gNΔqHAC载体的loxP序列的位点中，从而选择包含插入其中的hEPO基因表达单位的重组体，所述引物是在pLN1-EPO载体和14gNΔqHAC载体上设计的，以夹心loxP序列的位点。同样，用pBS226质粒载体的M13RV和Neo Rp2引物通过PCR检查插入的hEPO基因的扩增，从而选择它。根据Kakeda et al.(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法确定引物序列和PCR条件。在包含插入序列的重组体的情况下，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，并且用M13RV和Neo Rp2引物推导约2.7kbp的扩增。作为结果，在上文(1-1)中获得的总共69株G418抗性CHO杂交细胞中观察到了推导的扩增(即32个来源于g5S13-12的株和37个来源于g7S9-11的株)。

因此，发现上述69株G418抗性CHO杂交株是包含插入loxP序列中的hEPO基因表达单位的重组体。

(1-3)DNA印迹分析

为了检查hEPO-14gNΔqHAC载体是否合适地携带hEPO表达单位，进行DNA印迹分析。根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行该方法。代表性的结果示于图55中。由核苷酸序列推导的XbaI消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hEPO表达单位。在(1-2)中获得的65株候选G418抗性CHO杂交细胞(即24个来源于g5S13-12的株和41个来源于g7S9-11的株)中的总共32株(即10个来源于g5S13-12的株和22个来源于g7S9-11的株)中观察到了具有推导的大小的条带。

(1-4)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法，用人特异性Cot1(Invitrogen)探针进行FISH分析。对(1-3)中获得的17株G418抗性CHO杂交细胞进行分析。结果，在总共5株(1个来源于g5S13-12的株(下文称作“g5S13-12E23；”；4个来源于g7S9-11的株(下文称作“g7S9-11E28，48，57和62”)的大多数观察到的有丝分裂象中检测到了正常核型和Cot1染色的hEPO-14gNΔqHAC载体的拷贝。代表性的FISH图和hEPO-14gNΔqHAC载体的核型示于图56A和56B。

实验(1-1)-(1-4)证明了得到的5株G418抗性株是携带hEPO-14gNΔqHAC载体并且具有正常核型的CHO细胞。

(2)插入14gNΔqHAC载体中的hEPO基因的表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文1)中分离并且进行DNA印迹分析从而鉴定hEPO基因表达单位的存在和结构的28株携带hEPO-14gNΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞(约10⁵个细胞)铺板在12孔组织培养塑料培养皿(Falcon)上，该培养皿包含2ml F12培养基，所述培养基中含有10％ FBS和0.8mg/ml的G418。培养的细胞达到汇合后，用2ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养进行7天，用1ml含10％FBS的F12培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay，R&DSystems)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验结果的平均值示于图57。

这样，在所有28株携带hEPO-14gNΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞中观察到了hEPO表达。

实施例15

分析hEPO-14gNΔqHAC载体在CHO细胞中的长期稳定性

(1)在非选择性培养条件下长期传代培养

为了证实hEPO-14gNΔqHAC载体在CHO杂交细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例15中获得的3株CHO杂交细胞(g5S13-12E23，g7S9-11E28和62)。非选择培养基是含有10％ FBS的F12培养基，选择培养基含有所述F12培养基和以0.8mg/ml添加到其中的G418。将5.0×10⁵个CHO细胞铺于10-cm培养皿中，对已经培养至约80-90％汇合的细胞密度的细胞进行计数，将5.0×10⁵个细胞再次铺板在10-cm培养皿中，传代培养继续进行直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。第10次传代后回收CHO细胞，进行hEPO基因表达分析和FISH分析。

(2)长期传代培养后的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文(1)中进行了长期传代培养的3株携带hEPO-14gNΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞(约10⁵个细胞)铺板在12孔组织培养塑料培养皿(Falcon)上，该培养皿包含2ml F12培养基，所述培养基中含有10％ FBS和0.8mg/ml的G418。培养的细胞达到汇合后，用2ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养进行7天，用1ml含10％FBS的F12培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPOImmunoassay，R&D Systems)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验结果的平均值示于图58。

这样，在所有3株携带hEPO-14gNΔqHAC载体的CHO杂交细胞中在长期传代培养后观察到了hEPO表达。

(3)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。以双份测量群体倍增水平和HAC保留，确定平均值。关于上述3株的结果示于表6和图58。

表6：hEPO-14gNΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性

 

HAC细胞群传代培养次数         HAC保留(％)无药物选择     有药物选择g5S13-12E23g7S9-11E28g7S9-11E62培养开始时10次传代培养开始时10次传代培养开始时10次传代-              10090             100-              10090.4           97.9-              10093.5           98.8

hEPO-14gNΔqHAC载体到第10次传代结束时在CHO细胞中稳定保留。作为中期染色体图的观察结果，每个细胞检测到1或2个信号。

上述实验(1)-(3)证明hEPO-14gNΔqHAC载体可以在非选择性培养条件下长期传代培养后在CHO细胞中稳定保留，可以保持每个细胞的拷贝数，并且可以保持hEPO基因表达。

实施例16

包含hEPO-14gNΔqHAC载体的人正常成纤维细胞中的hEPO基因表达

(1)制备导入了hEPO-14gNΔqHAC载体的人正常成纤维细胞

(1-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将hEPO-14gNΔqHAC载体导入人正常成纤维细胞HFL-1

从实施例15获得的携带hEPO-14gNΔqHAC载体的CHO杂交株中选择具有形成微核的高能力的克隆(g5S13-12E23，g7S9-11E28和62)，并且用作染色体供体细胞。人正常成纤维细胞HFL-1(获自RIKEN生物资源中心的细胞工程部门；编号RCB0521)用作染色体受体细胞。按照与实施例5(1)相同的方式进行微核细胞融合。选择培养进行约4周后，分离发展的药物抗性集落，然后进行随后的分析。作为24次微核细胞融合操作的结果，获得了51个药物抗性集落(即3个来源于g5S13-12E23的集落，22个来源于g7S9-11E28的集落，和26个来源于g7S9-11E62的集落)。在上述集落中，用g5S13-12E23细胞作为染色体供体细胞获得的细胞在下文中称作g23H细胞，用g7S9-11E28细胞获得的细胞在下文中称作g28H细胞，用g7S9-11E62细胞获得的细胞在下文中称作g62H细胞。

(1-2)PCR分析

根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法，使用实施例3(1-2)的SVpANp1和Neo Rp2引物，和STS标记物，即D2S1334引物，通过PCR扩增检查人染色体是否携带hEPO-14gNΔqHAC载体。同样，用CHO弗林蛋白酶基因特异性引物，即furin3’subF和furinEx6-28R，通过PCR扩增检查染色体供体CHO细胞的导入。采用根据实施例5(1-2)的方法。当携带hEPO-14gNΔqHAC载体的HFL-1细胞不包括染色体供体CHO细胞时，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，用D2S1334引物推导约0.6kbp的扩增，用furin3’subF和furinEx6-28R推导无扩增。结果，在来自上文(1-1)获得的50个杀稻瘟素抗性株的总共6个株(即g23H1，2，3，g28H18，22和g62H26)中观察到了推导的扩增。

这样，证实了上述6株杀稻瘟素抗性株是携带hEPO-14NΔqHAC载体的HFL-1细胞。

(1-3)DNA印迹分析

为了检查hEPO-14gNΔqHAC载体是否合适地携带hEPO表达单位，对上述6株杀稻瘟素抗性株的4个株(g23H1，3，g28H18和g62H26)进行DNA印迹分析。该方法是根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行的。代表性的结果示于图19C。从核苷酸序列推导的由XbaI消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hEPO表达单位。结果，在上文(1-2)中获得的3株携带hEPO-14gNΔqHAC载体的杀稻瘟素抗性株(即g23H1，3和g62H26)中观察到了具有推导的大小的条带。

(1-4)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。使用人14号染色体和人22号染色体特异性α-卫星DNA探针(Q-Biogene，Funakoshi)。作为3株杀稻瘟素抗性株(g23H1，3和g62H26)的分析结果，发现2个株(g23H3和g62H26)是正常核型，在大多数观察的有丝分裂象中，在来源于宿主细胞的一对人14号染色体和人22号染色体的着丝粒区的4个位点中和来源于14gNΔqHAC载体拷贝的位点中检测到了信号。结果示于图59A和图59B。

实验(1-1)-(1-4)证明了获得的2株杀稻瘟素抗性株是携带hEPO-14gNΔqHAC载体并且具有正常核型的HFL-1细胞。

(2)携带hEPO-14gNΔqHAC载体的HFL-1细胞中的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文(1)中分离并且进行DNA印迹分析从而鉴定hEPO表达单位的3株携带hEPO-14gNΔqHAC载体的杀稻瘟素抗性HFL-1株(约10⁵个细胞)铺板在I型胶原包被的24孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养皿中包含1ml含有杀稻瘟素(3μg/ml)的选择培养基(含20％FBS的DMEM培养基)。在培养的细胞达到汇合后，培养进行7天，用新鲜培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPOImmunoassay，R&D System)对培养上清液中的hEPO进行定量。其结果在图21中的＂14gN-HAC＂项中显示。

因此，在所有3株携带hEPO-14gNΔqHAC载体并且具有正常核型的HFL-1细胞中观察到了hEPO表达。

实施例17

分析hEPO-14gNΔqHAC载体在人正常成纤维细胞中的长期稳定性

(1)非选择性培养条件下的长期传代培养

为了证实hEPO-14gNΔqHAC载体在人正常成纤维细胞HFL-1中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例16中获得的3株携带hEPO-14gNΔqHAC载体的HFL-1细胞(g23H1，g23H3和g62H26)。非选择培养基是含20％ FBS的DMEM，选择培养基含有所述DMEM培养基和以3μg/ml添加到其中的杀稻瘟素。将1-3×10⁵个携带hEPO-14gNΔqHAC载体的HFL-1细胞铺于I型胶原包被的T-25烧瓶(Falcon)中，将细胞培养至约90％汇合的细胞密度，再次铺板1-3×10⁵个细胞，传代培养继续直到第5-10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。在第5次传代前和后以及第10次传代后回收细胞，进行hEPO基因表达分析和FISH分析。

(2)长期传代培养后的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文(1)中进行了长期传代培养的2株携带hEPO-14gNΔqHAC载体的HFL-1细胞g23H1和g62H26以约10⁴个细胞的量铺板在I型胶原包被的24孔或48孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养皿中包含2ml含有20％ FBS的DMEM培养基。在培养的细胞达到汇合后，培养进行7天，用新鲜培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(QuantikineIVD Human EPO Immunoassay，R&D System)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验的结果的平均值示于图43中。

这样，在长期传代培养后，在所有2株携带hEPO-14gNΔqHAC载体的HFL-1细胞中都观察到了hEPO表达。

上述实验证明了在长期传代培养后，hEPO-14gNΔqHAC载体能够在HFL-1细胞中稳定保留，并且可以保持hEPO基因表达。

实施例18

构建除去了新霉素抗性基因单位的hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体

将FRT序列插入14AΔq-HAC载体和pLN1/EPO质粒的hEPO表达单位下游的位点，通过FRT/FLPe定点重组系统从hEPO-14AΔq-HAC载体除去新霉素抗性基因表达单位。概要示于图60。

(1)将FRT序列导入14AΔqHAC的克隆位点

(1-1)构建用于导入FRT序列的t1pSF1-FRT载体

为了将FRT序列插入实施例1中构建的14AΔqHAC的克隆位点，合成含有FRT序列的寡DNA，将产物克隆到实施例1(2-1)中构建的t1pSF载体中。含有FRT序列的合成的寡DNA的序列如下所示。

FRT接头S：

5’-TGGACTAGTCCAGGCCGGCCACGCGTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCGCTAGCGGCCGGCCTGGACTAGTCCA(SEQ ID NO：97)

FRT接头AS：

5′-TGGACTAGTCCAGGCCGGCCGCTAGCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCACGCGTGGCCGGCCTGGACTAGTCCA(SEQ ID NO：98)

通过退火使含有FRT序列的寡DNA成为双链，用FseI限制酶切割，然后克隆到t1pSF载体的FseI位点。最终的t1pSF1-FRT构建体的大小是约13.5kb。导向载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因示于图61。

(1-2)将t1pSF1-FRT载体导入携带14AΔqHAC的DT40细胞

通过用SrfI限制酶(Roche)消化，将t1pSF1-FRT构建体线性化，通过电穿孔导入去除了长臂远侧区同时保留14AΔqHAC的DT40杂交细胞。使用根据实施例1(2-2)的方法。此后使杀稻瘟素抗性集落发展2-3周。通过单次转染操作从12t97sF分离总共12个药物抗性集落，并且通过单次转染操作从12t134sF分离总共94个药物抗性集落。使分离的集落生长，进行随后的分析。

(1-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。分析2个靶序列(在图61中标为“5’基因组”和“3’基因组”)的存在。使用根据实施例1(2-3)的方法。

发现获得的12株来源于12t97SF的杀稻瘟素抗性DT40株中的3株，和94株来源于12t134SF的杀稻瘟素抗性DT40株中的2株产生具有从核苷酸序列推导的大小的扩增产物(5’基因组：约5kb；3’基因组：约2kb)。

(1-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。根据实施例1(2-4)的方法分析同源重组的两个靶序列，即5’靶序列和3’靶序列的存在。代表性的结果示于图62。作为5’基因组分析和3’基因组分析的结果，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是24.6kb，以野生型(即非重组)形式是18.2kb。从3个来源于12t97SF的候选杀稻瘟素抗性株中鉴定了2株同源重组体(12t97SF1和12)，从2株12t134sF2株中鉴定了2株同源重组体(12t134SF6，21)。

作为上述实验(1-1)-(1-4)的结果，获得了2株DT40杂交细胞，即12t97SF，(-1，12)，和2株12t134SF细胞(-6，21)，它们携带包含通过同源重组插入克隆位点中的FRT序列的14AΔqF-HAC载体。

(2)将14AΔqF-HAC载体导入CHO细胞

(2-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将14AΔqF-HAC载体导入CHO细胞

将实施例18(1)获得的、去除了长臂远侧区并且在克隆位点插入了FRT序列的携带14AΔqF-HAC载体的DT杂交细胞(12t97sF1，12t97sF12和12t134sF21)用作染色体供体细胞。将来源于中国仓鼠的CHO-K1细胞(编号JCRB9018)用作染色体受体细胞。通过实施例1(3)的微细胞介导的染色体转移方法将14AΔqF-HAC载体导入CHO细胞。

选择培养进行约2周后，分离发展的杀稻瘟素抗性集落，进行随后的分析。作为微核细胞融合(3株×2次)的结果，获得了总共36个杀稻瘟抗性CHO株(即25个来源于12t97sF1的株，3个来源于12t97sF12的株，和8个来源于12t134sF21的株)。

(2-2)PCR分析

为了证实目的细胞携带14AΔqF-HAC载体，并且它不包括DT40，将杀稻瘟素抗性CHO株的基因组DNA用作模板，用于通过PCR检测NEK2P(+)、IGHV3(-)和Ggbeta-肌动蛋白(-)的存在。采用实施例1(1-3)和实施例6(5-2)的方法。推导的检测模式是NEK2P(+)、IGHV3(-)和Ggbeta-肌动蛋白(-)。从36株杀稻瘟素抗性CHO株中，发现33株(即23个来源于12t97sF1的株，3个来源于12t97sF12的株，和7个来源于12t134sF21的株)产生从核苷酸序列推导的扩增产物。

(2-3)DNA印迹分析

为了鉴定导入的14AΔqF-HAC载体的结构，以与实施例1(2-4)相同的方式进行DNA印迹分析。代表性的结果示于图63。作为5’基因组分析和3’基因组分析的结果，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是24.6kb，以野生型(即非重组)形式是18.2kb。从27株候选杀稻瘟素抗性CHO株中鉴定了总共26株同源重组体(即20个来源于12t97sF1的株，2个来源于12t97sF12的株，和4个来源于12t134sF21的株)。

(2-4)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。作为分析14株杀稻瘟素抗性CHO株(即11个来源于12t97sF1的株，1个来源于12t97sF12的株，和2个来源于12t134sF21的株)的结果，发现总共6株(即5个来源于12t97sF1的株，0个来源于12t97sF12的株，和1个来源于12t134sF21的株)是正常核型，在大多数观察到的有丝分裂象中检测到Cot1染色的14AΔqF-HAC载体的拷贝。代表性的结果示于图64。

实验(2-1)-(2-4)证明获得的6株杀稻瘟素抗性CHO株(即12t97sF1-2，5，8，17，21和12t134sF21-2)携带用于除去新霉素抗性基因单位的14AΔqF-HAC载体。其中，12t97sF1-5和12t134sF21-2(下文称作“F1-5”和“F21-2”)进行下文描述的实验。

(3)构建hEPO-14AΔqF-HAC载体

(3-1)将FRT序列导入hEPO表达质粒pLN1-EPO

将实施例18(1-1)中使用的包含FRT序列的合成的寡DNA插入hEPO表达质粒pLN1-EPO(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)。

通过退火使包含FRT序列的寡DNA，即FRT接头S和FRT接头AS成为双链，用SpeI限制酶消化，然后克隆到XbaI位点，在该位点通过用XbaI限制酶消化，从pLN1EPO载体除去了驱动新霉素抗性基因的CMV启动子。此外，将产物再次导入接头中的NheI位点，该接头中导入了驱动新霉素抗性基因的CMV启动子。最终的pLN1-EPOF构建体的大小是约4.9kb。

(3-2)将hEPO基因导入14AΔqF-HAC载体

将包含FRT序列的hEPO基因表达单位插入14AΔqF-HAC载体。制备包含loxP和FRT序列的hEPO表达质粒pLN1-EPOF，并且瞬时表达Cre重组酶，以便通过loxP序列之间的定点重组将基因表达单位插入人工染色体。用G418抗性的获得(即启动子-片段化的新霉素抗性基因表达单位的重建)作为指示物选择包含插入序列的重组体。概要示于图65。使用实施例18(2)制备的携带14AΔqF-HAC载体的CHO细胞(F1-5和F21-2)，采用实施例3(1-1)的方法。此后使G418集落发展2-3周，分离总共92个集落(45个来源于F1-5的集落和47个来源于F21-2的集落；下文分别称作＂5EF细胞＂和＂2EF细胞＂)，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(3-3)PCR分析

使用SVpANp1和Neo Rp2引物，通过PCR扩增来检查hEPO基因表达单位是否插入到14AΔqFHAC载体的loxP序列的位点中，从而选择包含hEPO基因表达单位的重组体，所述引物是在pLN1-EPOF载体和14AΔqFHAC载体上设计的，以夹心loxP序列的位点，或采用pBS226质粒载体上的M13RV和Neo Rp2引物通过PCR扩增插入的hEPO基因。根据Kakeda et al.(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法确定引物序列和PCR条件。在包含插入序列的重组体的情况下，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，并且用M13RV和NeoRp2引物推导约2.7kbp的扩增。作为结果，在上文(3-2)中获得的G418抗性CHO杂交细胞的总共51株(即23株5EF细胞和28株2EF细胞)中观察到了推导的扩增。因此，发现总共51株G418抗性CHO杂交细胞是包含插入loxP序列中的hEPO基因表达单位的重组体。

(3-4)DNA印迹分析

为了检查hEPO-14AΔqF-HAC载体是否合适地携带hEPO表达单位，进行DNA印迹分析。根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行该方法。代表性的结果示于图66中。由核苷酸序列推导的XbaI消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hEPO表达单位。在上文(3-2)中获得的65株候选G418抗性CHO杂交细胞中的总共23株(即8株5EF细胞和15株2EF细胞)中观察到了具有推导的大小的条带。

(3-5)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法，用人特异性Cot1(Invitrogen)探针进行FISH分析。对上文(3-4)中获得的16株(即5株F1-5细胞和11株F21-2细胞)G418抗性CHO杂交细胞进行分析。结果，在总共2株(5EF-1和2EF-36)的大多数观察到的有丝分裂象中检测到了正常核型和Cot1染色的hEPO-14AΔqHAC载体的拷贝。代表性的结果示于图67A和图67B。

实验(3-1)-(3-5)证明了得到的2株G418抗性株是携带hEPO-14AΔqF-HAC载体并且具有正常核型的CHO细胞。

(4)用hEPO-14AΔqF-HAC载体在CHO细胞中表达hEPO基因

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将2株上述1)中分离的携带hEPO-14AΔqFHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞，即5EF-1和2EF-36(约10⁵个细胞)铺板在12孔组织培养塑料培养皿(Falcon)上，该培养皿包含2ml含有10％ FBS和0.8mg/ml G418的F12培养基。培养的细胞达到汇合后，用2ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养进行2天，用1ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPOImmunoassay，R&D Systems)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验结果的平均值示于表7。

表7

 

克隆编号以CM表示的hEPO浓度(IU/10E6个细胞/24h)5EF-12EF-36539316

这样，在所有4株携带hEPO-14AΔqFHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞中观察到了hEPO表达。

(5)从hEPO-14AΔqF-HAC载体除去新霉素抗性基因单位

(5-1)构建FLPe表达载体pOG44FLPe

通过PCR将突变导入FLPe基因序列(Buchholz，F.et al.，NatureBiotech.(USA)，vol.16，pp.657-662)的4个位点，即L33S，L70F，Y108N和S294P，从而修饰pOG44载体(Invitrogen)的FLP基因序列。首先从FLP(D4，L70)制备FLPwt(D4G，L70F)，然后用FLP(D4，L70)和FLPwt(G4，F70)这两者来制备FLPe(D4·F70/L33S，Y108N，S294P)。用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)进行PCR，并且反应在94℃下进行1分钟，然后是35个循环的98℃下变性30秒，60℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒。

为了进行D4G和L70F的氨基酸取代，用pOG44载体作为模板进行A14G和G210C的核苷酸取代。用于PCR的寡核苷酸引物的序列如下所示。

FLPFw(A14G)Ps：5’

-AACTGCAGCCCAAGCTTCCACCATGCCACAATTTGG(SEQ ID NO：99)

FLPRv(G210C)Ps：5’

-AACTGCAGTGACTTGTTGACAATATCGAAACTCAGC(SEQ ID NO：100)

通过用PstI消化，从pOG44载体切下FLP基因序列，然后用PstI消化的PCR扩增片段(pOG44-FLPwt(D4G，L70F))替代。

随后，为了进行S294P的氨基酸取代，用pOG44载体作为模板，通过PCR进行T880C的核苷酸取代。使用的寡核苷酸引物的序列如下所示。

FLPFw(T880C)Hd：5’-CAAAGCTTTGAAGAAAAATGCGCCTTATCC(SEQ ID NO：101)

FLPRv Ns：      5’-GATCATATGCATAGTACCGAGAAACTAGTG(SEQ ID NO：102)

从pOG44载体除去EcoRV-NsiI区，克隆来源于pOG44载体的DNA片段(EcoRV-HindIII：0.5kb)和上述用HindIII和NsiI消化的PCR扩增片段(pOG44-FLPe(D4·S294P)。

此外，为了进行L33S和Y108N的氨基酸取代，通过PCR进行T109C和T322A的核苷酸取代。使用的寡核苷酸引物的序列如下所示。

FLPFw(T109C)：5’-GACCTTCAGGTGAGAAAATAGCATCATGTG(SEQID NO：103)

FLPRv(T322A)Ev：5’-GTGATATCAGATTGATGTTTTTGTCCATTG(SEQ ID NO：104)

FLPFw(33-81)Bs36：5’

-ACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGGAAAGGTTTGAAAGACCTTCA(SEQ ID NO：105)

用作为模板的pOG44-FLPwt(D4G，L70F)载体和引物FLPFw(T109C)-FLPRv(T322A)Ev通过PCR进行核苷酸取代。此外，将得到的PCR产物用作模板，并且用引物FLPFw(33-81)Bs36-FLPRv(T322A)Ev将限制酶位点即Bsu36I位点添加到5’末端。用限制酶Bsu36I和EcoRV消化扩增的DNA片段，用pOG44-FLPe(D4·S294P)载体(pOG44-FLPe(D4·F70/L33S，Y108N，S294P)的Bsu36I-EcoRV区替代产物。这样，获得了pOG44FLPe。

(5-2)用FLPe除去新霉素抗性基因单位

在实施例23(3)中制备的携带hEPO-14AΔqF-HAC载体的CHO细胞中瞬时表达FLPe重组酶，以便通过FRT序列之间的定点重组从人工染色体切割和除去新霉素抗性基因单位。用新霉素抗性基因单位的缺失作为指示物，选择包含插入序列的重组体。

用胰蛋白酶处理实施例18(3)中制备的携带hEPO-14AΔqF-HAC载体的CHO细胞(即5EF-1和21EF-36)，将5×10⁶个细胞悬浮于0.8mlHank氏平衡盐溶液(HBSS)。在20-100μg FLPe酶表达载体pOG44FLPe的存在下，用Gene Pulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。将450V的电压施加于电容为500μF的电容器，然后用具有4mm的电极间距离的电穿孔细胞放电。将电穿孔的细胞铺板在8个含有F12培养基(Invitrogen)的96孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养基包含10％ FBS(即4个培养皿中是1个细胞/孔；4个培养皿中是0.1个细胞/孔)。此后使杀稻瘟素抗性集落发展2-3周，分离总共149个集落(82个来源于5EF-1的集落和67个来源于21EF-36的集落)，进行随后的分析。

(5-3)PCR分析

为了检查是否从hEPO-14AΔqF-HAC载体除去了新霉素抗性基因单位，在pLN1-EPOF载体上和同源重组区上设计引物(图68)，并且进行PCR。寡核苷酸引物的序列如下所示。

SV40 polyA Np1(SvpANp1)：

5′-CGGGATCCCTCGAGCGAGACATGATAAGATACATTGATG(SEQID NO：106)

AL39 54169R：5′-GATTTTCCACATACGTTCCCAAGCCACTCC(SEQ IDNO：107)

使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，并且反应在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸4.5分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸4.5分钟，25个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸4.5分钟，并且72℃下延伸10分钟。当除去了新霉素抗性基因时，用引物SVpANp1和AL39 54169F推导约0.4kbp的扩增。结果，在上述(5-2)中获得的Bsd抗性CHO杂交细胞中的总共66株(34个来源于5EF-1的株和32个来源于21EF-36的株)中观察到了推导的扩增。这证明在总共66株上述Bsd抗性CHO杂交细胞中除去了新霉素抗性基因单位。

(5-4)DNA印迹分析

为了检查是否从hEPO-14AΔqF-HAC载体除去了新霉素抗性基因单位，进行了DNA印迹分析。根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行该方法。代表性的结果示于图69。当片段由hEPO表达单位组成，同时从其除去新霉素抗性基因单位时，由核苷酸序列推导的EcoRI消化得到的限制酶片段的长度是3.8kb，当所述片段包含新霉素抗性基因单位和hEPO表达单位这两者时，所述长度是6.6kb。在实施例23(5-2)中获得的66株候选CHO杂交细胞(34个来源于5EF-1的株和32个来源于21EF-36的株)中的总共36株(18个来源于5EF-1的株和18个来源于21EF-36的株)中检测到了具有推导的大小的条带。这样，在上述36株CHO杂交细胞中观察到了新霉素抗性基因单位的除去。除去了新霉素抗性基因单位的hEPO-14AΔqF-HAC载体在下文中称作“hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体”。

(5-5)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。分析了上述(5-3)中获得的候选CHO杂交细胞中的8个来源于5EF-1的株。结果，在总共2株(5EF1Δ38和5EF1Δ63)的大多数观察的有丝分裂象中检测到了正常核型和Cot1染色的hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体的拷贝。hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体的代表性的FISH图和核型示于图70A和图70B。

实验(5-1)-(5-5)证明了所述2株获得的CHO杂交细胞携带hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体并且具有正常核型。

(6)用除去了新霉素抗性基因单位的hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体在CHO细胞中表达hEPO基因

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将2株实施例23(5)中分离的携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的CHO杂交细胞(5EF1Δ38和5EF1Δ63)以约10⁵个细胞的量铺板在12孔组织培养塑料培养皿(Falcon)上，该培养皿包含2ml含有10％FBS和0.8mg/ml G418的F12培养基。培养的细胞达到汇合后，用2ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养进行2天，用1ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPOImmunoassay，R&D Systems)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验结果的平均值示于表8。

表8

 

克隆编号以CM表示的hEPO浓度(IU/10E6个细胞/24h)5EFΔ385EFΔ63204801

这样，在2株携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞中观察到了hEPO表达。

实施例19

包含除去了新霉素抗性基因单位的hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体的人正常成纤维细胞中的hEPO基因表达

(1)制备导入了hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的人正常成纤维细胞

(1-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将hEPO-14AΔqHAC载体导入人正常成纤维细胞HFL-1

将实施例18获得的携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的CHO杂交细胞5EF1Δ38和5EF1Δ63用作染色体供体细胞。人正常成纤维细胞HFL-1(获自RIKEN生物资源中心的细胞工程部门；编号RCB0521)用作染色体受体细胞。采用了根据实施例5(1-1)的方法。选择培养进行约2-4周后，分离发展的杀稻瘟素抗性集落，进行随后的分析。作为6次微核细胞融合操作的结果(5EF1Δ38进行两次，5EF1Δ63进行4次)，获得了56个药物抗性集落(8个来源于5EF1Δ38的克隆和48个来源于5EF1Δ63的克隆)。在上述集落中，用5EF1Δ38和5EF1Δ63作为染色体供体细胞获得的细胞在下文中分别称作tΔ38H细胞和Δ63H细胞。

(1-2)PCR分析

根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法，使用实施例3(1-2)的SVpANp1和Neo Rp2引物，和STS标记物，即D2S1334引物，通过PCR扩增检查人染色体是否携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体。同样，用CHO弗林蛋白酶基因特异性引物，即furin3’subF和furinEx6-28R，通过PCR扩增检查染色体供体CHO细胞的导入。设计的引物的序列如下所示。

furin3’subF：5’-ACTCAGAGATCCACTGCACCAGGATCCAAGGGAGG(SEQ ID NO：108)

furinEx6-28R：5’

-CCGCTCGAGCGGCTACACCACAGACACCATTGTTGGCTACTGCTGCC(SEQ ID NO：109)

反应在94℃下进行5分钟，然后是32个循环的94℃下变性20秒和随后的68℃下退火/延伸3分钟。当携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的HFL-1细胞不包括染色体供体CHO细胞时，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，用D2S1334引物推导约0.6kbp的扩增，用furin3’subF和furinEx6-28R推导无扩增。结果，在上文(1-1)获得的56株杀稻瘟素抗性株的总共39个株(即4株tΔ38H和35株tΔ63H)中观察到了具有推导的大小的条带。

这样，证实了上述39个杀稻瘟素抗性株是携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的HFL-1细胞。

(1-3)DNA印迹分析

为了检查hEPO-14AΔqF-HAC载体是否合适地携带hEPO表达单位，对来自上述39个杀稻瘟素抗性株的31个株(即3株Δ38H和28株tΔ63H)进行DNA印迹分析。该方法是根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行的。代表性的结果示于图71。从核苷酸序列推导的由XbaI消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hEPO表达单位。结果，在上文(1-2)中获得的28个携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的杀稻瘟素抗性株(3株tΔ38H和25株tΔ63H)中观察到了具有推导的大小的条带。

(1-4)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析，其中使用人14号染色体和人22号染色体特异性α-卫星DNA探针(Q-Biogene，Funakoshi)。作为(1-3)中获得的杀稻瘟素抗性株中8个株的分析结果，发现总共发现8个株是正常核型，在大多数观察的有丝分裂象中，在来源于宿主细胞的一对人14号染色体和人22号染色体的着丝粒区的4个位点中和来源于14AΔqΔneoHAC载体拷贝的位点中检测到了信号。结果示于图72A和图72B。

实验(1-1)-(1-4)证明了获得的8个杀稻瘟素抗性株是携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体并且具有正常核型的HFL-1细胞。

(2)用除去了新霉素抗性基因单位的hEPO-14AΔqΔneo-HAC载体在HFL-1细胞中表达hEPO基因

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文(1)中进行了长期传代培养的29株携带hEPO-14AΔqHAC载体的HFL-1细胞(tΔ38H4株和tΔ63H28株)以约10⁴个细胞的量铺板在I型胶原包被的24孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养皿中包含1ml含20％的DMEM培养基。在培养的细胞达到汇合后，培养进行7天，用1ml新鲜培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVDHuman EPO Immunoassay，R&D System)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验的结果的平均值在图21中的＂14AΔneo-HAC＂项中显示。

这样，在29株携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的HFL-1细胞(即3株tΔ38H和26株tΔ63H)中观察到了hEPO表达。

实施例20

分析hEPO-14AΔqΔneoHAC载体在人正常成纤维细胞中的长期EPO表达

(1)非选择性培养条件下的长期传代培养

为了证实hEPO-14AΔqΔneoHAC载体在人正常成纤维细胞HFL-1中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例23中获得的11株携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的HFL-1细胞(3株tΔ38H和8株tΔ63H)。非选择培养基是含20％ FBS的DMEM，选择培养基含有所述DMEM培养基和以3μg/ml添加到其中的杀稻瘟素。将1-3×10⁵个携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的HFL-1细胞铺于I型胶原包被的T-25烧瓶(Falcon)中，将细胞培养至约90％汇合的细胞密度，再次铺板1-3×10⁵个细胞，传代培养继续直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。在第5次传代前和后以及第10次传代后回收细胞，进行hEPO基因表达分析和FISH分析。

(2)长期传代培养后的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

将上文(1)中进行了长期传代培养的9株携带hEPO-14AΔqHAC载体的HFL-1细胞以约10⁴个细胞的量铺板在I型胶原包被的24孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养皿中包含1ml含有20％ FBS的DMEM培养基。在培养的细胞达到汇合后，培养进行7天，用1ml新鲜培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，然后对细胞数目进行计数。用hEPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPOImmunoassay，R&D System)对培养上清液中的hEPO进行定量。以双份进行的实验的结果的平均值示于图43的“14AΔneo”项中。

这样，在长期传代培养后，在上述8株携带hEPO-14AΔqΔneoHAC载体的HFL-1细胞中观察到了hEPO表达。

上述实验证明了在非选择性培养条件下长期传代培养后，hEPO-14AΔqΔneoHAC载体能够在HFL-1细胞中稳定保留，每个细胞的拷贝数可以保持，并且可以保持hEPO基因表达。

实施例21

构建除去了新霉素抗性基因单位的14NΔqHAC载体

(1)将FRT序列导入14NΔqHAC克隆位点

(1-1)构建用于导入FRT序列的GnpSF1-FRT载体

用ScaI和EcoRV消化实施例18中构建的t1pSF1-FRT载体，以制备包含FRT序列的7.4-kb DNA片段。用ScaI、BglII和EcoRV消化实施例6中构建的pSF1(G+n1)载体，以制备7.0-kb ScaI-BglII DNA片段和0.55kb BglII-EcoRV DNA片段，将得到的DNA片段导入所述7.4-kbDNA片段以制备包含FRT序列的GnpSFI-FRT载体。概要示于图73。最终的GnpSF1-FRT构建体的大小是大约15.0kb。图34A显示了导向载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因。

(1-2)将GnpSFI(FRT)载体导入携带14NΔqHAC的DT40细胞

通过用SrfI限制酶(Roche)消化，将GnpSF1(FRT)构建体线性化，通过电穿孔将产物导入携带去除了长臂远侧区的14NΔqHAC的杂交细胞。使用根据实施例1(2-2)的方法。此后使杀稻瘟素抗性集落发展2-3周。通过2次转染操作从G4n6Δp25分离总共240个药物抗性集落，进行随后的分析。

(1-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。根据实施例7(4-3)的方法，分析2个靶序列(在图34A中标为“5’基因组”和“3’基因组”)的存在。

发现获得的96株杀稻瘟素抗性DT40细胞，即G4n6Δp25sF中的52株产生具有从序列推导的大小的扩增产物(5’基因组：约5kb；3’基因组：约2kb)。

(1-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。根据实施例1(2-4)的方法分析同源重组的两个靶序列，即5’靶序列和3’靶序列的存在。代表性的结果示于图74。

作为5’基因组分析的结果，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是19.8kb，以野生型(即非重组)形式是7.6kb。作为3’基因组分析的结果，所述长度以同源重组体的形式是19.8kb，以野生型(即非重组)形式是8.8kb。从18株候选杀稻瘟素抗性株，即G4n6Δp25sF中，鉴定了16株同源重组体。

实验(1-1)-(1-4)证明获得了16株携带14NΔqF-HAC载体的DT40杂交细胞，即G4n6Δp25sF，其中通过同源重组在克隆位点插入了FRT序列。

实施例22

构建除去了新霉素抗性基因单位的14gNΔqHAC载体

(1)将FRT序列导入14gNΔqHAC克隆位点

(1-1)构建用于导入FRT序列的GnpSF1-FRT载体

用ScaI和EcoRV消化实施例18中构建的t1pSF1-FRT载体，以制备包含FRT序列的7.4kb DNA片段。用ScaI、HindIII和EcoRV消化实施例6中构建的pSF1(G+n1)载体，以获得5.4kb ScaI-HindIII DNA片段和0.45kb DNA HindIII-EcoRV片段。将得到的DNA片段导入所述7.4kbDNA片段以制备包含FRT序列的GnpSFI-FRT载体。概要示于图75。最终的GnpSF1-FRT构建体的大小是大约13.3kb。图34B显示了导向载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因。

(1-2)将gnpSF(FRT)载体导入携带14NΔqHAC的DT40

通过用SrfI限制酶(Roche)消化，将GnpSF1(FRT)构建体线性化，通过电穿孔将产物导入携带去除了长臂远侧区的14NΔqHAC的杂交细胞。使用根据实施例1(2-2)的方法。此后使杀稻瘟素抗性集落发展2-3周。通过2次转染操作从g5n7Δc3分离总共116个药物抗性集落，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(1-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列(即5’靶序列和3’靶序列)的存在。分析2个靶序列(在图34B中标为“5’基因组”和“3’基因组”)的存在。采用实施例7(4-3)的方法。

发现获得的116株杀稻瘟素抗性DT40细胞，即g5n7Δc3sF中的54株产生具有从序列推导的大小的扩增产物(5’基因组：约5kb；3’基因组：约2kb)。

(1-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。根据实施例1(2-4)的方法分析同源重组的两个靶序列，即5’靶序列和3’靶序列的存在。代表性的结果示于图76。

作为5’基因组分析的结果，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是11.8kb，以野生型(即非重组)形式是4.6kb。作为3’基因组分析的结果，所述长度以同源重组体的形式是15.6kb，以野生型(即非重组)形式是8.8kb。从36株候选杀稻瘟素抗性株，即g5n7Δc3sF中，鉴定了4株同源重组体。

实验(1-1)-(1-4)的结果证明获得了4株携带14NΔqF-HAC载体的DT40杂交细胞，即g5n7Δc3sF，其中通过同源重组在克隆位点插入了FRT序列。

实施例23

通过从人21号染色体去除长臂远侧区而制备21HAC(21AΔqHAC)载体

(1)用HAC载体将克隆位点(HPRT-重构位点)导入人21号染色体的长臂近侧区

(1-1)构建用于插入loxP和5’HPRT序列的kk载体

作为用于将loxP序列插入人21号染色体的长臂近侧区的基础质粒，使用V901(Lexicon genetics)。loxP将插入的人21号染色体的近侧区的DNA序列获自GenBank数据库(AP001657)。用于扩增同源重组的两个靶序列的寡核苷酸引物的序列如下所示。

#21CEN<1>1L：acctggaatttcctaccatcccccataa(SEQ ID NO：110)

#21CEN<1>1R：atctctccagagggacagcatcataccc(SEQ ID NO：111)

#21CEN<2>1L：cctgcaagttatgaccactggggatttt(SEQ ID NO：112)

#21CEN<2>1R：ctgcagtgagccgagatcataccactgt(SEQ ID NO：113)

用RsrII(NEB)从V830(Lexicon genetics)切下MC1-TK序列，然后克隆到V901质粒(V901T-1)的HindIII限制酶识别位点。随后，培养携带人21号染色体的小鼠A9杂交细胞(A9<21-2>，Shinohara et al.，HumMol Genet，10：1163，2001)，用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System)从细胞提取基因组DNA。获得的基因组DNA用作模板，用上述引物通过PCR扩增要重组的靶序列。反应在95℃下进行2分钟，随后是30个循环的95℃下变性15秒和68℃下退火4分钟。用限制酶EcoRI(Nippon Gene)和BglII(Nippon Gene)消化用SEQ ID NOs：110和111扩增的DNA片段(同源区1)，用限制酶XhoII(Promega)消化用SEQ ID NOs：112和113扩增的DNA片段(同源区2)，分离产物，并且在琼脂糖凝胶上纯化，然后克隆到V901质粒的EcoRI位点和BamHI或BglII位点。此外，将用AscI和KpnI切下的5’HPRT-loxP-潮霉素克隆到V901质粒的AscI和KpnI位点。通过将寡合成loxP序列和PGK潮霉素(hygro)序列(由Professor Lyons，I提供)克隆到V820(Lexicon genetics)的XbaI位点，制备5’HPRT-loxP-潮霉素。最终的插入了loxP的构建体的大小是13.5kb(下文称作“kk载体”)。图78显示了导向载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因。

(1-2)将kk载体导入携带人21号染色体的DT40细胞

用上述携带人21号染色体的A9<21-2>细胞作为染色体供体细胞，通过微细胞介导的染色体转移方法制备携带人21号染色体的DT杂交细胞。染色体受体DT40细胞在日本研究生物资源保藏中心(JCRB)以编号JCRB2221注册，并且可以由其获得。下文简述制备方法。

开始时，从大约1×10⁸个A9<21-2>细胞制备微细胞。在含有秋水仙酰胺(0.075μg/ml，脱羰秋水仙碱，Wako Pure Chemical Industries Ltd.)的培养基(含20％胎牛血清(FBS)和0.8mg/ml G418的DMEM)中将已经在12个25-cm²离心烧瓶(Nunc)中培养到约80％汇合的细胞密度的A9<21-2>细胞培养48小时，以诱导微核形成。在实施例中，使用了由Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.生产的DMEM。除去培养基后，将预热到34℃的松胞菌素B(在DMEM中为10μg/ml，Sigma)溶液装入离心烧瓶中，在34℃和8,000rpm下离心1小时。将微细胞悬浮于无血清的培养基(DMEM)中，回收，用装有孔径为8μm，5μm或3μm的滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)通过过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于6mlDMEM中。在含有10％ FBS，1％ CS和0.1mM 2-ME的RPMI 1640培养基中培养DT40细胞，用DMEM洗涤产物两次，将1×10⁷个细胞重悬于5ml DMEM中。室温和1,500rpm下将微细胞悬浮液离心5分钟，在其上覆盖DT40细胞悬浮液，室温和1,500rpm下离心5分钟，然后除去上清液。用聚乙二醇(PEG)1:1.4溶液进行细胞融合处理(Tomizuka etal.，Nature Genet.，U.S.A.，vol.16，pp.133-143，1997)90秒。将融合的细胞悬浮在含10％ FBS，1％鸡血清(ChS)和0.1mM 2-巯基乙醇(ME)的60mlRPMI 1640培养基(Invitrogen)中，将得到的悬浮液铺板于6个96孔板中，培养24小时，在含有1.5mg/ml G418的培养基中进行选择培养约2周。分离作为两次微细胞融合实验的结果而发展的药物抗性集落。通过PCR，分析人21号染色体中区域CBR、APP、TTC3和PCP4的存在，并且进一步进行使用人特异性探针Cot1，(Gibco BRL)的荧光原文杂交(FISH)分析来检验和获得携带人21号染色体拷贝的克隆，即DT40(21-2-3)。

随后，通过用NotI限制酶(Takara)消化将kk构建体线性化，将产物导入携带长臂远侧区已经被去除的人21号染色体的DT40杂交细胞中。将细胞(1×10⁷个DT40(21-2-3))悬浮于0.5ml RPMI培养基中。在30μg DNA存在下，使细胞在室温下静置10分钟，然后用Gene Pulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。将550V的电压施加于电容为25μF的电容器，然后用具有4mm的电极间距离的电穿孔细胞放电。使细胞在室温下静置10分钟后，将电穿孔的细胞悬浮于含10％ FBS，1％ ChS和0.1mM2-ME的RPMI 1640培养基中，将得到的悬浮液铺板在20个96孔板(Falcon)中。24小时后，加入潮霉素B(WAKO)到终浓度为1.5mg/ml，此后使抗性集落发展2-3周。分离通过20次转染操作获得的总共237个集落，使分离的集落生长，进行随后的分析(克隆名称：DT40(kk))。

(1-3)PCR分析

将潮霉素抗性株的基因组DNA用作模板来选择重组体，用如下所示引物，通过PCR检测两个靶序列，即5’靶序列和3’靶序列的存在。引物的位置示于图78。序列如下所示。

#21CEN<1>2L：5’-aaatgcatcaccattctcccagttaccc(SEQ ID NO：114)

PGKr1：5’-ggagatgaggaagaggagaaca(SEQ ID NO：115)

#21CEN<2>2R：5’-cctgttctatggttccagcctcacattg(SEQ ID NO：116)

hygF：5’-GAATTCAGCGAGAGCCTGAC(SEQ ID NO：117)

使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，并且反应在下述条件下进行。5’基因组分析(SEQ ID NOs：114-115)在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸10分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸10分钟，25个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸5分钟，并且72℃下延伸10分钟。3’基因组分析(SEQ ID NOs：116-117)在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸6分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸6分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸7分钟，并且72℃下延伸10分钟。在PCR溶液中加入MgSO₄(终浓度：0.5mM)。仅仅在发生了定点重组的克隆中在5’侧检测到4.5-kb条带，在3’侧检测到6.5-kb条带。在阴性对照DT40和DT40(21-2-3)中没有检测到条带。重组频率是约20％，即，在237个克隆中的46个克隆中发生重组。

(1-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。为了制备探针，用下文显示的寡核苷酸引物对，和作为模板的、携带人21号染色体的A9<21-2>细胞的基因组DNA进行PCR，分离产物，并且分离和纯化产物。在同源重组的靶序列外指定两种类型的探针，即5’探针-1(SEQ ID NOs：118-119)和3’探针-10(SEQ ID NOs：120-121)(图78)。

21qA5-1L：5’-caggcaactgtaacacagtggtaggta(SEQ ID NO：118)

21qA5-1R：5’-aacagtagagcaatttcaggcaggtc(SEQ ID NO：119)

21qA3-3L：5’-cgcagcttttagctgaactaaggaga(SEQ ID NO：120)

21qA3-3R：5’-gtgacacagggatactctgtccaaaa(SEQ ID NO：121)

用SphI限制酶(Roche)消化从通过初次筛选获得的12个株提取的基因组DNA(约5μg)，通过Ausubel et al.(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。通过Typhoon9210图像分析仪(Molecular Dynamics)检测与32P-标记的探针杂交的信号。作为5’基因组分析的结果，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是6.1kb，作为3’基因组分析的结果，它以同源重组体的形式是6.0kb，作为5’基因组分析和3’基因组分析的结果，它以野生型(即非重组)形式是11.5kb。在所有12个分析的株中鉴定同源重组体。

(1-5)荧光原位杂交(FISH)分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。在上述(1-4)中观察到了重组的克隆中，用人cot-1 DNA和潮霉素(通过从kk载体切割而制备)作为探针，对6个克隆进行FISH分析，人21号染色体不易位到所有克隆的宿主染色体，并且在长臂近侧区中检测到了来源于潮霉素的信号。这证明发生了定点重组。

上述(1-1)-(1-5)证明了可以通过同源重组将5’-HPRT-loxP-hygro-TK插入人21号染色体的近侧区，即AP001657。

(2)通过端粒截短从人21号染色体去除长臂

(2-1)构建用于端粒截短的pTELhisD-21q载体

作为用于去除人21号染色体的长臂远侧区的端粒截短载体(导向载体)，使用pTELhisD(Kuroiwa et al.，Nature Biotech.，U.S.A.，vol.18，pp.1086-1090，2000)。基于从GenBank数据库获得的人21号染色体的长臂远侧区的核苷酸序列(编号AP001657)，设计了用于插入端粒截短载体的靶序列。下文示出了通过PCR对其进行扩增的寡核苷酸引物的序列。

q1L：5’-ggagcaacaggacctctcattccttgtt(SEQ ID NO：122)

q1R：5’-ccaatgtcaggcactcctgctctaaatg(SEQ ID NO：123)

培养携带人21号染色体的小鼠A9杂交细胞(A9<21-2>，Shinohara etal.，Hum Mol Genet，10：1163，2001)，用Puregene DNA分离试剂盒(GentraSystem)从细胞提取基因组DNA。获得的基因组DNA用作模板，用上述引物通过PCR扩增要重组的靶序列。约0.1μg基因组DNA用作模板，用GeneAmp9700热循环仪(Applied Biosystems)根据Innis et al.(PCRExperimental Manual，HBJ Press，1991)进行PCR。使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，并且反应在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸10分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸10分钟，25个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸10分钟，并且72℃下延伸10分钟。用BamHI限制酶(Roche)消化7.0-kb扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离具有粘端的DNA片段，然后纯化。然后将产物克隆到pTELhisD质粒的BamHI位点中。最终的pTELhisD-21q构建体的大小是大约14.4kb。图79显示了端粒截短载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因。

(2-2)将端粒截短载体导入携带人21号染色体的DT40细胞

通过用SrfI限制酶消化将pTELhisD-21q构建体转化为线性DNA，将产物导入实施例23(1)制备的携带人21号染色体的DT40杂交细胞中，所述人21号染色体包含导入长臂近侧区的loxP。将1×10⁷个DT40(kk139)细胞悬浮于0.5ml RPMI培养基中，使产物在30μg DNA存在下在室温下静置10分钟，然后用Gene Pulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。将550V的电压施加于电容为25μF的电容器，然后用具有4mm的电极间距离的电穿孔细胞放电。使细胞在室温下静置10分钟后，将电穿孔的细胞悬浮于含10％ FBS，1％ ChS和0.1mM 2-ME的RPMI 1640培养基中，将悬浮液铺板在20个96孔板(Falcon)中。24小时后，加入组氨醇(L-组氨醇二盐酸盐，Sigma)到终浓度为0.5μg/ml，此后使抗性集落发展2-3周。分离通过5次转染操作获得的总共105个药物抗性集落，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(2-3)PCR分析

将组氨醇抗性细胞的基因组DNA用作模板来通过PCR鉴定人21号染色体上的基因的基因组区的存在。基因组区的寡核苷酸引物的序列如下所示。

CBR-L：5’-gatcctcctgaatgcctg(SEQ ID NO：124)

CBR-R：5’-gtaaatgccctttggacc(SEQ ID NO：125)

APP-L：5’-ctgggcaatagagcaagacc(SEQ ID NO：126)

APP-R：5’-acccatattatctatggacaattga(SEQ ID NO：127)

TTC3-L：5’-tggacaaatataaggcatgttca(SEQ ID NO：128)

TTC3-R：5’-gtcaccttcctctgcctttg(SEQ ID NO：129)

PCP4-L：5’-gaattcactcatcgtaacttcattt(SEQ ID NO：130)

PCP4-R：5’-ccttgtaggaaggtatagacaatgg(SEQ ID NO：131)

将大约0.1μg基因组DNA用作模板，通过PCR扩增上述4种类型的基因组区(Innis et al.，supra)。使用Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，反应在94℃下进行5分钟，然后是35个循环的94℃下变性15秒，60℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒。当通过端粒截短去除长臂远侧区时，用上述4种类型的引物可能不能实现检测。随后，用下文所示引物检查用上述引物没有检测的10个克隆是否发生了定点同源重组。引物的位置示于图79。序列如下所示。

q4L：5’-ctgcaatctttacctccctggttcaagc(SEQ ID NO：132)

SK23：5’-ggccgctctagaactagtggatc(SEQ ID NO：133)

10个克隆中，仅仅在发生了定点重组的2个克隆中检测到了7.5-kb条带。在阴性对照，即DT40和DT40(21-2-3)中没有检测到条带。

(2-4)荧光原位杂交(FISH)分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)和FITC标记的hisD片段(通过从pTELhisD载体切割而制备)作为探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。结果，在大多数观察的有丝分裂象中检测到了缩短的人21号染色体和位于Cot1染色的缩短的人21号染色体的长臂末端的两个FITC信号。基于相对于宿主DT40细胞染色体的大小，证实了人21号染色体已经缩短。

这样，发现获得的两个组氨醇抗性株已经从人21号染色体进行了长臂去除。

(3)将克隆位点(neo重建位点)导入21AΔqHAC的长臂近侧区

(3-1)构建用于插入loxP、3’neo和FRT序列的pSF1(FRT)-C载体

作为用于将loxP、3’neo和FRT序列插入实施例23(2)中制备的人类人工染色体(HAC)的基础质粒，使用了实施例18(1)中制备的t1pSF1(FRT)。要插入loxP、3’neo和FRT序列的人21号染色体的长臂近侧区的核苷酸序列获自GenBank数据库(编号AP001657)。用于扩增同源重组的两个靶序列的寡核苷酸引物的序列如下所示。

AP001657-55852F_PacI：5′-gcgTTAATTAAaccgattaactgttcttttccagta(SEQID NO：134)

AP001657-59245R_NheI：

5′-gcGCTAGCgAAGTCAAAAGAAGTAACTTCTTTCTCT(SEQ ID NO：135)

AP001657-59828F_SalI：5′-gacagtGTCGACaagtcaaaagaagtaacttctatc(SEQID NO：136)

AP001657-62657R_SrfI：

5′-gatGCCCGGGCGTTTCCATGAAGGATATTAATCAGT(SEQ ID NO：137)

从携带人21号染色体的A9<21-2>细胞提取的基因组DNA用作模板，以便通过PCR扩增两个靶序列。用PacI和NheI(Roche)消化用SEQID NOs：134和135扩增的约3.4kb的DNA片段(即同源区1)，用限制酶SalI和SrfI(Roche)消化用SEQ ID NOs：136和137扩增的约2.8kb的DNA片段(即同源区2)，通过琼脂糖凝胶电泳分离具有粘端的DNA片段，然后纯化。随后，将以下3个DNA片段，即，用限制酶消化的同源区1的DNA片段、用NheI和ScaI消化的t1pSF1(FRT)质粒(在实施例18(1)中制备)以及用ScaI和PacI消化的实施例1(2-1)中获得的pSF1③进行三片段连接。用SalI和SrfI消化载体，将限制酶消化的同源区2克隆到其中，以获得pSF1(FRT)-C。最终的pSF1(FRT)-C构建体的大小是大约12.6kb。图80和图81各自显示导向载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因。

(3-2)将pSF1(FRT)-C载体导入携带21AΔqHAC的DT40细胞

通过用SrfI限制酶(Roche)消化将pSF1(FRT)-C构建体线性化，将产物导入携带长臂远侧区被去除的21AΔqHAC的DT40杂交细胞中。将DT40(kkq79)细胞(1×10⁷个细胞)悬浮于0.5ml RPMI培养基中，使得到的悬浮液在30μg DNA存在下在室温下静置10分钟，然后用GenePulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。将550V的电压施加于电容为25μF的电容器，然后用具有4mm的电极间距离的电穿孔细胞放电。使细胞在室温下静置10分钟后，将电穿孔的细胞悬浮于含10％ FBS，1％ ChS和0.1mM 2-ME的RPMI 1640培养基中，将悬浮液铺板在20个96孔板(Falcon)中。24小时后，加入杀稻瘟素(杀稻瘟素S盐酸盐，Funakoshi)到终浓度为8μg/ml，此后使抗性集落发展2-3周。分离通过4次转染操作获得的51个药物抗性集落，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(3-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列，即5’靶序列和3’靶序列的存在。通过将这两个靶序列夹心(在图81中标为“5’基因组”和“3’基因组”)，分别在染色体上和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置由图81中的箭头指出。序列如下所示。

bsdF：5’-caacagcatccccatctctg(SEQ ID NO：138)

bsdR：5’-gctcaagatgcccctgttct(SEQ ID NO：139)

用SEQ ID NOs：138-116(5’基因组)所示或SEQ ID NOs：139-114(3’基因组)所示引物进行PCR。

使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，并且反应在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸6分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸6分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸7分钟，并且72℃下延伸10分钟。在PCR溶液中加入MgSO₄(终浓度：0.5mM)。

在51株获得的杀稻瘟素抗性DT40细胞中，发现23株产生具有从核苷酸序列推导的大小的扩增产物(5基因组：约6.7kb；3基因组：约6.1kb)。

(3-4)DNA印迹分析

作为用于选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。使用实施例1(1-4)中采用的5’探针-1和3’探针-10。

用SphI限制酶(Roche)消化从通过初次筛选获得的6个株提取的基因组DNA(约5μg)，通过Ausubel et al.(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。通过Typhoon9210图像分析仪(Molecular Dynamics)检测与³²P-标记的探针杂交的信号。作为5’基因组分析的结果，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是7.8kb，在DT40(kkq79)(非重组细胞)的情况下是6.1kb。作为3’基因组分析的结果，所述长度以同源重组体的形式是9.5kb，在DT40(kkq79)(非重组细胞)的情况下是6.0kb。在所有6个分析的株中鉴定了同源重组体。

(3-5)荧光原位杂交(FISH)分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。用人cot-1 DNA和杀稻瘟素(通过从pCMV/Bsd载体切割而制备)作为探针，对上述(3-4)中观察到重组的6个克隆进行FISH分析。结果，人21号染色体不易位到所有克隆的宿主染色体，并且在长臂近侧区中检测到了来源于杀稻瘟素的信号。这证明发生了定点重组。

作为实验(3-1)-(3-5)的结果，获得了6株携带21AΔqHAC载体的DT40杂交细胞(DT40(21qAHAC)-2，13，16，29，39和51)，所述载体中通过同源重组插入了克隆位点(loxP序列)、3’neo和FRT序列。

(4)将21AΔqHAC载体导入CHO细胞

(4-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将21AΔqHAC载体导入CHO细胞

将携带实施例23(3)获得的21AΔqHAC载体的DT40杂交细胞(DT40(21qAHAC)-2，39和51)用作染色体供体细胞，所述载体是通过去除长臂远侧区并且插入克隆位点(loxP、3’neo和FRT序列)而获得的。将来源于中国仓鼠的CHO-K1细胞(编号JCRB9018)用作染色体受体细胞。

开始时，从大约10⁹个DT40杂交细胞制备微细胞。在含有秋水仙酰胺(0.05μg/ml，Invitrogen)的培养基(含10％ FBS，1％ ChS，和0.1mM2-巯基乙醇的RPMI 1640)中将已经培养到约60-70％汇合的细胞密度的DT40杂交细胞培养13-18小时，以诱导微核形成。通过离心回收细胞，重悬于无血清的DMEM中，铺于12个25-cm²离心烧瓶(Nunc)中，所述烧瓶提前用聚L-赖氨酸包被过。使产物在37℃下静置1小时，在细胞贴壁后除去培养基，将预热到37℃的松胞菌素B(在DMEM中为10μg/ml，Sigma)溶液装入离心烧瓶中，将烧瓶插入离心机中，在34℃和8,000rpm下离心1小时。将微细胞悬浮于无血清的培养基(DMEM)中，回收，用装有孔径为8μm，5μm或3μm的滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)通过过滤纯化，然后悬浮于5ml DMEM中。室温和1,500rpm下将微细胞悬浮液离心5分钟，在其上覆盖已经用DMEM洗涤两次然后悬浮于5ml DMEM中的约10⁷个CHO-K1细胞，室温和1,500rpm下离心5分钟，然后除去上清液。将细胞在含45％聚乙二醇1500(PEG 1500，Roche)和10％ DMSO(Sigma)的DMEM溶液中进行融合处理120秒，将产物悬浮于120ml含10％ FBS的F12培养基(Invitrogen)中，将悬浮液铺板于5个48孔板(Falcon)中，此后在含杀稻瘟素(8μg/ml)的选择培养基(含10％ FBS的F12)中将产物培养24-36小时。选择培养进行约2周后，分离发展的药物抗性集落，进行随后的分析。通过3次微核细胞融合操作，获得了总共16株杀稻瘟素抗性CHO株(即，8个来源于DT40(21qAHAC)-2的株，3个来源于DT40(21qAHAC)-39的株，和5个来源于DT40(21qAHAC)-51的株)。

(4-2)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，通过PCR检测两个靶序列，即5’靶序列和3’靶序列的存在。使用根据实施例1(3-3)的方法。发现获得的16株杀稻瘟素抗性CHO细胞中的11株产生具有从核苷酸序列推导的大小的扩增产物(5’基因组：约6.7kb；3’基因组：约6.1kb)。

(4-3)FISH分析

使用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。作为分析10个杀稻瘟素抗性CHO株的结果，发现总共3株(CHO(21qA-HAC)-5，6，17)是正常核型，在大多数观察到的有丝分裂象中检测到Cot1染色的21AΔqHAC载体的拷贝。

上述实验(4-1)-(4-3)证明获得的3个杀稻瘟素抗性CHO株携带21AΔqHAC载体。

实施例24

分析21AΔqHAC载体在CHO细胞中的长期稳定性

(1)在非选择性培养条件下长期传代培养

为了证实21AΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例1中描述的3株CHO细胞(CHO(21qA-HAC)-5，6和17)。非选择培养基是含有10％ FBS的F12培养基，选择培养基含有所述F12培养基和以8μg/ml添加到其中的杀稻瘟素。将5.0×10⁵个CHO细胞铺于10-cm培养皿中，对已经培养至约80-90％汇合的细胞密度的细胞进行计数，将5.0×10⁵个细胞再次铺板在10-cm培养皿中，传代培养继续进行直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。第10次传代后回收CHO株，制备FISH染色体样品。

(2)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。结果示于表9。

表9：21AΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性

 

HAC细胞群传代培养次数      HAC保留(％)无药物选择    有药物选择CHO(21qA-HAC)-5CHO(21qA-HAC)-6CHO(21qA-HAC)-17培养开始时10培养开始时10培养开始时10-             9896            94-             10090            96-             10094            98

21Aδqhac载体在长期传代培养后在CHO细胞中稳定保留。作为中期染色体图的观察结果，每个细胞检测到1或2个信号。

根据实施例2中所示的图13，WO 2004/031385中公开的21δqhac在培养开始时在“有药物选择”的条件下在CHO细胞中表现出的HAC保留(％)是86％。培养进行7周后，HAC保留在“无药物选择”的条件下是66.0％，在“有药物选择”的条件下是86.0％。因此，在长期培养后，本发明的来源于21号染色体的新的HAC载体，即21Aδqhac，将没有显著损失，与常规HAC载体相比，发现它是显著稳定的HAC载体。

实验(1)和(2)证明21Aδqhac载体可以在非选择性培养条件下在CHO细胞中稳定保留，并且可以保持每个细胞的拷贝数。

实施例25

用heDo-21Aδqhac载体在CHO细胞中分析hepo基因表达

(1)构建hepo-21Aδqhac载体

(1-1)将hepo基因导入21Aδqhac载体中

将hepo基因表达单位插入实施例23中构建的21Aδqhac载体中。制备含有loxP序列的hepo表达质粒，瞬时表达Cre重组酶以便通过loxP序列之间的定点重组将基因表达单位插入人工染色体。用G418抗性的获得(即启动子-片段化的新霉素抗性基因表达单位的重建)作为指示物选择包含插入序列的重组体。其概要示于图77。

用胰蛋白酶处理实施例1制备的携带21Aδqhac载体的CHO杂交细胞(CHO(21qa-HAC)-5和6)，将5×10⁶个细胞悬浮于0.8ml Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中。在10μg含有loxP序列的hepo表达质粒pln1-EPO(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)和10μg Cre酶表达载体pbs185(Life-Tech)的存在下，用Gene Pulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。将450V的电压施加于电容为500μF的电容器，然后用具有4mm的电极间距离的电穿孔细胞放电。将电穿孔的细胞铺板在5个含有F12培养基(Invitrogen)的48孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养基包含10％ FBS。2天后，用含有0.8mg/ml G418(遗传霉素，Invitrogen)的培养基更换培养基。此后使G418抗性集落发展2-3周，分离总共48个集落(20个来源于CHO(21qa-HAC)-5的集落和28个来源于CHO(21qa-HAC)-6的集落)，使分离的集落生长，进行随后的分析。

(1-2)PCR分析

(1-2)PCR分析

使用svpanp1和Neo Rp2引物，通过PCR检查hEPO基因表达单位是否插入到21Aδqhac载体的loxP序列的位点中，从而选择包含插入其中的hEPO基因表达单位的重组体，所述引物是在pln1-EPO载体和21Aδqhac载体上设计的，以夹心loxP序列的位点。同样，用pbs226质粒载体的M13RV和Neo Rp2引物通过PCR检查插入的hepo基因的扩增，从而选择它。根据Kakeda et al.(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法确定引物序列和PCR条件。在包含插入序列的重组体的情况下，用svpanp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，并且用M13RV和Neo Rp2引物推导约2.7kbp的扩增。作为结果，在上文(1-1)中获得的G418抗性CHO杂交细胞中的总共40株观察到了推导的扩增。因此，发现上述40个G418抗性CHO杂交细胞株包含通过重组而插入loxP序列中的hEPO基因表达单位。

(1-3)DNA印迹分析

为了检查Hepo-21Aδqhac载体是否合适地携带hepo表达单位，进行DNA印迹分析。根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行该方法。由核苷酸序列推导的xbai消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hepo表达单位(图14)。分析了(1-2)中获得的候选G418抗性CHO杂交细胞中的6株。结果，在总共3株(CHO(21qahace-13，14和37)中观察到了具有推导的大小的条带。

(2)插入21Aδqhac载体中的hepo基因的表达

通过在培养上清液中产生的hepo蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对Hepo基因的表达进行定量。

将6株实施例103(1-3)中分离的携带hepo-21Aδqhac载体的G418抗性CHO杂交细胞以约10⁵个细胞的量铺板在12孔组织培养塑料培养皿(Falcon)上，该培养皿包含2ml含有10％ FBS和0.8mg/ml G418的F12培养基。培养的细胞达到汇合后，用2ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养进行2天，用1ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养再进行24小时，回收上清液，对细胞数目进行计数。用HepoELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay，R&D Systems)对培养上清液中的hEPO进行定量。

这样，在所有6株携带hEPO-21AΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞中观察到了hEPO表达。

(3)FISH分析

根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法，用人特异性Cot1(Invitrogen)探针进行FISH分析。分析了上述(1-3)中获得的G418抗性CHO杂交细胞中的6株。结果，在总共5株的大多数观察到的有丝分裂象中检测到了正常核型和Cot1染色的hEPO-21AΔqHAC载体的拷贝。

上述实验(1)证明了得到的5个G418抗性株是携带hEPO-21AΔqHAC载体并且具有正常核型的CHO细胞。

实施例26

分析hEPO-21AΔqHAC载体在CHO杂交细胞中的长期稳定性

(1)在非选择性培养条件下长期传代培养

为了证实hEPO-21AΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下和选择性培养条件下(对照组)进行长期传代培养。使用了实施例25中获得的2株CHO杂交细胞(CHO(21qA-HACE)-13和14)。非选择培养基是含有10％ FBS的F12培养基，选择培养基含有所述F12培养基和以0.8mg/ml添加到其中的G418。将5.0×10⁵个CHO细胞铺于10-cm培养皿中，对已经培养至约80-90％汇合的细胞密度的细胞进行计数，将5.0×10⁵个细胞再次铺板在10-cm培养皿中，传代培养继续进行直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。第10次传代后回收CHO株，进行hEPO基因表达分析和FISH分析。

(2)长期传代培养后的hEPO基因表达

通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。根据实施例3(2)的方法分析上述(1)中进行了长期传代培养的2株携带hEPO-21AΔqHAC载体的CHO杂交细胞。结果，在长期传代培养后，在2株携带hEPO-21AΔqHAC载体的CHO杂交细胞中都观察到了hEPO表达。

(3)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。以双份测量群体倍增水平和HAC保留，确定其结果的平均值。关于上述2株的结果示于表10。

表10：hEPO-21AΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性

 

HAC细胞群传代培养次数      HAC保留(％)无药物选择    有药物选择CHO(21qA-HACE)-13CHO(21qA-HACE)-14培养开始时10培养开始时10-              9590             92-              9592             96

hEPO-21AΔqHAC载体在长期传代培养后在CHO细胞中稳定保留。作为中期染色体图的观察结果，每个细胞检测到1或2个信号。

上述实验(1)-(3)证明hEPO-21AΔqHAC载体可以在非选择性培养条件下长期传代培养后在CHO细胞中稳定保留，可以保持每个细胞的拷贝数，并且可以保持hEPO基因表达。

实施例27

构建除去了新霉素抗性基因单位的hEPO-21AΔqΔneo-HAC载体

21AΔq-HAC载体和pLN1/EPOF质粒(在实施例18(3)中制备)各自包含插入hEPO表达单位下游的位点中的FRT序列。用FRT/FLPe定点重组系统从hEPO-21AΔq-HAC载体除去新霉素抗性基因表达单位。概要示于图82。

(1)从hEPO-21AΔq-HAC载体除去新霉素抗性基因单位

(1-1)通过FLPe除去新霉素抗性基因单位

在实施例25制备的携带hEPO-21AΔqF-HAC载体的CHO细胞中瞬时表达实施例18(5-1)制备的FLPe重组酶，以便通过FRT序列之间的定点重组从人工染色体切割和除去新霉素抗性基因单位。用新霉素抗性基因单位的缺失作为指示物来选择包含插入序列的重组体。

用胰蛋白酶处理携带hEPO-21AΔq-HAC载体的CHO细胞(CHO(21qA-HACE)-13和CHO(21qA-HACE)-14)，将5×10⁶个细胞悬浮于0.8ml Hank氏平衡盐溶液(HBSS)。在20-100μg FLPe酶表达载体pOG44FLPe的存在下，用Gene Pulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。将450V的电压施加于电容为500μF的电容器，然后用具有4mm的电极间距离的电穿孔细胞放电。将电穿孔的细胞铺板在8个含有F12培养基(Invitrogen)的96孔组织培养塑料培养皿(Falcon)中，所述培养基包含10％ FBS(4个板中是1个细胞/孔；4个板中是0.1个细胞/孔)。此后使杀稻瘟素抗性集落发展2-3周，分离总共120个集落(60个来源于CHO(21qA-HACE)-13的集落和60个来源于CHO(21qA-HACE)-14的集落)，将相同的克隆铺板在两个不同的24孔板上，一个板上的克隆在杀稻瘟素中培养，另一个板上的克隆在G418和杀稻瘟素中培养。认为在含有G418的孔中死亡的克隆缺乏neo基因。由于G418而死亡的克隆的数目是120个克隆中的12个克隆(即3个来源于CHO(21qA-HACE)-13的克隆和9个来源于CHO(21qA-HACE)-14的克隆)。对这些克隆进行随后的分析。

(1-2)PCR分析

用在pLN1-EPOF载体上和在21AΔqHAC载体上设计的引物SVpANp1和Neo Rp2检查是否从hEPO-21AΔq-HAC载体除去了新霉素抗性基因单位。也用pBS226质粒载体上的引物M13RV和Neo Rp2检查插入的hEPO基因。根据Kakeda et al.(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法确定引物序列和PCR条件。在包含插入其中的Neo盒的重组体的情况下，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，并且用M13RV和Neo Rp2引物推导约2.7kbp的扩增。如果已经除去了新霉素抗性基因单位，则不能用上述两类引物检测到扩增产物。作为结果，在上文(1-1)中获得的12株非G418抗性CHO杂交细胞中的总共10株中没有观察到推导的扩增产物。这证明已经从上述10株Bsd抗性和非G418抗性CHO杂交细胞中的每一株细胞除去了新霉素抗性基因单位。

(1-3)DNA印迹分析

进行DNA印迹分析，以便检查是否从hEPO-21AΔq-HAC载体除去了新霉素抗性基因单位。根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)进行该方法。当片段仅仅包含hEPO表达单位，同时已经除去了新霉素抗性基因时，由核苷酸序列推导的EcoRI消化得到的限制酶片段的长度是4.9kb。当片段包含新霉素抗性基因单位和hEPO表达单位这两者时，所述长度是7.6kb。在实施例27(1-1)中获得的12株候选CHO杂交细胞(即3个来源于CHO(21qA-HACE)-13的株和9个来源于CHO(21qA-HACE)-14的株)中的10株(即2个来源于CHO(21qA-HACE)-13的株和8个来源于CHO(21qA-HACE)-14的株)中检测到了具有推导的大小的条带。这样，在上述10株CHO杂交细胞中观察到了新霉素抗性基因单位的除去。除去了新霉素抗性基因单位的hEPO-21AΔqF-HAC载体在下文中称作“hEPO-21AΔqΔneo-HAC载体”。

(1-4)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。分析了上述(5-3)中获得的10株候选CHO杂交细胞。结果，在总共4株(CHO(21qAHACEΔ)-4，8，10和11)的大多数观察的有丝分裂象中检测到了正常核型和Cot1染色的hEPO-21AΔqΔneo-HAC载体的拷贝。

实验(1-1)-(1-4)证明了所述上述4株CHO杂交细胞携带hEPO-21AΔqΔneo-HAC载体并且具有正常核型。

实施例28

通过用Cre-loxP从人21号染色体去除长臂远侧区而制备的21HAC(21NΔqHAC)载体的构建

通过同源重组将loxP序列插入长臂远侧区和近侧区，以使得HAC载体将包含人21号染色体末端的端粒序列和短亚端粒序列(约8kb)的方式用Cre酶通过定点重组切割和去除两个loxP序列之间的区域。这样，构建了长臂远侧区被去除的人工染色体(21NΔqHAC)载体。

(1)通过定点重组从人21号染色体去除长臂

(1-1)构建用于将loxP序列插入人21号染色体的端粒长臂远侧区的NT载体

将V901(Lexicon genetics)用作用于插入loxP序列的基础质粒。用RsrII(NEB)从V830(Lexicon genetics)切下MC1-TK序列，然后克隆到V901质粒(克隆名称：V901T-2)的BamHI限制酶的识别位点。要插入LoxP的人21号染色体的远侧区的核苷酸序列获自GenBank数据库(NT_011515)。用于扩增同源重组的两个靶序列的寡核苷酸引物的序列如下所示。

#21NT1L：5’-gaatgtcccccattgtcacttcatgttc(SEQ ID NO：140)

#21NT1R：5’-ggcaagcttagtccagttgggaaactgatgggttcat(SEQ ID NO：141)

#21NT3L：5’-ggcgaattcggattgagagacacacatagctggtca(SEQ ID NO：142)

#21NT3R：5’-ggcgaattctgtcaacctgccagttctcaggagttt(SEQ ID NO：143)

从携带人21号染色体的A9<21-2>细胞提取的基因组DNA用作模板来通过PCR扩增靶序列。用上述引物和LA Taq聚合酶(Takara ShuzoCo.，Ltd.)使反应在95℃下进行2分钟，随后是30个循环的95℃下变性15秒和68℃下退火4分钟。用限制酶EcoRI(Nippon Gene)或HindIII(Nippon Gene)消化产物，在琼脂糖凝胶上分离和纯化，然后克隆到V901T-2质粒的EcoRI或HindIII位点。此外，将用AscI和KpnI切割的3’HPRT-loxP-BS克隆到V901T-2质粒的AscI和KpnI位点。通过将寡合成loxP序列和CMV-BS序列(Invitrogen)克隆到V820(Lexicongenetics)的XbaI位点，制备3’HPRT-loxP-BS。包含插入其中的loxP的最终构建体的大小是13kb。图83显示了导向载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因。

(1-2)用于将loxP序列插入DT40细胞的端粒长臂远侧区的NT载体的构建，所述细胞携带包含插入长臂近侧区的loxP的人21号染色体

根据实施例1(1-2)的方法，通过用NotI限制酶消化，将NT构建体转化为线性化的DNA，然后导入DT40杂交细胞DT40(kk139)，所述细胞携带实施例23(1)制备的包含插入长臂近侧区中的loxP的人21号染色体。用杀稻瘟素(终浓度：8ug/ml)进行选择培养，此后使药物抗性集落发展2-3周。分离通过两次转染操作获得的总共12个杀稻瘟素抗性集落，使分离的集落生长，然后进行随后的分析。

(1-3)PCR分析

将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，根据实施例6(1-1)的方法通过PCR检测5’靶序列和3’靶序列的存在。通过将这两个靶序列(在图83中标为“5’基因组”和“3’基因组”)夹心，分别在染色体和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置在图83中用箭头表示。序列如下所示。

#21NT1L：5′-CATTCATGGTAGTCATTGGTGCTGTTCTCC(SEQ ID NO：144)

#21NT7R：5′-ACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTG(SEQ IDNO：145)

用引物对SEQ ID NOs：138和145(3’-基因组序列)或引物对SEQ IDNOs：139和144(5’-基因组序列)进行PCR。

在上述12个杀稻瘟素抗性株中，在5个株中检测到了5’靶序列和3’靶序列的存在。

(1-4)DNA印迹分析

作为选择同源重组体的筛选方法，进行了DNA印迹分析。在同源重组的3’靶序列内指定探针(图83)。为了制备探针，用下文显示的寡核苷酸引物对，和作为模板的、携带人21号染色体的A9<21-2>细胞的基因组DNA进行PCR，分离产物，并且纯化(指定为3’-探针-6)。

21qN3-2L：5’-ctggaagacactgagataaccatgacc(SEQ ID NO：146)

21qN3-2R：5’-ctgagaagttccacaatagcctgtctc(SEQ ID NO：147)

用KpnI限制酶(Roche)消化从通过初次筛选获得的5个株提取的基因组DNA(约5μg)，通过Ausubel et al.(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。通过Typhoon9210图像分析仪(Molecular Dynamics)检测与标记的探针杂交的信号。从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是7.6kb，以野生型(即非重组)形式是23kb。从5个候选株鉴定了总共两株同源重组体(DT40(kkNT)-7和11)。对这两个克隆进行随后的步骤(3)。

(2)将包含导入长臂近侧区和远侧区的loxP的人21号染色体导入CHO细胞

(2-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将修饰的人21号染色体导入CHO细胞

将实施例28(1)制备的携带包含导入长臂近侧区和远侧区的loxP的人21号染色体的DT40杂交细胞(DT40(kkNT)-7，11)用作染色体供体细胞。来源于中国仓鼠的CHO hprt缺陷细胞用作染色体受体细胞(获自Health Science Research Resources Bank；编号JCRB0218)。

开始时，从大约10⁹个DT40杂交细胞制备微细胞。在含有秋水仙酰胺(0.05μg/ml，Invitrogen)的培养基(含10％ FBS，1％ ChS，和0.1mM2-巯基乙醇的RPMI 1640)中将已经培养到约60-70％汇合的细胞密度的DT40杂交细胞培养13-18小时，以诱导微核形成。通过离心回收细胞，重悬于无血清的DMEM中，铺于12个25-cm²离心烧瓶(Nunc)中，所述烧瓶提前用聚L-赖氨酸包被过。使产物在37℃下静置1小时，在细胞贴壁后除去培养基，将预热到37℃的松胞菌素B(在DMEM中为10μg/ml，Sigma)溶液装入离心烧瓶中，将烧瓶插入离心机中，在34℃和8,000rpm下离心1小时。将微细胞悬浮于无血清的培养基(DMEM)中，回收，用装有孔径为8μm，5μm或3μm的滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)通过过滤纯化，然后悬浮于5ml DMEM中。室温和1,500rpm下将微细胞悬浮液离心5分钟，在其上覆盖已经用DMEM洗涤两次然后悬浮于5ml DMEM中的约10⁷个CHOhprt-/-细胞，室温和1,500rpm下离心5分钟，然后除去上清液。将细胞在含45％聚乙二醇1500(PEG 1500，Roche)和10％ DMSO(Sigma)的DMEM溶液中进行融合处理120秒，将产物悬浮于120ml含10％ FBS的F12培养基(Invitrogen)中，将得到的悬浮液铺板于5个48孔板(Falcon)中，此后在含杀稻瘟素(8μg/ml)的选择培养基(含10％ FBS的F12)中将产物培养24-36小时。选择培养进行约2周后，分离发展的药物抗性集落，进行随后的分析。通过两次微核细胞融合操作，获得了总共10个杀稻瘟素抗性CHOhprt-/-株(即5个来源于DT40(kkNT)-7的株和5个来源于DT40(kkNT)-11的株)。

(2-2)PCR分析

通过实施例23(1-3)和实施例28(1-3)描述的PCR，将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，用于鉴定存在于人21号染色体上的基因的基因组区的存在。在所有10个分析的克隆中鉴定了扩增产物。

(2-3)荧光原位杂交(FISH)分析

使用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。作为分析上述(2-2)中获得的6个克隆的结果，发现所有克隆都是正常核型，在大多数观察到的有丝分裂象中检测到Cot1染色的信号的拷贝。

(3)通过Cre-loxP定点重组去除长臂远侧区

(3-1)将Cre表达载体导入携带包含插入长臂远侧区和近侧区的loxP序列的人21号染色体的CHO杂交细胞

根据实施例1(1-2)的方法，将Cre表达载体pCAGGS-Cre导入实施例28(2)中获得的CHO(kkNT)-1，CHO(kkNT)-5和CHO(kkNT)-6细胞。用HAT(SIGMA，终浓度：1x)进行选择培养，此后使药物抗性集落发展2-3周。

分离通过3次转染操作获得的总共12个HAT抗性集落，使分离的集落生长，然后进行随后的分析。

(3-2)PCR分析

将HAT抗性株的基因组DNA用作模板，用于通过PCR鉴定两个loxP序列之间的缺失。通过将去除长臂远侧区后保留的loxP序列夹心，在染色体和导向载体上设计寡核苷酸引物对。所述位置在图84中用箭头表示。序列如下所示。

Trans L1：5’-TGGAGGCCATAAACAAGAAGAC(SEQ ID NO：148)

Trans R1：5’-CCCCTTGACCCAGAAATTCCA(SEQ ID NO：149)

使用Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，反应在94℃下进行1分钟，然后是35个循环的94℃下变性15秒，60℃下退火30秒，和72℃下延伸1分钟。当通过去除两个loxP序列之间的区域而除去长臂远侧区时，推导约350B的扩增。当使用引物对SEQ ID NOs：148和145、SEQ ID NOs：114和149或SEQ ID NOs：114和145时，推导5.7KB、6.3KB或12KB的扩增。使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，在下述条件下进行反应。SEQ ID NOs：148和145或SEQ ID NOs：114和149的分析在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸10分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸10分钟，25个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸6分钟，并且72℃下延伸10分钟。SEQ ID NOs：114和145的分析在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸6分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸10分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸6分钟，并且72℃下延伸10分钟。在PCR溶液中加入MgSO₄(终浓度：0.5mM)。

结果，在12个HAT抗性株中，在6个株中用上述引物对观察到了推导的扩增产物。

(3-3)DNA印迹分析

进行DNA印迹分析，以鉴定去除了长臂远侧区的染色体的结构，并且选择去除了长臂远侧区的染色体。靶序列的位置、染色体等位基因和由长臂远侧区的缺失得到的探针示于图84。实施例1(1-4)中描述的5’-探针-1用作同源重组的5’探针，实施例28(1-4)中描述的3’-探针-6用作3’探针。

用KPNI限制酶(Roche)消化从通过初次筛选(PCR)获得的6个候选克隆获得的基因组DNA(约5MG)，根据AUSUBEL et al.(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。通过Typhoon9210图像分析仪(MolecularDynamics)检测与³²P-标记的探针杂交的信号。对于5’靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是16.5kb，以重组前克隆的形式是12kb。对3’靶序列，所述长度以同源重组体的形式是16.5kb，以重组前克隆的形式是7.6kb。结果，在所有6个株中鉴定了去除了长臂远侧区的染色体。

(3-4)FISH分析

使用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。作为分析(3-3)中获得的6个克隆的结果，发现4个克隆是正常核型，用Cot1染色了长臂远侧区被去除的人21号染色体片段，并且在大多数观察到的有丝分裂象中检测到信号的拷贝。

实验(3-1)-(3-4)证明了获得的HAT抗性CHO杂交细胞携带长臂远侧区被去除的人21号染色体片段(21NΔqHAC)，同时保留了端粒和亚端粒序列。

实施例29

分析21NΔqHAC载体在CHO杂交细胞中的长期稳定性

(1)在非选择性培养条件下长期传代培养

为了证实21NΔqHAC载体在CHO杂交细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。使用了实施例28中描述的携带21NΔqHAC载体的两株CHO细胞(CHO(21qN-HAC)17和18)。非选择培养基是含有10％ FBS的F12培养基，选择培养基含有所述F12培养基和添加到其中的1xHAT。将5.0×10⁵个CHO细胞铺于10-cm培养皿中，对已经培养至约80-90％汇合的细胞密度的细胞进行计数，将5.0×10⁵个细胞再次铺板在10-cm培养皿中，传代培养继续进行直到第10次传代。每次传代都对细胞数目进行计数，以确定群体倍增水平。第10次传代后回收CHO株，制备FISH染色体样品。

(2)FISH分析

用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。以双份测量群体倍增水平和HAC保留，确定结果的平均值。关于上述2株的结果示于表11。

表11：21NΔqHAC载体在CHO细胞中的稳定性

 

HAC细胞群传代培养次数        HAC保留(％)无药物选择     有药物选择CHO(21qN-HAC)17CHO(21qN-HAC)18培养开始时10培养开始时10-              10094             100-              10098             100

21NΔqHAC载体到第10次传代结束时在CHO细胞中稳定保留。作为中期染色体图的观察结果，每个细胞检测到1或2个信号。

实验(1)和(2)证明21NΔqHAC载体可以在非选择性培养条件下在CHO细胞中稳定保留，并且可以保持每个细胞的拷贝数。

实施例30

用hEPO-21NΔqHAC载体分析CHO杂交细胞中的hEPO基因表达

(1)将克隆位点插入21NΔqHAC的长臂近侧区

(1-1)构建用于插入loxP、3’neo和FRT序列的pSF1(FRT)-D载体

实施例18(1)中制备的t1pSF1(FRT)用作将loxP、3’neo和FRT序列插入人类人工染色体(21NΔqHAC)的基础质粒。要插入loxP、3’neo和FRT序列的人21号染色体的长臂近侧区的核苷酸序列获自GenBank数据库(编号NT_011515)。用于扩增同源重组的两个靶序列的寡核苷酸引物的序列如下所示。

NT011515-3429039F_SalI：5′-gacagtGTCGACcggattgagagacacacatagctg(SEQ ID NO：150)

NT011515-3431553R_SrfI：

5′-gatGCCCGGGCCTGTCAACCTGCCAGTTCTCAGGAG(SEQ ID NO：151)

从携带人21号染色体的A9<21-2>细胞提取的基因组DNA用作模板，以便通过PCR扩增两个靶序列。用PacI和NheI(Roche)消化用SEQID NOs：134和135扩增的约3.4kb的DNA片段(即同源区1)，用限制酶SalI和SrfI(Roche)消化用SEQ ID NOs：150和151扩增的约2.0kb的DNA片段(即同源区4)，通过琼脂糖凝胶电泳分离具有粘端的DNA片段，然后纯化。随后，将以下3个DNA片段，即，用限制酶消化的同源区1的DNA片段、用NheI和ScaI消化的t1pSF1(FRT)质粒(在实施例18(1)中制备)以及用ScaI和PacI消化的实施例1(2-1)中获得的pSF1③进行三片段连接。用SalI和SrfI消化载体，将限制酶消化的同源区4克隆到其中，以获得pSF1(FRT)-D。最终的pSF1(FRT)-D构建体的大小是大约11.8kb。图85和图86各自显示导向载体、靶序列和由同源重组得到的染色体等位基因。

(1-2)将包含导入长臂近侧区和远侧区的loxP的人21号染色体导入hprt缺陷DT40细胞

用实施例28(2)中制备的携带人21号染色体的CHO(kkNT)6细胞，通过微细胞介导的染色体转移方法制备携带包含导入长臂近侧区和远侧区的loxP的人21号染色体的hprt缺陷DT40杂交细胞。DT4032株(Fukagawa et al.Nucleic Acids Research，1996)用作染色体受体hprt缺陷DT40细胞。制备方法的概要在下文描述。

开始时，从大约1×10⁸个CHO(kkNT)6细胞制备微细胞。在含有秋水仙酰胺(0.1μg/ml，脱羰秋水仙碱，Wako Pure Chemical Industries Ltd.)的培养基(含20％胎牛血清(FBS)和0.8mg/ml G418的F12)中将已经在12个25-cm²离心烧瓶(Nunc)中培养到约80％汇合的细胞密度的CHO(kkNT)6细胞培养72小时，以诱导微核形成。在实施例中，使用了由Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.生产的DMEM。除去培养基后，将预热到34℃的松胞菌素B(在DMEM中为10μg/ml，Sigma)溶液装入离心烧瓶中，在34℃和8,000rpm下离心1小时。将微细胞悬浮于无血清的培养基(DMEM)中，回收，用装有孔径为8μm，5μm或3μm的滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)通过过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于6ml DMEM中。在含有10％ FBS，1％ CS和0.1mM 2-ME的RPMI 1640培养基中培养DT4032细胞，用DMEM洗涤细胞两次，将1×10⁷个细胞重悬于5ml DMEM中。室温和1,500rpm下将微细胞悬浮液离心5分钟，在其上覆盖DT4032细胞悬浮液，室温和1,500rpm下离心5分钟，然后除去上清液。用聚乙二醇(PEG)1:1.4溶液对细胞进行融合处理(Tomizuka et al.，Nature Genet.，U.S.A.，vol.16，pp.133-143，1997)90秒。将融合的细胞悬浮在含10％ FBS，1％鸡血清(ChS)和0.1mM 2-巯基乙醇(ME)的60ml RPMI 1640培养基(Invitrogen)中，将得到的悬浮液铺板于6个96孔板中，培养24小时，在含有1mg/ml G418的培养基中进行选择培养约2周。分离作为两次微细胞融合实验的结果而发展的药物抗性集落。G418抗性株的基因组DNA用作模板，用于通过实施例28(2-2)中描述的PCR检查人21号染色体上存在的基因的基因组区的存在，进一步进行使用人特异性探针Cot1，(Gibco BRL)的荧光原位杂交(FISH)分析，以检查和获得携带人21号染色体的克隆DT4032(KKNT)8和9的拷贝。

(1-3)通过Cre-loxP定点重组去除长臂远侧区

(1-3-1)将Cre表达载体导入携带包含插入长臂远侧区和近侧区的loxP序列的人21号染色体的DT4032杂交细胞

根据实施例1(1-2)的方法，将Cre表达载体pCAGGS-Cre导入实施例30(1-2)中获得的DT4032(kkNT)-8和DT4032(kkNT)-9细胞。用HAT(SIGMA，终浓度：1x)进行选择培养，此后使药物抗性集落发展2-3周。

分离通过4次转染操作获得的总共43个HAT抗性集落，生长，然后进行随后的分析。

(1-3-2)PCR分析

将HAT抗性株的基因组DNA用作模板，以便按照与实施例30(3-2)相同的方式，通过PCR鉴定两个loxP序列之间的缺失。

结果，在43个上述HAT抗性株中的40个株中用上述引物对观察到了推导的扩增产物。

(1-3-3)DNA印迹分析

从通过初次筛选(PCR)获得的候选克隆中的25个克隆提取基因组DNA，按照与实施例30(3-3)相同的方式进行DNA印迹分析。结果，在25个克隆中的5个克隆中鉴定到长臂远侧区被去除的染色体。

(1-3-4)FISH分析

使用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISHExperimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。作为分析上述(1-3-3)中获得的5个克隆的结果，发现4个克隆是正常核型，在大多数观察到的有丝分裂象中检测到了Cot1染色体的去除了长臂远侧区的人21号染色体片段和信号的拷贝。

实验(1-3-1)-(1-3-4)证明了获得的HAT抗性DT4032杂交细胞携带长臂远侧区被去除的人21号染色体片段(21NΔqHAC)，同时保留了端粒和亚端粒序列。

(1-4)将pSF1(FRT)-D载体导入携带21NΔqHAC的DT4032细胞

通过用SrfI限制酶(Roche)消化将pSF1(FRT)-D构建体线性化，将产物导入3种类型的携带长臂远侧区被去除的21NΔqHAC的DT4032杂交细胞(DT4032(kkNTC)15，17和22)中。采用根据实施例1(2-2)的方法，此后使杀稻瘟素抗性集落发展2-3周。用DT4032(kkNTC)15分离通过2次转染操作获得的总共125个药物抗性集落，用DT4032(kkNTC)17分离通过2次转染操作获得的总共110个药物抗性集落，用DT4032(kkNTC)22分离通过2次转染操作获得的总共124个药物抗性集落，对分离的集落进行随后的分析。

(1-5)PCR分析

可以将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，以便使用引物组SEQ ID NOs：114和139以及引物组SEQ ID NOs：145和138通过PCR检测5’靶序列和3’靶序列的存在。所述位置由图86中的箭头指出。使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，将MgSO₄(终浓度：0.5mM)加入PCR溶液。反应可以在94℃下进行1分钟，然后是3个循环的98℃下变性5秒和随后的72℃下退火/延伸8分钟，2个循环的98℃下变性5秒和随后的70℃下退火/延伸8分钟，30个循环的98℃下变性5秒和随后的68℃下退火/延伸8分钟，并且72℃下延伸10分钟。

(1-6)DNA印迹分析

进行DNA印迹分析，以鉴定去除了长臂远侧区的染色体的结构，并且选择去除了长臂远侧区的染色体。图86显示了靶序列的位置、染色体等位基因和由长臂远侧区的缺失得到的探针。实施例23(1-4)中描述的5’探针-1用作同源重组的5’探针，实施例28(1-4)中描述的3’探针-6用作3’探针。

可以用KPNI限制酶(Roche)消化从通过初次筛选(PCR)获得的株提取的基因组DNA(约5μg)，根据AUSUBEL et al.(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)中描述的方法进行DNA印迹分析。可以通过Typhoon9210图像分析仪(Molecular Dynamics)检测与³²P-标记的探针杂交的信号。对于5’靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是11kb，以重组前克隆的形式是16.5kb。对3’靶序列，所述长度以同源重组体的形式是6.2kb，以重组前克隆的形式是16.5kb。

实验(1-1)-(1-6)能够制备携带21NΔqHAC载体的DT4032杂合细胞，所述载体包含通过同源重组插入其中的克隆位点(loxP、3’neo和FRT序列)。

(2)将21NΔqHAC载体导入CHO细胞

(2-1)通过微细胞介导的染色体转移方法将21NΔqHAC载体导入CHO细胞

将携带实施例30(2)获得的21NΔqHAC载体的DT4032杂交细胞用作染色体供体细胞，所述载体去除了长臂远侧区并且具有插入的克隆位点(loxP、3’neo或FRT序列)。将来源于中国仓鼠的CHO-K1株(编号JCRB9018)用作染色体受体细胞。采用根据实施例1(3-1)的方法。

(2-2)PCR分析

可以将杀稻瘟素抗性株的基因组DNA用作模板，以便根据实施例30(1-5)的方法通过PCR检测5’靶序列和3’靶序列的存在。可以产生具有从核苷酸序列推导的大小的扩增产物(5’基因组：约7.5kb；3’基因组：约5.3kb)。

(2-3)DNA印迹分析

为了鉴定导入的21NΔqHAC载体的结构，可以按照与实施例30(1-6)相同的方式进行DNA印迹分析。对于5’靶序列，从核苷酸序列推导的限制酶片段的长度以同源重组体的形式是11kb，以重组前克隆的形式是16.5kb。对3’靶序列，所述长度以同源重组体的形式是6.2kb，以重组前克隆的形式是16.5kb。

(2-4)FISH分析

可以使用人特异性Cot1(Invitrogen)探针，根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法进行FISH分析。

实验(2-1)-(2-4)可以证明获得的杀稻瘟素抗性CHO株携带21NΔqHAC载体。

(3)构建hEPO-21NΔqHAC载体

(3-1)将hEPO基因导入21NΔqHAC载体

将hEPO基因表达单位插入实施例30(2)中构建的21NΔqHAC载体中。制备含有loxP序列的hEPO表达质粒，瞬时表达Cre重组酶以便通过loxP序列之间的定点重组将基因表达单位插入人工染色体。用G418抗性的获得(即启动子-片段化的新霉素抗性基因表达单位的重建)作为指示物选择包含插入序列的重组体。使用实施例30(2)制备的携带21NΔqHAC载体的CHO杂交细胞，以与实施例3(1-1)相同的方式插入hEPO基因表达单位。可以分离G418抗性集落，然后可以使它们生长2-3周。

(3-2)PCR分析

可以使用SVpANp1和Neo Rp2引物，通过PCR检查hEPO基因表达单位是否插入到21NΔqHAC载体的loxP序列的位点中，从而选择包含插入其中的hEPO基因表达单位的重组体，所述引物是在pLN1-EPO载体和14AΔqHAC载体上设计的，以夹心loxP序列的位点。或者，用pBS226质粒载体的M13RV和Neo Rp2引物通过PCR检查插入的hepo基因的扩增，从而选择它。

根据Kakeda et al.(Kakeda et al.，Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法确定引物序列和PCR条件。在包含插入序列的重组体的情况下，用SVpANp1和Neo Rp2引物推导约1.0kbp的扩增，并且用M13RV和NeoRp2引物推导约2.7kbp的扩增。这样，可以将G418抗性CHO杂合细胞鉴定为包含插入loxP序列中的hEPO基因表达单位的重组体。

(3-3)DNA印迹分析

为了检查hEPO-21NΔqHAC载体是否合适地携带hEPO表达单位，根据Kakeda et al.(Gene Therapy；12：852-856，2005)的方法，进行DNA印迹分析。由核苷酸序列推导的XbaI消化得到的限制酶片段的长度是5.5kb，包括hEPO表达单位。

(3-4)FISH分析

可以根据Matsubara et al.(FISH Experimental Protocol，Shujunsha Co.Ltd.，1994)中描述的方法，用人特异性Cot1(Invitrogen)探针进行FISH分析。实验(3-1)-(3-4)可以证明G418抗性CHO杂交细胞携带hEPO-21NΔqHAC载体并且具有正常核型。

(4)插入21NΔqHAC载体中的hEPO基因的表达

可以通过在培养上清液中产生的hEPO蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)对hEPO基因的表达进行定量。

可以将上文(3)中分离的携带hEPO-21NΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞(约10⁵个细胞)铺板在12孔组织培养塑料培养皿(Falcon)上，该培养皿包含2ml F12培养基，所述培养基中含有10％ FBS和以0.8mg/ml添加的G418。培养的细胞达到汇合后，可以用2ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养可以进行2天，可以用1ml含10％ FBS的F12培养基更换培养基，培养可以再进行24小时，可以回收上清液，然后可以对细胞数目进行计数。可以在携带hEPO-21NΔqHAC载体的G418抗性CHO杂交细胞中检测到hEPO表达，所述细胞能够用hEPOELISA试剂盒(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay，R&D Systems)对培养上清液中的hEPO进行定量。

工业实用性

本发明提供了人工人类染色体(HAC)载体及其制备方法。所述HAC载体在细胞中稳定保留，并且能够以高水平表达插入的外源DNA。因此，所述HAC可以用于广泛的应用，如基因表达分析、基因治疗、基因导入和蛋白生产。

本文引用的所有公开文献、专利和专利申请通过全文引用而并入本文。

序列表独立文字

SEQ ID NO：1-109：合成的寡核苷酸

SEQ ID NO：110-117：引物

SEQ ID NO：118-121：探针

SEQ ID NO：122-177：引物

SEQ ID NO：178-179：接头

序列表

<110>KIRIN PHARMA KABUSHIKI KAISHA

<120>人类人工染色体(HAC)载体和包含它的人类细胞药物

<130>PH-3234-PCT

<150>JP 2006-188392

<151>2006-07-07

<160>179

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>1

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>2

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>3

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>4

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>5

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>6

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>7

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>8

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>9

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>10

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>11

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>12

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>13

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>14

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>15

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>16

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>17

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>18

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>19

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>20

<210>21

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>21

<210>22

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>22

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>23

<210>24

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>24

<210>25

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>25

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>26

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>27

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>28

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>29

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>30

<210>31

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>31

<210>32

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>32

<210>33

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>33

<210>34

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>34

<210>35

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>35

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>36

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>37

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>38

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>39

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>40

<210>41

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>41

<210>42

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>42

<210>43

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>43

<210>44

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>44

<210>45

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>45

<210>46

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>46

<210>47

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>47

<210>48

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>48

<210>49

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>49

<210>50

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>50

<210>51

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>51

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>52

<210>53

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>53

<210>54

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>54

<210>55

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>55

<210>56

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>56

<210>57

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>57

<210>58

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>58

<210>59

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>59

<210>60

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>60

<210>61

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>61

<210>62

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>62

<210>63

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>63

<210>64

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>64

<210>65

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>65

<210>66

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>66

<210>67

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>67

<210>68

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>68

<210>69

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>69

<210>70

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>70

<210>71

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>71

<210>72

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>72

<210>73

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>73

<210>74

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>74

<210>75

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>75

<210>76

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>76

<210>77

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>77

<210>78

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>78

<210>79

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>79

<210>80

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>80

<210>81

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>81

<210>82

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>82

<210>83

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>83

<210>84

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>84

<210>85

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>85

<210>86

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>86

<210>87

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>87

<210>88

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>88

<210>89

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>89

<210>90

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>90

<210>91

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>91

<210>92

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>92

<210>93

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>93

<210>94

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>94

<210>95

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>95

<210>96

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>96

<210>97

<211>100

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>97

<210>98

<211>100

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>98

<210>99

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>99

<210>100

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>100

<210>101

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>101

<210>102

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>102

<210>103

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>103

<210>104

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>104

<210>105

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>105

<210>106

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>106

<210>107

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>107

<210>108

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>108

<210>109

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>109

<210>110

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>110

<210>111

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>111

<210>112

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>112

<210>113

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>113

<210>114

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>114

<210>115

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>115

<210>116

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>116

<210>117

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>117

<210>118

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：探针

<400>118

<210>119

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：探针

<400>119

<210>120

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：探针

<400>120

<210>121

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：探针

<400>121

<210>122

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>122

<210>123

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>123

<210>124

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>124

<210>125

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>125

<210>126

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>126

<210>127

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>127

<210>128

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>128

<210>129

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>129

<210>130

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>130

<210>131

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>131

<210>132

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>132

<210>133

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>133

<210>134

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>134

<210>135

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>135

<210>136

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>136

<210>137

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>137

<210>138

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>138

<210>139

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>139

<210>140

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>140

<210>141

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>141

<210>142

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>142

<210>143

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>143

<210>144

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>144

<210>145

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>145

<210>146

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>146

<210>147

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>147

<210>148

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>148

<210>149

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>149

<210>150

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>150

<210>151

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>151

<210>152

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>152

<210>153

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>153

<210>154

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>154

<210>155

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>155

<210>156

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>156

<210>157

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>157

<210>158

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>158

<210>159

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>159

<210>160

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>160

<210>161

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>161

<210>162

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>162

<210>163

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>163

<210>164

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>164

<210>165

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>165

<210>166

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>166

<210>167

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>167

<210>168

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>168

<210>169

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>169

<210>170

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>170

<210>171

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>171

<210>172

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>172

<210>173

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>173

<210>174

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>174

<210>175

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>175

<210>176

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>176

<210>177

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>177

<210>178

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：接头

<400>178

<210>179

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：接头

<400>179