基因打靶

摘要： 【目的】探究同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白基因(hLF)打靶山羊β-乳球蛋白基因(BLG)座位点效率的影响,为今后体细胞核移植制备BLG-/hLF+基因打靶山羊提供科学依据,也为CRISPR/Cas9基因编辑系统介导BLG基因或其他基因座位点定向精准分子修饰的遗传育种提供借鉴。【方法】针对山羊BLG基因第一外显子区域设计构建sgBLG/Cas9载体,电转染山羊胎儿成纤维细胞,PCR验证BLG基因座位点致突变活性;以BLC14乳腺特异性表达载体为基础构建3种同源臂长度(6.0、3.5和1.2 kb)的hLF基因打靶载体,分别与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经500μg/mLG418筛选后,采用PCR检测基因打靶情况。【结果】sgBLG/Cas9载体在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座附近切割DNA双链的致突变活性效率在30%~35%。构建获得3种同源臂长度的hLF基因打靶载体(BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3),对应的同源臂长度分别为6.0、3.5和1.2 kb;将3种hLF基因打靶载体与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经5次电转染和G418筛选,分别获得83、77和86株药物抗性细胞,经PCR同源重组检测最终获得42、38和44株BLG-/hLF+基因打靶细胞株,即hLF基因在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座的平均打靶效率分别为50.6%(42/83)、49.4%(38/77)和51.2%(44/86)。3种不同长度同源臂构建的hLF基因打靶载体在山羊BLG基因座位点的打靶效率在统计学上无显著差异(P>0.05),表明同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊BLG基因座位点无显著影响。【结论】利用CRISPR/Cas9系统介导hLF基因打靶山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座位点能成功获得多株hLF+/BLG-基因打靶细胞株(BLG基因座定点打靶hLF基因),但打靶载体同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导BLG位点定向整合hLF基因的打靶效率无明显影响。

摘要： 目的:构建Stk24/Stk25双基因敲除小鼠模型,并对其基因型及敲除效率进行测定.方法:使用基因打靶技术构建基因敲除小鼠,利用PCR及凝胶电泳技术对亲代及子代小鼠进行基因型鉴定;并利用RT-qPCR测定目的基因在小脑血管内皮细胞中mRNA转录水平的表达情况.结果:通过PCR技术成功检测出小鼠子代基因型Cdh5cre+/Stk24fl/fl/Stk25fl/fl纯合子小鼠,经鉴定血管内皮基因敲除Stk24、Stk25后表达量分别下降了 27％(t=2.874,P=0.0207)和30％(t=17.21,P＜O.001).结论:采用基因打靶技术成功构建了 Stk24/Stk25双基因敲除小鼠.

摘要： 目的 以超声造影(CEUS)动态观察小鼠三阴性乳腺癌(TNBC)病灶及新生血管变化,评价表皮生长因子受体(EGFR)通路靶向治疗TNBC的价值.方法 建立30只TNBC小鼠模型,分为靶向组(靶向阻断EGFR通路)及对照组各15只.分别于建模后第5、10、15、20天行常规超声及CEUS检查,测量相关参数;每次检查结束后随机处死3～4只小鼠,以免疫组织化学检测肿瘤标本中EGFR及血管内皮生长因子(VEGF)表达.采用Spearman相关性分析评价CEUS参数与EGFR及VEGF的关系.结果 建模后第5天,靶向组与对照组肿瘤体积无明显差异(P>0.05);建模后第10～20天,靶向组肿瘤体积均明显小于对照组(P均0.05).建模后第10～20天靶向组EGFR均显著低于对照组(P均<0.05);建模后第5～20天靶向组VEGF均显著低于对照组(P均<0.05).EGFR与VEGF相关(r=0.629,P<0.001);PI与EGFR及VEGF均相关(r=0.679、0.839,P均<0.001).结论 CEUS可评估小鼠TNBC病灶及新生血管变化;靶向阻断EGFR通路可有效缩小小鼠TNBC模型肿瘤体积,降低其CEUS PI及EGFR、VEGF表达水平.

摘要： 为研究山羊乳蛋白基因编辑,实现羊乳“人源化”改造.利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊乳中致敏原β-乳球蛋白(BLG)基因,同时在BLG基因座定点敲入人乳铁蛋白(hLF)基因.针对山羊BLG基因第一外显予设计构建sgBLG/Cas9表达载体经电转染山羊胎儿成纤维细胞验证其编辑活性;将打靶载体BLC14与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经筛选检测获得BLG-/hLF+打靶细胞株作为供核细胞用于山羊体细胞核移植;通过剖宫产获取克隆胎儿并验证其中靶情况.结果 表明:sgBLG/Cas9编辑山羊BLG位点致突变率约为30％～35％;共筛选72株药物抗性细胞株,其中有37株为基因打靶细胞,打靶效率为51.4％(37/72);挑取形态较好的7株打靶细胞用于核移植,共制备416枚重构胚,移植30只受体山羊;30-35日龄B超诊断有13只受孕,妊娠率为43.3％(13/30);剖宫产获取3只35日龄克隆胎儿均验证为BLG-/hLF+基因型,并建立了BLG-/hLF+靶向性修饰细胞系.因此,利用CRISPR/Cas9系统可以获得BLG基因座定点打靶hLF基因的转基因克隆山羊,该研究为培育羊乳中低致敏原和富含hLF功能营养成分的转基因山羊新品系提供了科学依据.

摘要： 鉴于原位杂交和免疫组化实验发现蛋白激酶Riok3在P1、P3和P5的雌性小鼠卵巢卵母细胞中高表达,为深入了解R iok3在哺乳动物卵巢发育过程中的分子调控机制及其在卵细胞发育中的功能,通过构建R iok3条件性打靶载体,基因打靶、干细胞囊胚注射和胚胎移植,成功得到了R iok3条件基因打靶的小鼠模型(Riok3loxP/loxP).

摘要： ERG基因(ETS-related gene)属于E26转化特异性(EST)转录因子家族,在血管发育和生成、造血系统和软骨发育等各方面都具有重要的作用.近年来越来越多的研究发现,在一些肿瘤中出现ERG基因过表达,从而促进肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成,参与肿瘤的发生与发展,例如前列腺癌(PCa)、尤文肉瘤(EWS)、白血病等.但是ERG在这些肿瘤中的具体作用机制尚未完全明确.目前,将ERG应用于肿瘤的诊断和预后成为研究热点,一些以ERG及其下游信号通路、靶基因为治疗靶点的药物正在进行临床试验.本文就ERG基因在肿瘤中的表达、作用机制及临床应用进展等方面进行综述.

摘要： Neuritin(Nrn1)是神经营养因子家族的成员,能够维持神经元的存活和突起的生长,在神经系统发育和再生中起重要作用.为了解Neuritin基因在整体动物水平的系统生物学功能,通过PCR扩增Neuritin基因片段,将该片段用In-fusion无缝克隆技术连接至用限制性内切酶A sc1酶切后线性化的CTV-IRES-EGFP质粒,转化至Stellar感受态细胞后,对酶切和测序鉴定正确的阳性克隆子进行大量提取质粒,酶切使之线性化后将其电转导入小鼠胚胎干细胞细胞,经G418筛选,挑取抗性克隆,用PCR方法鉴定出同源重组的ES细胞DNA.结果表明,成功构建了CTV-Nrn1-IRES-EGFP基因打靶载体载体并筛选出阳性同源重组胚胎干细胞,为制备Neuritin条件性基因打靶小鼠模型奠定了实验基础.

摘要： 本文中构建了多位点基因打靶载体pBC1-DS2-Fatl-eGFP-DS1。利用lipofectamine LTX介导外源pBC1-DS2-Fatl-eGFP-DS1质粒转染水牛肾脏成纤维细胞，探讨了脂质体用量、质粒用量、质粒大小、转染时间、细胞初始接种密度对转染效率的影响。结果表明，4pg打靶载体质粒DNA与4μg,L脂质体转染6h,其细胞活性达98%，可获得较满意的转染效率。应用QRT-PCR技术、酶切和测序等手段检测和分析了外源基因Fatl的表达和定点整合情况。结果表明，Fatl基因己成功整合至水牛基因组，定点整合效率有所增加，但仍然较低。

摘要： 本研究拟以水牛rRNA基因的间隔序列为靶位点，构建含外源基因Fat1和标记基因EGFP的水牛多位点基因打靶载体，为建立适用于动物体内基因定点敲入和转Fat1基因水牛打靶技术奠定基础。

摘要： 目的:构建山羊β-乳球蛋白基因打靶载体，以期用人乳白蛋白(hALA)基因的编码区置换山羊β-乳球蛋白(BLG)基因的编码区，借助BLG的内源性调控序列指导hALA的表达.rn 方法:从山羊血液基因组中PCR扩增BLG基因的5’端侧翼序列(B5)、第5外显子和第5内含子的部分序列(B5)，3'端侧翼序列(B3)，同时从人血液基因组中克隆hALA基因的基因组序列(hALA)，并将上述片段连接到相应的克隆载体.对四个片段分别进行亚克隆，依次将B5，hALA，E5连接到pBluescript Ks(-)载体中，构建栽体pBAE;最后将B5-hALA-E5和B3分别连接到打靶载体ploxpII中，标记为pBAT.rn 结果:经酶切和/或测序等鉴定，以上载体均正确无误，成功构建了乳蛋白基因打靶载体.

摘要： 家蚕（Bombyx mori）幼虫具有一对发达的绢丝腺，能够大量合成分泌丝蛋白，具有作为生物工厂的潜质。为了利用家蚕丝腺合成人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF），通过PCR分别克隆了家蚕丝素轻链基因（fibL）3'的2个片段作为基因打靶载体的左右同源臂，利用丝素重链基因启动子控制的hGM-CSF表达盒，以及家蚕A3启动子控制的报告基因GFP，成功构建家蚕基因打靶的转基因载体，将该载体导入家蚕丝腺组织、家蚕培养细胞，均可检测到报告基因的表达，进一步通过精子介道法获得转基因家蚕。

摘要： 为了通过基因打靶实现外源基因在丝腺组织特异表达，克隆并测定了丝素重链基因（fib-H）启动子及其旁侧序列、fib-H内含子和第二外显子部分序列，并分别作为基因打靶的同源臂，构建了带有A3启动子驱动GFP的表达盒、丝素轻链启动子驱动hGM-CSF的打靶载体；体外翻译和体内瞬时表达结果显示，该基因打靶载体可以在后部丝腺组织匀浆中表达hGM-CSF，在丝腺可以检测到GFP的表达；将该基因打靶载体用脂质体转染BmN细胞后可获得GFP荧光细胞；将混有脂质体的基因打靶载体通过精子介导法注入到处女蛾中得到转基因家蚕，并已传代到第四代，PCR及PCR产物测序表明GFP和hGM-CSF基因均稳定遗传。

摘要： 哈萨克羊是新疆的肉用优良地方品种,适应当地环境条件,分布广泛,生长较快,但属于单胎品种,产羔率较低,如何在保持其优良特性的前提下提高产羔率,是当前面临的课题.产羔率属于域性状,其相关基因较多,其中BMPR-IB基因发生第六外显子A746G单碱基突变后被称作FECB基因,FECB基因符合孟德尔遗传规律,遗传稳定,有加性效应,所以成为绵羊多胎基因最主要,利用最广范的主效基因,能显著提高绵羊的排卵数和产羔率.

摘要： 本研究分离培养了猪的肾脏成纤维细胞，针对含有fat-I基因的多位点基因打靶载体进行设计锌指核酸酶，通过脂质体共转染将打靶载体和锌指核酸酶导入细胞，在细胞水平上验证打靶载体的定点整合效率。目的在于结合多位点打靶技术和锌指核酸酶技术提高基因打靶的定点整合效率，为进一步获得外源基因稳定表达的转基因猪打下基础。

摘要： 本文首选从流行病学的角度阐述了动脉粥样硬化的医学机理，然后论述了动脉粥样硬化动物模型的研究进展和取得的一些成就，如建立兔模型、转基因和基因打靶技术等，并分析了选择小型猪建立动脉粥样硬化模型的优势，同时给出了建立的方法，并从血脂指标、影像学指标、病理学指标等方面讨论了评价标准。

摘要： 本文首选从流行病学的角度阐述了糖尿病的医学机理，然后论述了糖尿病动物模型的研究进展和取得的一些成就，如建立1型和2型糖尿病模型、转基因和基因打靶技术等，并分析了选择小型猪建立糖尿病模型的优势，同时给出了建立的方法，并说明了STZ(链脲霉素)的应用计量和实验周期。

摘要： 哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展，很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法，并且是目前生产基因打靶猪的唯一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高，但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰，确保产生的克隆动物后代lOO%为转基因动物，从而大大提高了转基因猪的制作效率，可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。

摘要： 描述了一种工程化转基因整合平台(ETIP)，它能在植物基因组中随机地或在靶定位置处插入，从而推动快速选择和检测完美靶定(5'和3'端二者)在ETIP基因组位置处的GOI。本公开文本中的一个要件是在ETIP内引入特定双链断裂。在一些实施方案中，描述了一种ETIP，它使用锌指核酸酶结合位点，但是可利用其它靶向技术，诸如大范围核酸酶、CRISPR、TAL、或亮氨酸拉链。还描述了转基因植物的组合物和用于生成转基因植物的方法，其中供体或有效载荷DNA表达稳定整合入植物细胞中ETIP的外源核酸序列的一种或多种产物(例如蛋白质或RNA)。在多个实施方案中，从构思贯穿开发阶段，ETIP推动测试基因候选和植物表达载体。

摘要： 本发明公开了一种用噬菌体的大肠杆菌同源重组系统(BAC-retrieve)的方法同时构建含有Cre-LoxP的条件敲除载体(conditional targeting vector)和传统打靶载体(convetional targeting vector)，用来同时制作条件基因敲除小鼠和传统敲除小鼠。该方法摆脱了传统意义上的打靶载体的构建受基因组DNA上限制性内切酶位点的局限性，更有利于筛选用于后期Southern杂交进行阳性克隆筛选时的内切酶的选取，更好区分重组和野生型染色体，而且更有利于我们对打靶区域的选择，具有高效、省时、灵活的三大特点。

摘要： 本发明公开了一种CRISPR/Cas9介导的人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶方法。该方法包括，从人肾脏中提取得总RNA，PCR扩增牛β‑casein基因第二外显子上游1062bp片段及其下游1065bp片段分别被插入到骨架载体neo基因的上游和下游作为打把载体的5'同源臂和3'同源臂，将人EPO cDNA插入到5’同源臂下游，构建以neo基因作为正筛选因子的人EPO cDNA基因在牛β‑casein基因座定位整合的打把载体，基于打靶位点序列，设计并构建特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体，采用电击转染法将打把载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。

摘要： 本申请描述了用于基因打靶和性状堆叠的工程化转基因整合平台(ETIP)，它能在植物基因组中随机地或在靶定位置处插入，从而推动快速选择和检测完美靶定(5'和3'端二者)在ETIP基因组位置处的GOI。本公开文本中的一个要件是在ETIP内引入特定双链断裂。在一些实施方案中，描述了一种ETIP，它使用锌指核酸酶结合位点，但是可利用其它靶向技术，诸如大范围核酸酶、CRISPR、TAL、或亮氨酸拉链。还描述了转基因植物的组合物和用于生成转基因植物的方法，其中供体或有效载荷DNA表达稳定整合入植物细胞中ETIP的外源核酸序列的一种或多种产物(例如蛋白质或RNA)。在多个实施方案中，从构思贯穿开发阶段，ETIP推动测试基因候选和植物表达载体。

摘要： 本发明公开了ES细胞基因打靶技术制备基因修饰小鼠的改进方法。本发明的目的在于提高囊胚前胚胎ES注射法获取100％ES来源基因修饰鼠的效率，着重在囊胚前胚胎的获取方法、显微注射方法、显微注射后胚胎的体外培养等方面进行改进和优化。本发明保证了100％ES来源小鼠的得率，同时大大缩减了周期和成本。

摘要： 本发明提供了一种Rag?2(重组激活基因2)基因打靶载体，用于产生引入有该载体的SCID样小型猪的方法，及其应用。

摘要： 本发明公开了一种应用CRISPR/Cas9系统基因打靶的方法，通过选择具有DNA单链切割能力的Cas9的突变体，针对每个打靶位点使用一条tracrRNA/crRNA二元复合体或者一条sgRNA，Cas9的突变体识别打靶位点附近的保守的间隔相邻基序，产生DNA单链切口，而不产生DNA双链断裂，诱导单链切口同源重组修复。本发明还提供了利用所述方法介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法。本发明降低了基因打靶过程中HMEJ修复带来的插入缺失突变，获得高效打靶阳性克隆。本发明可作为平台技术广泛用于基因打靶动物模型的制备。

摘要： 本发明公开了一种基于腺相关病毒为载体的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒及其构建方法。本发明还公开了所述山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒的打靶方法。

摘要： 本发明公开了一种CRISPR/Cas9介导的人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶方法。该方法包括，从人肾脏中提取得总RNA，PCR扩增牛β‑casein基因第二外显子上游1062bp片段及其下游1065bp片段分别被插入到骨架载体neo基因的上游和下游作为打把载体的5'同源臂和3'同源臂，将人EPO cDNA插入到5’同源臂下游，构建以neo基因作为正筛选因子的人EPO cDNA基因在牛β‑casein基因座定位整合的打把载体，基于打靶位点序列，设计并构建特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体，采用电击转染法将打把载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。

摘要： 本发明提供了一种在基因打靶中具有高突变效率的PL‑LbCpf1‑RR基因及其应用。本发明在水稻基因打靶实验过程中，意外获得了一种新的PL‑LbCpf1‑RR基因，发现利用该PL‑LbCpf1‑RR基因进行水稻剪切，能够识别更多基因组位点并且具有高突变效率。此外，并且本发明提供一种表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用所获得的PL‑LbCpf1‑RR构建植物表达载体，构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA双链剪切，实现了水稻基因打靶，并且获得了高突变效率。