核移植

摘要： 目前我国生猪养殖环节超过97％的优良种猪依赖进口,并且因育种水平低,导致我国种猪业长期处于"引种—扩繁—退化—再引种"的恶性循环模式.打破发达国家对顶级种猪市场的垄断,让我国从养猪大国变成养猪强国,是我国养猪业的大难题.为此南宁壮博联合中国农业科学院北京畜牧兽医研究所团队,提出了利用体细胞克隆及胚胎移植技术对优秀基因种猪进行复制和扩群的解决方案.此试验总共利用移植受体母猪13头,45d均未见返情,共产仔猪21头,死亡1头.其中1头44d流产.有5头母猪妊娠分娩,产仔最高的1窝为8头仔猪,成活7头;产仔最低的1窝为1头仔猪,成活1头.在28～30d断奶时,断奶体重和大群母猪所产仔猪无显著差异.但克隆出的仔猪舌头比普通的仔猪大,为器官畸形的情况,具体原因还有待研究.

摘要： 动物克隆技术的利用对于繁殖性状优良的家畜具有重要意义,确保利用此技术生产的动物食品(奶和肉)的营养性和安全性成为商业化应用的前提和人们关注的热点。牛、山羊、猪等常见家畜的克隆已经成功,针对其奶和肉的营养性和安全性开展的研究发现,克隆动物食品具有与非克隆动物食品相当的营养性、无毒性且对动物生理无不利影响。但是,这种食品要被消费者接受,还需要降低其生产成本和提高公众的心理接受度。

摘要： 为研究山羊乳蛋白基因编辑,实现羊乳“人源化”改造.利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊乳中致敏原β-乳球蛋白(BLG)基因,同时在BLG基因座定点敲入人乳铁蛋白(hLF)基因.针对山羊BLG基因第一外显予设计构建sgBLG/Cas9表达载体经电转染山羊胎儿成纤维细胞验证其编辑活性;将打靶载体BLC14与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经筛选检测获得BLG-/hLF+打靶细胞株作为供核细胞用于山羊体细胞核移植;通过剖宫产获取克隆胎儿并验证其中靶情况.结果 表明:sgBLG/Cas9编辑山羊BLG位点致突变率约为30％～35％;共筛选72株药物抗性细胞株,其中有37株为基因打靶细胞,打靶效率为51.4％(37/72);挑取形态较好的7株打靶细胞用于核移植,共制备416枚重构胚,移植30只受体山羊;30-35日龄B超诊断有13只受孕,妊娠率为43.3％(13/30);剖宫产获取3只35日龄克隆胎儿均验证为BLG-/hLF+基因型,并建立了BLG-/hLF+靶向性修饰细胞系.因此,利用CRISPR/Cas9系统可以获得BLG基因座定点打靶hLF基因的转基因克隆山羊,该研究为培育羊乳中低致敏原和富含hLF功能营养成分的转基因山羊新品系提供了科学依据.

摘要： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)是一类化合物,通过干扰组蛋白去乙酰化酶来控制DNA缠绕于组蛋白的松紧程度从而发挥作用,它可以通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度提高乙酰化相关基因的表达水平.近年来,关于HDACi促进供体细胞及核移植重构胚的表观遗传重编程以及调控高等动物机体基因的表达等相关研究备受关注.主要阐述了HDACi对核移植胚胎体外发育效果的影响,旨在为提高克隆胚胎的生产效率提供参考依据.

摘要： 1996年世界第一只体细胞克隆羊多莉在英国出生。多莉的出生不仅立刻吸引了全球的关注,因为有可能开创一个细胞生物学和生物医学的新时代,而且也可能重新定义生命科学。更重要的是100多年前由August Weissmann提出的假说终于得到了解决并且有了完美的结论,即对所有的物种而言,从受精卵到分化了的细胞的所有细胞都应该具有相同的基因,它们也都转变胚胎的原始状态。在本篇综述中追溯了核移植从19世纪末到多莉这100多年的历史,并简单介绍了核移植发展中重要的里程碑以及那些为核移植理论做出伟大贡献的杰出科学家,其中包括两位诺贝尔奖获得者。

摘要： 从第一例核移植动物到第一例体细胞核移植灵长类动物,核移植研究恰好迎来90周年.在这近百年的研究历程中,核移植研究不仅回答了一系列重大科学问题,且在许多方面已投入到实际应用.文章详述了核移植研究的发展历程、实际应用及其发展现状.

摘要： 从克隆胚胎中分离、培育而成的干细胞称为核移植胚胎干细胞.核移植胚胎干细胞有正常的核型,表现碱性磷酸酶活性,能分化成其他类型的细胞,对于疾病治疗研究具有重要的价值.本文概述核移植胚胎干细胞的制备、特性和应用,并讨论了人核移植胚胎干细胞的制备的伦理问题.

摘要： 哺乳动物体细胞核移植技术(Somatic Cell nuclear transfer,SCNT)近几十年的发展取得了巨大的成就,但由于需要繁琐的技术、昂贵的显微操作仪且核移植效率不理想,阻碍了核移植克隆的规模化发展.近年来科学界运用了新的革新方法—体细胞手工克隆(Handmade Somatic Cell Cloning,HCM),其操作无需显微操作仪,对操作人的技术要求不高,是纯手工核移植技术.该技术不仅简化操作程序,还提高核移植效率,对今后哺乳动物核移植研究有重要的推动作用.该综述将从核移植技术的研究与进展方面,探讨限制手工克隆(HCM)的因子并以此来优化手工克隆技术.

摘要： 让学生通过教材中列举的4个实验初步认识细胞核的功能。课堂上,选择其中两个实验——伞藻嫁接和核移植实验进行详细剖析,以教师为主导,以学生为主体,坚持基于问题式学习的原则,启发和引导学生通过自主学习、小组合作学习,归纳总结出细胞核是细胞遗传的控制中心。课后,以布置作业的形式,让学生结合问题自学另外两个实验。

摘要： 研究旨在尝试利用体细胞克隆技术进行地方优良品种吕梁黑山羊的克隆保种.剪取吕梁黑山羊耳缘组织,通过组织块培养法获得了吕梁黑山羊皮肤成纤维细胞,使用第6代的皮肤成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,将重构胚胎通过手术移植到受体辽宁白绒山羊母羊体内,结果成功获得了2只体细胞克隆黑山羊,生长发育状况良好,且与供体黑山羊一致,表明体细胞克隆技术是可行的.这是山西省首例吕梁黑山羊克隆个体,它的成功为优良地方品种改良、保种等研究提供了有效可行的方法,为下一步进行吕梁黑山羊的转基因育种研究奠定了技术基础.%The objective of this study was to clone Lüliang black goat using the SCNT (somatic cell nuclear transfer) technology and to protect local variety.A piece of ear tissue was collected from Lüliang black goat and cultured to get skin fibroblast cells.The reconstructed embryos were produced by nuclear transfer using the G6 generation of Liliang black goat ear firbroblast cells as donors and Liaoning white cashmere goat ooctyes as receptors,and we successfully cloned two lüliang black lambs on June 24,2017 which were consistent with the donor.The result indicated that Lüiliang black goat was successfully cloned by SCNT technology.This study obtains the first cloned offspring of Liüliang black goat,which will provide a effective feasible method for breeding,and lay a foundation for next step that produce transgenetic goats by somatic nuclear transfer.

摘要： iPS细胞的成功为获取多能性细胞提供了新的途径，也为探索细胞核重编程机制提供了新的视角。鉴于多能性细胞对于家畜育种以及生物医学模型建立等所具有的重要作用，以猪为代表的家畜iPS细胞建系和应用研究受到广泛的关注。本文在原有的猪iPS细胞建系研究成果基础上，本次研究对比了经典四因子和六因子诱导猪成纤维细胞获得iPS的效果，同时还比较了不同成纤维细胞系用于iPS建系的效率和用于核移植供核细胞的发育潜能，观察了iPS及其源头成纤维细胞作为核移植供核细胞后所获得重构胚的发育潜能。初步分析表明，外源基因的过量表达和无法及时沉默可能是造成iPS细胞作为核移植供核细胞导致胚胎发育率低下的主要原因。

摘要： 利用显微操作技术进行的动物体细胞核移植方法不仅是研究胚胎重编程机理、转基因工程的常规手段之一,也是地方物种保护,培育新系家畜提供了重要的实验技术平台.现在世界范围内普遍存在核移植效率低下等问题,为了优化并建立适合广西德宝黑猪体细胞核移植体系,本研究探讨了不同的融合和电激活的参数,化学激活药剂,融合激活方案,供体等因素对核移植效率的影响,并探讨了重构胚培养中添加适宜浓度和处理时间的抗氧化剂VitaminC对重构胚发育以及其表观遗传的影响,从而能提供一种提高体细胞核移植效率的方法.

摘要： 体细胞克隆技术用于性状优良家畜的快速扩繁，能极大地缩短传统育种方式改良家畜品种的进程。本研究旨在运用一种改进的核移植技术扩繁引进的、优秀的后测荷斯坦种公牛。

摘要： 为进一步提高核移植效率，寻求一种更高效的核移植供体细胞。分别以荷斯坦奶牛胎牛的骨髓间充质干细胞(MSCs)，肌肉细胞(MCs)，乳腺上皮细胞(MECs)为供体核进行核移植，记录分析核移植重构胚的卵裂率，桑葚胚率、囊胚率。用Hoechst33342对重构胚染色，比较细胞数目的差异。取优质克隆囊胚进行胚胎移植，对胚胎移植的妊娠率进行比较分析。结果以MSCs为供体核构建的核移植胚胎桑葚胚率高于Mcs组(P>0.05)和MEcs组(P<0.05)。囊胚率显著高于MCs组和MECs组(P<0.05)，MSCs组核移植重构胚细胞数高于其他两组，略低于超排胚胎的细胞数。MSCs组胚胎移植的妊娠率显著高于其他两组(P<0.05)。实验结果表明，体外培养的牛MSCs易于分离纯化，生长旺盛，以其为供体核能够提高牛核移植效率，适合做牛核移植供体细胞。

摘要： 本文采用第二代超高通量DNA测序技术结合生物信息学的方法，对来源于内蒙古阿尔巴斯型白绒山羊的绒毛生长期与静息期皮肤部位的样本进行了深度的转录组测序，对这两个时期所出现的差异表达基因进行了深入系统的分析，以便更加深入地了解绒山羊绒毛生长的分子机理。以不同种类成纤维细胞为核供体研究细胞类型以及受体山羊排卵数对绒山羊体细胞核移植效率的影响。结果表明不同类型与来源供体细胞其克降效率不尽相同，其中胎儿成纤维细胞来源胚胎其克隆效率高于耳尖成纤维细胞来源胚胎，非转基因克隆肛胎效率高于转基因克隆胚胎，雄性细胞来源胚胎克隆效率高于雌性细胞来源胚胎，表明供体细胞的类型是飞定克隆效率的重要因素之一。

摘要： 本研究旨在优化HMC胚胎的培养和冷冻系统，并比较HMC与传统核移植方法的胚胎生产效率和胚胎冷冻存活率。以期探讨HMC在实际操作中大批量生产克隆胚胎的可行性，提高HMC囊胚的冷冻存活率，进而推进HMC在核移植和转基因领域的应用。

摘要： 本实验室前期工作已经发现，MT对促进小鼠、猪和牛早期胚胎体外发育，以及体细胞核移植重构胚发育均有重要作用，本研究的目的是明确MT对绵羊成纤维细胞增殖的影响作用，为优化核移植供体细胞奠定实验基础。本实验发现，高浓度褪黑素对细胞生长具有抑制作用，适当褪黑素对于处于对数生长期的细胞，具有一定的促进作用，但是差异并不显著，可见褪黑素在一定程度上影响了细胞的生长。

摘要： 在前期实验室建立的细胞培养体系的基础上，通过提取人α防御素HNP1基因RNA，运用RT-PCR的方法扩增得到相应基因并进行测序与鉴定。以EGFP-N3为骨架构建带有人防御素基因的表达载体pEGFP-N3-HNP1,通过转染将外源基因定点整合到牛成纤维细胞基因组中，获得含有人防御素基因的牛成纤维细胞，为利用核移植技术制备转基因牛胚胎提供理论依据和数据支持。

摘要： 共对320枚MII卵母细胞进行了核移植操作，得到融合胚229枚，融合率为72%(229/320)，卵裂率为56%(128/229),8-16细胞为46%(59/128)，桑堪胚率为1.56%(2/59),囊胚率1.56%(2/59)。普氏原羚-牛异种重构胚在体外发育到8-细胞时期存在发育阻滞现象。rn 异种克隆普氏原羚对濒危动物的保护具有十分积极的意义。动物异种克隆技术也许是再现某些已灭绝动物的唯一希望。同时，异种克隆为研究核质关系，基因表达调控，细胞分化和物种进化等提供了一个十分重要的模型。

摘要： 以山羊的胚胎细胞，卵丘细胞、体细胞克隆胚胎细胞为核供体，比较了以这三种细胞为核供体得到的重构胚的体外发育能力。结果显示，以体内受精所得桑椹胚为核供体的重构胚发育能力最高，卵裂率和囊胚率分别为81.25％和25.64%，以卵丘细胞为核供体的重构胚发育能力次之(79.68％，21.57％)，再克隆胚胎发育能力最低(64％，12.5％)，但是各组间差异不显著(p>0.05)。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法。本发明提供的提高核移植胚胎体外发育效率的方法，包括：将激活后的核移植重构胚，转入含BET蛋白抑制剂(+)‑JQ1的胚胎培养液中培养。本发明方法可以抑制细胞定向转录记忆，促进了核移植胚胎重编程，从而提高体细胞核移植胚胎的体外发育效率。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高猪核移植效率的方法，所述方法主要包括在体细胞核移植前，使用BET蛋白抑制剂(+)‑JQ1预处理供体细胞，然后使用处理后的供体细胞进行猪核移植胚胎构建。本发明方法简便，效果明显，一次处理多孔体细胞，可以生产大规模的克隆胚胎，且显著提高体细胞克隆胚胎体外发育效率。

摘要： 一种基于微流道的机器人化体细胞核移植操作方法。该方法的特点是引入的微流道用于存储细胞，引入了平行的双针分别用于细胞去核以及注核。该方法包括以下关键步骤：细胞的微流道存储，细胞的定位，细胞吸持，细胞去核，去核针与注核针的转换，细胞注核，最后释放已操作的细胞。实验结果表明该流程较传统体细胞核移植流程节约了41.7％的时间，并与手动体细胞核移植的存活率、成功率一致，有效的提升了体细胞核移植的效率与可重复性。

摘要： 本发明公开了用于构建LMNA基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。用于构建LMNA基因突变的基因编辑系统，其特征在于包含Cas9蛋白、LMNA‑T7‑gRNA1、LMNA‑T7‑gRNA3；所述的LMNA‑T7‑gRNA1的转录模板如SEQ ID NO.24所示，LMNA‑T7‑gRNA3的转录模板如SEQ ID NO.25所示；所述的基因编辑系统还包含核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的单链DNA作为Donor DNA。利用本发明所得到的靶基因突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。

摘要： 本发明公开了用于构建TARDBP基因突变的ALS模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。该基因编辑系统包含按照本发明所述方法制备的Cas9蛋白，针对TARDBP基因的gRNA以及含有TARDBP突变位点的单链Donor DNA。采用本发明构建并表达的Cas9高效蛋白联合体外转录的gRNA进行基因编辑，并对Cas9和gRNA的最佳用量配比进行了优化，配合合成的ssODN作为Donor DNA，最终获得靶标位点精确点突变的单细胞克隆比率高达22.5％，远高于常规的点突变效率(5％)。所构建的TARDBP基因突变猪细胞可用于进行体细胞克隆，生产肌萎缩侧索硬化症模型猪。

摘要： 本发明公开了用于构建CRYBB2基因突变的先天性白内障疾病模型猪核移植供体细胞的方法和系统。本发明提供了一种试剂盒，包括SEQ ID NO：18所示CRYBB2‑gRNA3、SEQ ID NO：19所示CRYBB2‑gRNA6和NCN蛋白。NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。试剂盒的用途：制备重组细胞；制备白内障模型猪；制备白内障细胞模型或白内障组织模型或白内障器官模型。本发明还提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将CRYBB2‑gRNA3、CRYBB2‑gRNA6和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。本发明对于白内障药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

摘要： 本发明公开了一种基因编辑系统及其在构建OCA‑1B型白化病模型猪核移植供体细胞中的应用。本发明提供的试剂盒，包括靶序列结合区如SEQ ID NO：18中第3‑22位核苷酸所示的TYR‑gRNA1、靶序列结合区如SEQ ID NO：19中第3‑22位核苷酸所示的TYR‑gRNA5、SEQ IDNO：20所示的TYR‑E4mut‑ss153和NCN蛋白；试剂盒的用途：制备重组细胞；制备白化病模型猪；制备白化病细胞模型或白化病组织模型或白化病器官模型。将所述重组细胞作为核移植供体细胞进行体细胞克隆，可以得到克隆猪，即为白化病模型猪。本发明对于白化病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

摘要： 本发明公开了用于构建vWF基因突变的血管性血友病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了SEQ ID NO：15所示gRNA‑vWF‑gU2、SEQ ID NO：16所示gRNA‑vWF‑gD1和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。试剂盒的用途：制备重组细胞；制备血管性血友病模型猪；制备血管性血友病细胞模型或血管性血友病组织模型或血管性血友病器官模型。本发明还提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将gRNA‑vWF‑gU2、gRNA‑vWF‑gD1和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。本发明对于血管性血友病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

摘要： 本发明公开了一种构建MRAP2基因突变的重症早发性肥胖症模型猪核移植供体细胞的方法。本发明提供了试剂盒，包括SEQ ID NO：16所示MRAP2‑gRNA2、SEQ ID NO：17所示MRAP2‑gRNA3、SEQ ID NO：18所示MRAP2‑mutant‑ss130和具有Cas9蛋白的融合蛋白。本发明还提供了一种制备重组细胞的方法：将MRAP2‑gRNA2、MRAP2‑gRNA3、MRAP2‑mutant‑ss130和NCN蛋白共转染猪细胞，从而用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子。本发明对于治疗肥胖症药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

摘要： 本发明公开了用于构建三基因(GHR基因、IGF1基因和IGF2基因)联合突变的小型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了一种试剂盒，包括SEQ ID NO：36所示GHR‑E5‑gRNA2、SEQ ID NO：37所示GHR‑E5‑gRNA3、SEQ ID NO：38所示IGF1‑E4‑gRNA1、SEQ ID NO：39所示IGF1‑E4‑gRNA2、SEQ ID NO：40所示IGF2‑E4‑gRNA2、SEQ ID NO：41所示IGF2‑E4‑gRNA7和NCN蛋白。NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。本发明采用CRISPR/Cas9技术联合双gRNA编辑进行了GHR基因、IGF1基因和IGF2基因的联合敲除，并获得了三个基因联合敲除的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育小型猪及生长发育障碍或迟缓模型猪奠定了基础。