一种构建MRAP2基因突变的重症早发性肥胖症模型猪核移植供体细胞的方法

摘要

本发明公开了一种构建MRAP2基因突变的重症早发性肥胖症模型猪核移植供体细胞的方法。本发明提供了试剂盒，包括SEQ ID NO：16所示MRAP2‑gRNA2、SEQ ID NO：17所示MRAP2‑gRNA3、SEQ ID NO：18所示MRAP2‑mutant‑ss130和具有Cas9蛋白的融合蛋白。本发明还提供了一种制备重组细胞的方法：将MRAP2‑gRNA2、MRAP2‑gRNA3、MRAP2‑mutant‑ss130和NCN蛋白共转染猪细胞，从而用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子。本发明对于治疗肥胖症药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体属于基因编辑技术领域，更具体涉及一种构建MRAP2基因突变的重症早发性肥胖症模型猪核移植供体细胞的方法，该方法基于CRISPR/Cas9系统及ssODN同源重组技术。

背景技术

肥胖症(Obesity)是指体脂肪累积过多而对健康造成负面影响的身体状态，可能导致寿命减短及各种健康问题。肥胖是全世界主要的可预防死因，也是21世纪最重要的公共卫生问题之一。目前成人与儿童的肥胖盛行率都在上升，且女性较男性更常发生。2013年，包括美国医学会和美国心脏协会等数个医学会将肥胖定义为一种疾病，即为肥胖症。2015年，全球有6亿名成人(13％)和4200万名五岁以下的孩童有肥胖问题。世卫组织更是发出警告，指出超重和肥胖是全球引起死亡的第五大风险，全球每年“胖死”的人至少280万。麦肯锡全球研究院发布的研究表明，肥胖症每年会对全球经济产生约2万亿美元的影响，相当于总GDP的2.8％。

现有研究表明，肥胖通常受到遗传和环境的共同影响，但肥胖症实际上是可遗传且由多基因作用的，只是不同人的易感性存在差异。在部分情况下，遗传性肥胖症是由致病突变直接干扰能量稳态或脂肪沉积，例如人类单基因肥胖病的发生。其中，黑素皮质素4受体(MC4R)基因的突变已被证实与人类肥胖症相关，而近期研究揭示黑素皮质素2受体辅助蛋白2(MRAP2)的突变也会造成肥胖症的发生。MRAP2直接与MC4R相互作用，并在MC4R激动剂作用基础上进一步增强MC4R下游信号传导，MRAP2功能丧失将导致MC4R信号转导受抑制，从而导致肥胖表型。MRAP2基因的功能丧失性突变可引起成年人及儿童的代谢综合征，表现为食欲亢进性肥胖、高血糖症和高血压，但并不存在下丘脑-垂体-肾上腺轴功能障碍，不同于其他单基因型肥胖症患者很少有肥胖且同时伴有高血糖和高血压的症状。MRAP2不仅调控黑素皮质素受体的活性，还参与其他G蛋白偶联受体的调控，在调节食欲和能量稳态方面都发挥重要作用。因此，迫切需要开发出基于MRAP2突变导致的重症早发性肥胖症动物模型以尽快解开发病机制谜团并为进一步的治疗奠定基础。

研究由MRAP2基因突变导致重症早发性肥胖症的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

同源重组(HDR)是通过序列同源性交换DNA序列信息：即修复模板中包含所需插入片段，修复模板的两端则是与插入位点附近具有序列同源性的重组臂。过去通常使用双链DNA(dsDNA)作为修复模板，但最近的研究揭示了单链寡核苷酸脱氧核苷酸(ssODN)作为HDR供体模板的优越性。首先，ssODN作为供体模板比dsDNA模板的插入位点特异性高，dsDNA模板容易产生随机插入。其次，ssODN对同源重组臂的长度要求比dsDNA模板更短，单侧30-60个碱基的重组臂设计可以获得高效且稳定的HDR，相比类似的dsDNA模板，其提供的插入效率更高。第三，dsDNA容易被NHEJ修复途径合并，从而导致同源臂的复制或者dsDNA模板的部分整合，而ssODN就不易产生这种现象。另外，dsDNAs对培养的细胞是有害的，线型或者质粒dsDNAs的转染效率较低，并使细胞产生不良反应，而ssODN模板在这些方面就更有优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建MRAP2基因突变的重症早发性肥胖症模型猪核移植供体细胞的方法。

本发明提供了一种试剂盒，包括MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和NCN蛋白。

本发明还提供了一种试剂盒，包括MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和PRONCN蛋白。

本发明还提供了一种试剂盒，包括MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和特异质粒。

以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。

本发明还提供了MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。

本发明还提供了MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。

本发明还提供了MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和特异质粒在制备试剂盒中的应用。

以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备肥胖症模型猪；(c)制备肥胖症细胞模型或肥胖症组织模型或肥胖症器官模型。

本发明还提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组细胞。

用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子的实现方式为：将MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和NCN蛋白共转染猪细胞。

所述共转染具体采用电击转染的方式。

电击转染的参数设置具体可为：1450V、10ms、3pulse。

所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与NeonTM transfection system电转仪。

MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和NCN蛋白的配比依次为：0.8-1.2μg MRAP2-gRNA2：0.8-1.2μg MRAP2-gRNA3：1.8-2.2μg MRAP2-mutant-ss130：3-5μgNCN蛋白。

MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和NCN蛋白的配比依次为：1μgMRAP2-gRNA2：1μg MRAP2-gRNA3：2μg MRAP2-mutant-ss130：4μg NCN蛋白。

猪细胞、MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8-1.2μg MRAP2-gRNA2：0.8-1.2μg MRAP2-gRNA3：1.8-2.2μg MRAP2-mutant-ss130：3-5μg NCN蛋白。

猪细胞、MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：1μg MRAP2-gRNA2：1μg MRAP2-gRNA3：2μg MRAP2-mutant-ss130：4μgNCN蛋白。

以上任一所述MRAP2-gRNA2为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3-22位核苷酸所示。

以上任一所述MRAP2-gRNA3为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3-22位核苷酸所示。

以上任一所述MRAP2-mutant-ss130为SEQ ID NO：18所示的单链DNA分子。

以上任一所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。

具体的，所述NCN蛋白如SEQ ID NO：3所示。

具体的，所述MRAP2-gRNA2如SEQ ID NO：16所示。

具体的，所述MRAP2-gRNA3如SEQ ID NO：17所示。

具体的，所述MRAP2-gRNA2如SEQ ID NO：11所示。

具体的，所述MRAP2-gRNA3如SEQ ID NO：12所示。

以上任一所述猪细胞为猪成纤维细胞。

以上任一所述猪细胞为猪原代成纤维细胞。

所述NCN蛋白的制备方法包括如下步骤：

(1)将质粒pKG-GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；

(2)采用液体培养基30℃培养所述重组菌，然后加入IPTG并进行25℃诱导培养，然后收集菌体；

(3)将收集的菌体进行菌体破碎，收集粗蛋白溶液；

(4)采用亲和层析从所述粗蛋白溶液中纯化具有His

(5)采用具有His

质粒pKG-GE4中具有SEQ ID NO：1中第5209-9852位核苷酸所示的融合基因。

所述NCN蛋白的制备方法具体包括如下步骤：

(1)将质粒pKG-GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

(2)将步骤(1)得到的重组菌接种至含氨苄青霉素的液体LB培养基，振荡培养；

(3)将步骤(2)得到的菌液接种至液体LB培养基，30℃、230rpm振荡培养至OD

(4)取步骤(3)得到的菌体，用PBS缓冲液洗涤；

(5)取步骤(4)得到的菌体，加入粗提缓冲液并悬浮菌体，然后进行菌体破碎，然后离心收集上清液，采用0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液；

(6)采用亲和层析从步骤(5)得到的滤液中纯化具有His

(7)取步骤(6)收集的过柱后溶液，使用超滤管浓缩，然后用25mM Tris-HCl(pH8.0)稀释；

(8)将具有His

(9)将完成步骤(8)的溶液与Ni-NTA树脂混匀，孵育，然后离心收集上清液；

(10)取步骤(9)得到的上清液，使用超滤管浓缩，然后加入酶贮存液中，即为NCN蛋白溶液。

采用亲和层析从步骤(5)得到的滤液中纯化具有His

首先采用5个柱体积的平衡液平衡Ni-NTA琼脂糖柱(流速为1ml/min)；然后上样50ml步骤(5)得到的滤液(流速为0.5-1ml/min)；然后用5个柱体积的平衡液洗涤柱子(流速为1ml/min)；然后用5个柱体积的缓冲液洗涤柱子(流速为1ml/min)，以去除杂蛋白；然后用10个柱体积的洗脱液以0.5-1ml/min的流速洗脱，收集过柱后溶液(90-100ml)。

以上任一所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号。

所述信号肽的功能为促进蛋白分泌表达。所述信号肽可选自大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)信号肽、金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽、大肠杆菌外膜蛋白(ompa)信号肽或任何其他原核基因的信号肽，优选为碱性磷酸酶信号肽(phoA signal peptide)。碱性磷酸酶信号肽用来引导目的蛋白分泌表达至细菌周质腔中，从而与细菌胞内蛋白分离，且分泌到细菌周质腔中的目的蛋白为可溶性表达，可被细菌周质腔中的信号肽酶裂解。

所述分子伴侣蛋白的功能为增加蛋白的可溶性。所述分子伴侣可为任何帮助形成二硫键的蛋白，优选为硫氧还原蛋白(TrxA蛋白)。硫氧还原蛋白，其能作为分子伴侣帮助所共表达的目的蛋白(例如Cas9蛋白)形成二硫键，提高蛋白的稳定性、折叠的正确性，增加目的蛋白的溶解性及活性。

所述蛋白标签的功能为用于蛋白纯化。所述标签可为His标签(His-Tag，His

所述蛋白酶酶切位点的功能为纯化后用于切除非功能区段，以释放天然形式Cas9蛋白。所述蛋白酶可选自肠激酶(Enterokinase)、因子Xa(Factor Xa)、凝血酶(Thrombin)、TEV蛋白酶(TEV protease)、HRV 3C蛋白酶(HRV 3C protease)、WELQut蛋白酶或任何其他内切蛋白酶，进一步优选为肠激酶。EK为肠激酶酶切位点，便于使用肠激酶切除所融合的TrxA-His区段，得到天然形式的Cas9蛋白。本申请使用带His标签的商品肠激酶酶切融合蛋白后，可通过一次亲和层析除去TrxA-His区段及带His标签的肠激酶，得到天然形式的Cas9蛋白，避免了多次纯化透析对目的蛋白的伤害和损耗。

所述核定位信号可为任何核定位信号，优选为SV40核定位信号和/或nucleoplasmin核定位信号。NLS为核定位信号，在Cas9的N端及C端分别设计了一个NLS位点，使Cas9能更有效地进入细胞核进行基因编辑。

所述Cas9蛋白可为saCas9或spCas9,优选为spCas9蛋白。

PRONCN蛋白具体如SEQ ID NO：2所示。

以上任一所述特异质粒自上游至下游依次包括如下元件：启动子、操纵子、核糖体结合位点、PRONCN蛋白的编码基因、终止子。

所述启动子具体可为T7启动子。T7启动子为原核表达强启动子，能高效驱动外源基因的表达。

所述操纵子具体可为Lac操纵子。Lac操纵子为乳糖诱导表达的调控元件，可在细菌生长至一定数量后，再用IPTG在低温下诱导目的蛋白的表达，可避免目的蛋白过早表达对宿主菌生长的影响，低温下诱导表达也显著提高所表达的目的蛋白的可溶性。

所述核糖体结合位点是蛋白翻译时的核糖体结合位点，对蛋白质的翻译是必要的。

所述终止子具体可为T7终止子。T7终止子可在目的基因的末端有效终止基因转录，避免目的基因之外的其他下游序列得到转录和翻译。

对于spCas9蛋白的密码子，本申请对其密码子进行了优化，使之完全适应本申请所选用的大肠杆菌高效表达菌株E.coli BL21(DE3)的密码子偏好，从而提高Cas9蛋白的表达水平。

T7启动子如SEQ ID NO：1中第5121-5139位核苷酸所示。

Lac操纵子如SEQ ID NO：1中第5140-5164位核苷酸所示。

核糖体结合位点如SEQ ID NO：1中第5178-5201位核苷酸所示。

碱性磷酸酶信号肽的编码序列如SEQ ID NO：1中第5209-5271位核苷酸所示。

TrxA蛋白的编码序列如SEQ ID NO：1中第5272-5598位核苷酸所示。

His-Tag的编码序列如SEQ ID NO：1中第5620-5637位核苷酸所示。

肠激酶酶切位点的编码序列如SEQ ID NO：1中第5638-5652位核苷酸所示。

核定位信号的编码序列如SEQ ID NO：1中第5656-5670位核苷酸所示。

spCas9蛋白的编码序列如SEQ ID NO：1中第5701-9801位核苷酸所示。

核定位信号的编码序列如SEQ ID NO：1中第9802-9849位核苷酸所示。

T7终止子如SEQ ID NO：1中第9902-9949位核苷酸。

具体的，所述特异质粒为质粒pKG-GE4。

质粒pKG-GE4中具有SEQ ID NO：1中第5121-9949位核苷酸所示的DNA分子。

具体的，以上任一所述质粒pKG-GE4如SEQ ID NO：1所示。

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的重组细胞。

本发明还保护所述重组细胞在制备肥胖症模型猪中的应用。

将所述重组细胞作为核移植供体细胞进行体细胞克隆，可以得到克隆猪，即为肥胖症模型猪。

本发明还保护利用所述重组细胞制备的模型猪的猪组织，即肥胖症组织模型。

本发明还保护利用所述重组细胞制备的模型猪的猪器官，即肥胖症器官模型。

本发明还保护利用所述重组细胞制备的模型猪的猪细胞，即肥胖症细胞模型。

本发明还保护所述重组细胞、所述肥胖症组织模型、所述肥胖症器官模型、所述肥胖症细胞模型或者所述肥胖症模型猪的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：

(d1)筛选治疗肥胖症的药物；

(d2)进行肥胖症药物的药效评价；

(d3)进行肥胖症的基因治疗和/或细胞治疗的疗效评价；

(d4)研究肥胖症的发病机制。

以上任一所述猪具体可为从江香猪。

以上任一所述肥胖症可为重症早发性肥胖症。

重症早发性肥胖症是由MRAP2基因突变引起的。

所述MRAP2基因突变为：MRAP2基因的起始密码子及其周边核苷酸丢失。

所述MRAP2基因突变为MRAP2基因缺失了如下区段：cggagATGtc。

猪MRAP2基因信息：编码黑素皮质素2受体辅助蛋白2；位于1号染色体；GeneID为100515980，Sus scrofa。

猪MRAP2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

猪MRAP2基因具有SEQ ID NO：9所示的DNA区段。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。

大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。

而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、免疫学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本也较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。

(2)发明所构建的载体，使用了能够高效表达目的蛋白的强启动子T7-lac来进行目的蛋白的表达，用细菌周质蛋白碱性磷酸酶(phoA)的信号肽来引导目的蛋白分泌表达至细菌周质腔中，从而与细菌胞内蛋白分离，且分泌到细菌周质腔中的目的蛋白为可溶性表达。同时还采用硫氧还原蛋白TrxA与Cas9蛋白融合表达，TrxA能帮助所共表达的目的蛋白形成二硫键，提高蛋白的稳定性、折叠的正确性，增加目的蛋白的溶解性及活性。为了方便目的蛋白的纯化，设计了His标签，可以通过一步法Ni柱亲和层析纯化目的蛋白，极大地简化了目的蛋白的纯化流程。同时在His标签后设计了一个肠激酶酶切位点，便于切除所融合的TrxA-His多肽片段，得到天然形式的Cas9蛋白。利用带His标签的肠激酶酶切融合蛋白后，可通过一次亲和层析除去TrxA-His多肽片段及带His标签的肠激酶，得到天然形式的Cas9蛋白，避免了多次纯化透析对目的蛋白的伤害和损耗。同时，本发明也在Cas9的N端及C端分别设计了一个NLS位点，使Cas9能更有效地进入细胞核进行基因编辑。另外，本发明选择了E.coli BL21(DE3)菌株为目的蛋白表达菌株，该菌株可高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET-32a)的外源基因。同时，对于Cas9蛋白的密码子，本发明进行了密码子优化，使之完全适应表达菌株的密码子偏好，从而提高目的蛋白的表达水平。另外，本发明在细菌生长至一定数量后，再用IPTG在低温下诱导目的蛋白的表达，可避免目的蛋白过早表达对宿主菌生长的影响，低温下诱导表达也显著提高所表达的目的蛋白的可溶性。经过上述各项优化设计及实验实施，所得到的Cas9蛋白活性比商品Cas9蛋白有了极显著的提高。

(3)采用本发明构建并表达的Cas9高效蛋白联合体外转录的gRNA进行基因编辑，并对Cas9和gRNA的最佳用量配比进行了优化，配合合成的ssODN作为Donor DNA，最终获得靶位点缺失突变的单细胞克隆比率高达22％，远高于常规的定点修饰效率(<5％)。

(4)利用本发明所得到的靶位点缺失突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶位点缺失突变的克隆猪，并且该突变可稳定遗传。

在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得定点修饰后代的概率非常低(低于1％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。因此，本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑以及ssODN同源重组并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。

本发明采用CRISPR/Cas9技术联合ssODN同源重组技术进行了MRAP2基因的定点缺失，模拟重症早发性肥胖症的自然发病遗传特征，并获得了MRAP2基因定点缺失的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育重症早发性肥胖症疾病模型猪奠定了基础。该模型猪将为研究由MRAP2基因缺失突变导致重症早发性肥胖症的发病机制及药物研发提供有力的实验工具。

本发明为通过基因编辑手段获得MRAP2基因定点缺失的重症早发性肥胖症模型猪奠定了坚实的基础，将有助于研究并揭示MRAP2基因缺失导致重症早发性肥胖症的发病机制，也可用于进行药物筛选、药效检测、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，进而为成功治疗人类重症早发性肥胖症提供有力的实验手段。本发明对于治疗肥胖症药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

附图说明

图1为质粒pET-32a的结构示意图。

图2为质粒pKG-GE4的结构示意图。

图3为实施例3中gRNA与NCN蛋白用量配比优化的电泳图。

图4为实施例3中NCN蛋白与商品Cas9蛋白的基因编辑效率比较的电泳图。

图5为实施例4中用命名为1的猪的耳组织提取基因组作为模板采用不同引物对进行PCR扩增的电泳图。

图6为实施例4中分别以18只猪的基因组DNA为模板采用MRAP2-E4-F237和MRAP2-E4-R606组成的引物对进行PCR扩增的电泳图。

图7为实施例4中不同靶点的编辑效率比较的电泳图。

图8为实施例5中的电泳图。

图9为编号为6的单细胞克隆的正向和反向测序同时与靶位点野生型序列的比对结果。

图10为编号为3的单细胞克隆的正向和反向测序同时与靶位点野生型序列的比对结果。

图11为编号为1的单细胞克隆的正向和反向测序同时与靶位点野生型序列的比对结果。

图12为编号为10的单细胞克隆的正向和反向测序同时与靶位点野生型序列的比对结果。

图13为编号为18的单细胞克隆的正向和反向测序同时与靶位点野生型序列的比对结果。

图14为编号为2的单细胞克隆的正向和反向测序同时与靶位点野生型序列的比对结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中构建的重组质粒，均已进行测序验证。商品Cas9-A蛋白为市售的效果好的Cas9蛋白。商品Cas9-B蛋白为市售的效果好的Cas9蛋白。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％Penicillin-Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37℃，5％CO

实施例中采用的猪原代成纤维细胞均是用初生从江香猪耳组织制备得到的。制备猪原代成纤维细胞的方法：①取猪耳组织0.5g，去除毛发及骨组织，然后用75％酒精浸泡30-40s，然后用含5％(体积比)Penicillin-Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 0.1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培养液并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为10cm的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后重悬于完全培养液。用于进行后续电转实验。

实施例1、原核Cas9高效表达载体的构建

质粒pET-32a的结构示意图见图1。

质粒pKG-GE4是以质粒pET-32a为出发质粒进行改造得到的。质粒pET32a-T7lac-phoA:SP-TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS-T7ter(简称质粒pKG-GE4)，如SEQ ID NO：1所示，为环形质粒，结构示意图见图2。

SEQ ID NO：1中，第5121-5139位核苷酸组成T7启动子，第5140-5164位核苷酸编码Lac操纵子(lac operator)，第5178-5201位核苷酸组成核糖体结合位点(RBS),第5209-5271位核苷酸编码碱性磷酸酶信号肽(phoA signal peptide),第5272-5598位核苷酸编码TrxA蛋白，第5620-5637位核苷酸编码His-Tag，第5638-5652位核苷酸编码肠激酶酶切位点(EK酶切位点)，第5656-5670位核苷酸编码核定位信号，第5701-9801位核苷酸编码spCas9蛋白，第9802-9849位核苷酸编码核定位信号，第9902-9949位核苷酸组成T7终止子。编码spCas9蛋白的核苷酸已进行针对大肠杆菌BL21(DE3)菌株的密码子优化。

质粒pKG-GE4的主要改造如下：①保留了TrxA蛋白的编码区域，TrxA蛋白可以帮助所表达的目的蛋白形成二硫键、增加目的蛋白的溶解性及活性；在TrxA蛋白的编码区域之前加入碱性磷酸酶信号肽的编码序列，碱性磷酸酶信号肽可以引导所表达的目的蛋白分泌至细菌的膜周质腔中并可被原核周质信号肽酶酶切；②在TrxA蛋白的编码序列之后增加His-Tag的编码序列，His-Tag可用于所表达的目的蛋白的富集；③在His-Tag的编码序列下游增加肠激酶酶切位点DDDDK(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)的编码序列，纯化出的蛋白将在肠激酶作用下去除His-Tag和上游所融合的TrxA蛋白；④插入密码子优化后的适宜大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达的Cas9基因，同时在该基因的上游和下游均增加核定位信号编码序列，增加后期纯化出的Cas9蛋白的核定位能力。

质粒pKG-GE4中的融合基因如SEQ ID NO：1中第5209-9852位核苷酸所示，编码SEQID NO：2所示的融合蛋白(融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS，简称为PRONCN蛋白)。由于碱性磷酸酶信号肽以及肠激酶酶切位点的存在，融合蛋白被肠激酶酶切后形成SEQ IDNO：3所示的蛋白质，将SEQ ID NO：3所示的蛋白质命名为NCN蛋白。

实施例2、NCN蛋白的制备和纯化

一、诱导表达

1、将质粒pKG-GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

2、将步骤1得到的重组菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜。

3、将步骤2得到的菌液接种至液体LB培养基，30℃、230rpm振荡培养至OD

4、取步骤3得到的菌体，用PBS缓冲液洗涤。

二、融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS的纯化

1、取步骤一得到的菌体，加入粗提缓冲液并悬浮菌体，然后采用均质机进行菌体破碎(1000par循环三次)，然后4℃、15000g离心30min，收集上清液，上清液采用0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液。本步骤中，每g湿重的菌体配比10ml粗提缓冲液。

粗提缓冲液：含20mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5M NaCl、5mM Imidazole、1mM PMSF，余量为ddH

2、采用亲和层析纯化融合蛋白。

首先采用5个柱体积的平衡液平衡Ni-NTA琼脂糖柱(流速为1ml/min)；然后上样50ml步骤1得到的滤液(流速为0.5-1ml/min)；然后用5个柱体积的平衡液洗涤柱子(流速为1ml/min)；然后用5个柱体积的缓冲液洗涤柱子(流速为1ml/min)，以去除杂蛋白；然后用10个柱体积的洗脱液以0.5-1ml/min的流速洗脱，收集过柱后溶液(90-100ml)。

Ni-NTA琼脂糖柱：金斯瑞，L00250/L00250-C，填料为10ml。

平衡液：含20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl、5mM Imidazole，余量为ddH

缓冲液：含20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl、50mM Imidazole，余量为ddH

洗脱液：含20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl、500mM Imidazole，余量为ddH

三、融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS的酶切与NCN蛋白的纯化

1、取15ml步骤二收集的过柱后溶液，使用Amicon超滤管(Sigma,UFC9100，容量为15ml)将其浓缩至200μl，然后用25mM Tris-HCl(pH8.0)稀释至1ml。采用6个超滤管，共得到6ml。

2、将商品来源的具有His

3、取完成步骤2的溶液(约6ml)，与480μl Ni-NTA树脂(金斯瑞，L00250/L00250-C)混匀，在室温下旋转混匀15min，然后7000g离心3min，收集上清液(4-5.5ml)。

4、取步骤3得到的上清液，使用Amicon超滤管(Sigma,UFC9100，容量为15ml)将其浓缩至200μl，然后加入酶贮存液中，调整蛋白浓度为5mg/ml，即为NCN蛋白溶液。

经测序，NCN蛋白溶液中的蛋白质，N端15个氨基酸残基如SEQ ID NO：3第1至15位所示，即NCN蛋白。

用于后续实施例的NCN蛋白均由NCN蛋白溶液提供。

酶贮存液(pH7.4)：含10mM Tris,300mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,50％(体积比)甘油，余量为ddH

实施例3、NCN蛋白的性能

选择靶向TTN基因的2个gRNA靶点如下：

TTN-gRNA1：AGAGCACAGTCAGCCTGGCG；

TTN-gRNA2：CTTCCAGAATTGGATCTCCG。

用于鉴定包含TTN基因中gRNA的靶点片段的引物如下：

TTN-F55：TACGGAATTGGGGAGCCAGCGGA；

TTN-R560：CAAAGTTAACTCTCTGTGTCT。

一、制备gRNA

1、制备TTN-T7-gRNA1转录模板和TTN-T7-gRNA2转录模板

TTN-T7-gRNA1转录模板为双链DNA分子，如SEQ ID NO：4所示。

TTN-T7-gRNA2转录模板为双链DNA分子，如SEQ ID NO：5所示。

2、体外转录得到gRNA

取TTN-T7-gRNA1转录模板，采用Transcript Aid T7 High Yield TranscriptionKit(Fermentas，K0441)进行体外转录，然后用MEGA clear

取TTN-T7-gRNA2转录模板，采用Transcript Aid T7 High Yield TranscriptionKit(Fermentas，K0441)进行体外转录，然后用MEGA clear

二、gRNA与NCN蛋白用量配比优化

1、共转染猪原代成纤维细胞

第一组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：0.5μg TTN-gRNA1：0.5μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。

第二组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：0.75μg TTN-gRNA1：0.75μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。

第三组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。

第四组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1.25μg TTN-gRNA1：1.25μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。

第五组：将TTN-gRNA1和TTN-gRNA2共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2。

共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。

2、完成步骤1后，采用完全培养液培养12-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。电转后培养总时间为48小时。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用TTN-F55和TTN-R560组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。

电泳图见图3。505bp条带为野生型条带(WT)，254bp左右(野生型条带505bp理论缺失251bp)为缺失突变条带(MT)。

基因缺失突变效率＝(MT灰度/MT条带bp数)/(WT灰度/WT条带bp数+MT灰度/MT条带bp数)×100％。第一组基因缺失突变效率为19.9％，第二组基因缺失突变效率为39.9％，第三组基因缺失突变效率为79.9％，第四组基因缺失突变效率为44.3％。第五组未发生突变。

结果表明，当两个gRNA与NCN蛋白的质量配比为1：1：4，实际用量为1μg：1μg：4μg时基因编辑效率最高。因此，确定两个gRNA与NCN蛋白的最适用量为1μg：1μg：4μg。

三、NCN蛋白与商品Cas9蛋白的基因编辑效率比较

1、共转染猪原代成纤维细胞

Cas9-A组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和商品Cas9-A蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2：4μg Cas9-A蛋白。

pKG-GE4组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。

Cas9-B组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和商品Cas9-B蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2：4μg Cas9-B蛋白。

Control组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2。

共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。

2、完成步骤1后，采用完全培养液培养12-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。电转后培养总时间为48小时。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用TTN-F55和TTN-R560组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。

电泳图见图4。采用商品Cas9-A蛋白的基因缺失突变效率为28.5％，采用NCN蛋白的基因缺失突变效率为85.6％，采用商品Cas9-B蛋白的基因缺失突变效率为16.6％。

结果表明，与采用商品的Cas9蛋白相比，采用本发明制备的NCN蛋白使得基因编辑效率显著提高。

实施例4、MRAP2基因高效gRNA靶点的筛选

猪MRAP2基因信息：编码黑素皮质素2受体辅助蛋白2；位于1号染色体；GeneID为100515980，Sus scrofa。猪MRAP2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示(猪MRAP2基因存在多种不同的内含子剪切形式，SEQ ID NO：8为其中一种剪切形式下编码的蛋白质)。基因组DNA中，猪MRAP2基因具有8个外显子。与人类重度早发性肥胖症相关的MRAP2基因异变(缺失MRAP2基因起始密码子ATG及其上下游共10bp,即cggagATGtc)，对应于猪MRAP2基因第4外显子(相应的缺失为tggaaATGtc)。猪基因组DNA中，MRAP2基因部分序列(含第4外显子及其上下游各500bp)如SEQ ID NO：9所示。

质粒pKG-GE3，为环形质粒，如专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：2所示。专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：2中，第911-6706位核苷酸形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。

pKG-U6gRNA载体即质粒pKG-U6gRNA，为环形质粒，如专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：3所示。专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到gRNA。

一、MRAP2基因外显子4预设缺失突变位点及邻近基因组序列保守性分析

18只初生从江香猪，其中雌性10只(分别命名为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、雄性8只(分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H)。

MRAP2-E4-F237：TTGCTTGATGACCTCCTGAATGT；

MRAP2-E4-R606：ATACACCCCTGAGCAATGTG；

MRAP2-E4-F238：TGCTTGATGACCTCCTGAATGT；

MRAP2-E4-R646：CCCACTAAGGGACTCTCTCAA。

用命名为1的猪的耳组织提取基因组作为模板，采用不同引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图5。图5中：组1：采用MRAP2-E4-F237和MRAP2-E4-R606组成的引物对；组2：采用MRAP2-E4-F237和MRAP2-E4-R646组成的引物对；组3：采用MRAP2-E4-F238和MRAP2-E4-R606组成的引物对；组4：采用MRAP2-E4-F238和MRAP2-E4-R646组成的引物对。结果表明，优选采用MRAP2-E4-F237和MRAP2-E4-R606组成的引物对进行目的片段扩增。

分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用MRAP2-E4-F237和MRAP2-E4-R606组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图6。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的MRAP2基因序列进行比对分析。选择18只猪中共有的保守区进行gRNA靶点的设计。

二、筛选靶点

通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。

4个靶点分别如下：

MRAP2-E4-gRNA1：AGGTGGAAATGTCTTCCCAG；

MRAP2-E4-gRNA2：CCACCTGCAAAAACAGAGAG；

MRAP2-E4-gRNA3：TCTGTTAGAAATTAACCTCT；

MRAP2-E4-gRNA4：CCTCTCTCTGTTTTTGCAGG。

三、制备重组质粒

取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。

分别合成MRAP2-E4-gRNA1-S和MRAP2-E4-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA1)。质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA1)表达SEQ ID NO：10所示的sgRNA

sgRNA

AGGUGGAAAUGUCUUCCCAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成MRAP2-E4-gRNA2-S和MRAP2-E4-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA2)。质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA2)表达SEQ ID NO：11所示的sgRNA

sgRNA

CCACCUGCAAAAACAGAGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成MRAP2-E4-gRNA3-S和MRAP2-E4-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA3)。质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA3)表达SEQ ID NO：12所示的sgRNA

sgRNA

UCUGUUAGAAAUUAACCUCUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成MRAP2-E4-gRNA4-S和MRAP2-E4-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA4)表达SEQ ID NO：13所示的sgRNA

sgRNA

CCUCUCUCUGUUUUUGCAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

MRAP2-E4-gRNA1-S：caccgAGGTGGAAATGTCTTCCCAG；

MRAP2-E4-gRNA1-A：aaacCTGGGAAGACATTTCCACCTc；

MRAP2-E4-gRNA2-S：caccgCCACCTGCAAAAACAGAGAG；

MRAP2-E4-gRNA2-A：aaacCTCTCTGTTTTTGCAGGTGGc；

MRAP2-E4-gRNA3-S：caccgTCTGTTAGAAATTAACCTCT；

MRAP2-E4-gRNA3-A：aaacAGAGGTTAATTTCTAACAGAc；

MRAP2-E4-gRNA4-S：caccgCCTCTCTCTGTTTTTGCAGG；

MRAP2-E4-gRNA4-A：aaacCCTGCAAAAACAGAGAGAGGc。

MRAP2-E4-gRNA1-S、MRAP2-E4-gRNA1-A、MRAP2-E4-gRNA2-S、MRAP2-E4-gRNA2-A、MRAP2-E4-gRNA3-S、MRAP2-E4-gRNA3-A、MRAP2-E4-gRNA4-S、MRAP2-E4-gRNA4-A均为单链DNA分子。

四、不同靶点的编辑效率比较

1、共转染

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA1)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA1)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA2)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA2)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA3)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA3)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA4)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MRAP2-E4-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转操作。

共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。

2、完成步骤1后，采用完全培养液培养12-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。电转后培养总时间为48小时。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，裂解细胞，提取基因组DNA，采用MRAP2-E4-F237和MRAP2-E4-R606组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。检测细胞靶基因突变情况，电泳图见图7。

将目的产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为32％、63％、46％、17％，第五组未发生基因编辑。结果表明，MRAP2-E4-gRNA2和MRAP2-E4-gRNA3编辑效率较高。

实施例5、制备MRAP2基因精确缺失突变的单细胞克隆

选用实施例4中筛到的两个高效gRNA靶点(MRAP2-E4-gRNA2和MRAP2-E4-gRNA3)。

一、制备gRNA

1、制备MRAP2-T7-gRNA2转录模板和MRAP2-T7-gRNA3转录模板

MRAP2-T7-gRNA2转录模板为双链DNA分子，如SEQ ID NO：14所示。

MRAP2-T7-gRNA3转录模板为双链DNA分子，如SEQ ID NO：15所示。

2、体外转录得到gRNA

取MRAP2-T7-gRNA2转录模板，采用Transcript Aid T7 High YieldTranscription Kit(Fermentas，K0441)进行体外转录，然后用MEGA clear

取MRAP2-T7-gRNA3转录模板，采用Transcript Aid T7 High YieldTranscription Kit(Fermentas，K0441)进行体外转录，然后用MEGA clear

MRAP2-gRNA2(SEQ ID NO.16)：

GGCCACCUGCAAAAACAGAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU。

MRAP2-gRNA3(SEQ ID NO.17)：

GGUCUGUUAGAAAUUAACCUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU。

二、合成在MRAP2基因靶位点具有10个核苷酸缺失的单链Donor DNA

与人类重度早发性肥胖症相关的MRAP2基因异变(缺失MRAP2基因起始密码子ATG及其上下游共10bp,即cggagATGtc)，对应于猪MRAP2基因第4外显子(相应的缺失为tggaaATGtc)。

合成单链Donor DNA，该单链Donor DNA除靶位点的10个核苷酸缺失外还含有MRAP2-E4-gRNA2和MRAP2-E4-gRNA3靶点PAM或邻近PAM的3’端序列同义突变。该单链DonorDNA命名为MRAP2-mutant-ss130。

MRAP2-mutant-ss130如SEQ ID NO：18所示。

三、转染猪原代成纤维细胞

1、将MRAP2-gRNA2、MRAP2-gRNA3、MRAP2-mutant-ss130和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg MRAP2-gRNA2：1μg MRAP2-gRNA3：2μgMRAP2-mutant-ss130：4μg NCN蛋白。共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。

2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。电转后培养总时间为48小时。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后用完全培养液洗涤，然后用完全培养液重悬，然后分别挑取各个单克隆转移到96孔板中(每个孔1个细胞，每个孔中装有100μl完全培养液)，培养2周(每2-3天更换新的完全培养液)。

4、完成步骤3后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞(每孔得到的细胞，约2/3接种到装有完全培养液的6孔板中，剩余的1/3收集在1.5mL离心管中)。

5、取步骤4的6孔板，培养直至细胞长至80％汇合度，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。

6、取步骤4的离心管，取细胞，进行细胞裂解并提取基因组DNA，采用MRAP2-E4-F237和MRAP2-E4-R606组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。将猪原代成纤维细胞作为野生型对照(WT)。电泳图见图8。图8中的泳道编号与表1中的细胞编号一致。

7、完成步骤6后，回收PCR扩增产物并测序。

猪原代成纤维细胞的测序结果只有一种，其基因型为纯合野生型。如果某一单细胞克隆的测序结果有两种，一种与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，另一种与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为杂合型；如果某一单细胞克隆的测序结果为两种，均与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为双等位基因不同突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为双等位基因相同突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，该单细胞克隆的基因型为纯合野生型。

结果见表1。

编号为6、14、22、29、41的单细胞克隆的基因型为纯合野生型。编号为3、4、8、9、16、17、18、23、24、26、28、30、32、33、35、38、40、42、44、46、47、50的单细胞克隆的基因型为杂合型。编号为1、11、12、21、25、27、31、34、37、39、43、45的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同突变型。编号为2、5、7、10、13、15、19、20、36、48、49的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同突变型。得到MRAP2基因外显子4基因编辑单细胞克隆的比率为90％。

编号为18、44的单细胞克隆为靶位点缺失突变的杂合型(即两条同源染色体中的一条完成了单链Donor DNA的替换)。编号为11、25、27、31、37、39、43的单细胞克隆为靶位点缺失突变的双等位基因不同突变型(即两条同源染色体中的一条完成了单链Donor DNA的替换)。编号为2、49的单细胞克隆为靶位点缺失突变的双等位基因相同突变型(即两条同源染色体均完成了单链Donor DNA的替换)。得到靶位点缺失突变的单细胞克隆(即编号为2、11、18、25、27、31、37、39、43、44、49的单细胞克隆)的比率为22％。

示例性的测序比对结果如图9至图14。图9是编号为6的单细胞克隆的正向测序和反向测序与靶位点野生型序列的比对结果，为纯合野生型。图10是编号为3的单细胞克隆的正向测序和反向测序与靶位点野生型序列的比对结果，为杂合型。图11是编号为1的单细胞克隆的正向测序和反向测序同时与靶位点野生型序列的比对结果，为双等位基因不同突变型。图12是编号为10的单细胞克隆的正向测序和反向测序与靶位点野生型序列的比对结果，为双等位基因相同突变型。图13是编号为18的单细胞克隆的正向测序和反向测序与靶位点野生型序列的比对结果，为靶位点缺失突变的杂合型。图14是编号为2的单细胞克隆的正向测序和反向测序与靶位点野生型序列的比对结果，为靶位点缺失突变的双等位基因相同突变型。

表1 MRAP2基因外显子4缺失突变单细胞克隆的基因型测定结果

注：靶位点缺失突变指的是完成了单链Donor DNA的替换；单链Donor DNA的替换即用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代了染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子。

编号为2、49的单细胞克隆为靶位点缺失突变的双等位基因相同突变型(即两条同源染色体均完成了单链Donor DNA的替换)。靶位点缺失突变的双等位基因相同突变型细胞可用于进行后续的克隆猪生产。将细胞作为核移植供体细胞进行体细胞克隆，可以得到克隆猪，即为重症早发性肥胖症模型猪。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 南京启真基因工程有限公司

<120> 一种构建MRAP2基因突变的重症早发性肥胖症模型猪核移植供体细胞的方法

<130> GNCYX212111

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9974

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840

tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960

cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020

aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140

tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520

cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580

gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640

gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700

catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760

tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820

ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880

tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940

ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000

aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060

gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120

tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180

acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240

cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300

cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360

gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420

cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480

gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540

tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600

atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720

gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780

tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840

cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900

tcggtatcgt cgtatcccac taccgagatg tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960

atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020

atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080

tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140

cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200

aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260

ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320

tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380

tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440

gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500

gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560

gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620

ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680

taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740

ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800

atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860

tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920

gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980

gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040

aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100

cgatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 5160

ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaaacaaagc 5220

actattgcac tggcactctt accgttactg tttacccctg tgacaaaagc catgagcgat 5280

aaaattattc acctgactga cgacagtttt gacacggatg tactcaaagc ggacggggcg 5340

atcctcgtcg atttctgggc agagtggtgc ggtccgtgca aaatgatcgc cccgattctg 5400

gatgaaatcg ctgacgaata tcagggcaaa ctgaccgttg caaaactgaa catcgatcaa 5460

aaccctggca ctgcgccgaa atatggcatc cgtggtatcc cgactctgct gctgttcaaa 5520

aacggtgaag tggcggcaac caaagtgggt gcactgtcta aaggtcagtt gaaagagttc 5580

ctcgacgcta acctggccgg ttctggttct ggccatatgc accatcatca tcatcatgac 5640

gatgacgata agatgcccaa aaagaaacga aaggtgggta tccacggagt cccagcagcc 5700

gacaaaaaat atagcatcgg cctggacatc ggtaccaaca gcgttggctg ggcagtgatc 5760

actgatgaat acaaagttcc atccaaaaaa tttaaagtac tgggcaacac cgaccgtcac 5820

tctatcaaaa aaaacctgat tggtgctctg ctgtttgaca gcggcgaaac tgctgaggct 5880

acccgtctga aacgtacggc tcgccgtcgc tacactcgtc gtaaaaaccg catctgttat 5940

ctgcaggaaa ttttctctaa cgaaatggca aaagttgatg atagcttctt tcatcgtctg 6000

gaagagagct tcctggtgga agaagataaa aaacacgaac gtcacccgat tttcggtaac 6060

attgtggatg aggttgccta ccacgagaaa tatccgacca tctaccatct gcgtaaaaaa 6120

ctggttgata gcactgacaa agcggatctg cgtctgatct acctggctct ggcacacatg 6180

atcaaattcc gtggtcactt cctgatcgaa ggtgatctga accctgataa ctccgacgtg 6240

gacaaactgt tcattcagct ggttcagacc tataaccagc tgttcgaaga aaacccgatc 6300

aacgcgtccg gtgtagacgc taaggcaatt ctgtctgcgc gtctgtctaa gtctcgtcgt 6360

ctggaaaacc tgattgcgca actgccaggt gaaaagaaaa acggcctgtt cggcaatctg 6420

atcgccctgt ccctgggtct gactccgaac tttaaatcca actttgacct ggcggaagat 6480

gccaagctgc agctgagcaa agatacctat gacgatgacc tggataacct gctggcacag 6540

atcggtgatc agtatgccga tctgttcctg gccgcgaaaa acctgtctga tgcgattctg 6600

ctgtctgata tcctgcgcgt taacactgaa attactaaag cgccgctgag cgcatccatg 6660

attaaacgtt acgatgaaca ccaccaggat ctgaccctgc tgaaagcgct ggtgcgtcag 6720

cagctgccgg aaaaatacaa ggagatcttc ttcgaccaga gcaaaaacgg ttacgcgggc 6780

tacattgatg gtggtgcatc tcaggaggaa ttctacaaat tcattaaacc gatcctggaa 6840

aaaatggatg gtactgaaga gctgctggtt aaactgaatc gtgaagatct gctgcgcaaa 6900

cagcgtacct tcgataacgg ttccatcccg catcagattc atctgggcga actgcacgct 6960

atcctgcgcc gtcaggaaga cttttatccg ttcctgaaag acaaccgtga gaaaattgaa 7020

aaaatcctga ccttccgtat tccgtactat gtaggtccgc tggcgcgtgg taactcccgt 7080

ttcgcttgga tgacccgcaa aagcgaagaa accatcaccc cgtggaattt cgaagaagtc 7140

gttgacaaag gcgcgtccgc gcagtctttc atcgaacgca tgacgaactt cgacaaaaac 7200

ctgccgaacg agaaagtgct gccgaaacac tctctgctgt acgagtactt cactgtgtac 7260

aacgaactga ccaaagtgaa atacgtcacc gaaggtatgc gtaaaccggc attcctgtcc 7320

ggtgagcaaa aaaaagcaat cgtggatctg ctgttcaaaa ccaaccgtaa agtaaccgtg 7380

aaacagctga aggaagacta tttcaagaaa atcgaatgtt ttgattctgt tgaaatctcc 7440

ggcgtggaag atcgcttcaa tgcgtccctg ggtacgtatc acgacctgct gaaaattatc 7500

aaagacaaag attttctgga caacgaggaa aacgaagaca tcctggagga tattgtactg 7560

accctgaccc tgttcgaaga ccgtgagatg atcgaagaac gcctgaaaac ctacgcccac 7620

ctgttcgatg acaaggtaat gaagcagctg aaacgtcgtc gttataccgg ctggggtcgt 7680

ctgtcccgta aactgatcaa tggcatccgt gataaacagt ctggcaaaac catcctggac 7740

ttcctgaaat ccgacggttt cgcgaatcgt aacttcatgc aactgattca tgacgattct 7800

ctgactttca aagaagacat ccagaaagca caggtttccg gccagggtga ctctctgcac 7860

gagcacattg ccaatctggc tggttctccg gctattaaaa agggtattct gcagactgtg 7920

aaagtagttg atgagctggt caaagtaatg ggccgtcaca agccggaaaa cattgtgatc 7980

gaaatggcac gtgaaaacca gacgacccag aaaggtcaga aaaactctcg tgaacgcatg 8040

aaacgtatcg aagaaggcat caaagaactg ggctctcaga tcctgaagga acaccctgta 8100

gaaaataccc agctgcagaa cgaaaagctg tatctgtatt acctgcagaa cggccgcgat 8160

atgtatgtgg accaggaact ggatatcaac cgcctgtccg attacgatgt agatcacatc 8220

gtgccgcaaa gcttcctgaa agacgacagc attgacaaca aagtactgac ccgttctgat 8280

aagaaccgtg gcaaatccga taacgtcccg tctgaagaag ttgttaaaaa aatgaaaaac 8340

tattggcgtc agctgctgaa cgcgaaactg atcacccagc gtaagttcga caatctgact 8400

aaagctgagc gcggtggtct gtccgaactg gataaagcgg gttttatcaa acgccagctg 8460

gttgaaaccc gtcagatcac gaagcacgtt gcgcagattc tggactctcg tatgaacacc 8520

aaatacgacg aaaacgacaa actgatccgc gaggttaagg ttatcaccct gaaaagcaaa 8580

ctggtatccg attttcgtaa agactttcag ttctacaaag tgcgcgaaat taacaactat 8640

caccacgctc acgatgcata tctgaatgca gttgttggca cggcgctgat caaaaagtat 8700

ccgaaactgg aatctgaatt cgtatacggc gattacaaag tgtatgacgt tcgtaagatg 8760

atcgcaaaat ccgagcagga aattggtaag gcgacggcga aatacttctt ttattccaat 8820

attatgaact ttttcaaaac cgaaatcacc ctggcgaatg gtgaaattcg taaacgcccg 8880

ctgatcgaaa ccaacggtga aactggtgaa atcgtttggg acaaaggccg cgacttcgcg 8940

accgtgcgta aagttctgtc tatgccgcaa gtgaacatcg tcaagaagac cgaagtacaa 9000

accggcggtt ttagcaaaga gagcattctg ccaaaacgta actccgacaa actgatcgcg 9060

cgcaagaaag actgggatcc gaaaaaatac ggtggtttcg attctccaac cgttgcttat 9120

tccgttctgg tggtagccaa agttgagaaa ggtaaaagca aaaaactgaa atccgtaaag 9180

gaactgctgg gtattactat catggagcgt agctccttcg aaaaaaaccc gatcgatttt 9240

ctggaagcga aaggctataa agaagtcaaa aaggacctga tcatcaaact gccaaaatac 9300

agcctgttcg agctggaaaa cggccgtaaa cgtatgctgg catctgcggg cgaactgcag 9360

aaaggcaacg agctggctct gccgtccaaa tacgtgaact ttctgtacct ggcctctcac 9420

tacgaaaaac tgaaaggttc cccggaagac aacgaacaga aacagctgtt cgtagagcag 9480

cacaaacact acctggacga gatcatcgaa cagatttctg aattttctaa acgtgtgatt 9540

ctggctgatg cgaatctgga taaagttctg tctgcctata acaagcatcg tgacaaaccg 9600

atccgcgaac aggctgagaa catcatccac ctgttcactc tgactaacct gggcgcgcca 9660

gcggctttca agtactttga taccaccatt gaccgcaagc gttacacctc cactaaagaa 9720

gtgctggacg cgactctgat ccaccagtcc atcaccggtc tgtacgagac ccgtatcgat 9780

ctgagccagc tgggcggtga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 9840

aagaaaaagt gacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata 9900

actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg 9960

aactatatcc ggat 9974

<210> 2

<211> 1547

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr

1 5 10 15

Pro Val Thr Lys Ala Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp

20 25 30

Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp

35 40 45

Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu

50 55 60

Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu

65 70 75 80

Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly

85 90 95

Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys

100 105 110

Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn

115 120 125

Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His Asp

130 135 140

Asp Asp Asp Lys Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly

145 150 155 160

Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr

165 170 175

Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser

180 185 190

Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys

195 200 205

Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala

210 215 220

Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn

225 230 235 240

Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val

245 250 255

Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu

260 265 270

Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu

275 280 285

Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys

290 295 300

Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala

305 310 315 320

Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp

325 330 335

Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val

340 345 350

Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly

355 360 365

Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg

370 375 380

Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu

385 390 395 400

Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys

405 410 415

Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp

420 425 430

Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln

435 440 445

Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu

450 455 460

Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu

465 470 475 480

Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr

485 490 495

Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu

500 505 510

Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly

515 520 525

Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu

530 535 540

Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp

545 550 555 560

Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln

565 570 575

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