原代培养

摘要： 背景:近年来原代神经元细胞模型在颅脑疾病中扮演着重要的角色,此类细胞模型特性更加贴近于疾病细胞,可用于模拟研究各类神经系统疾病。目的:建立一种便捷实用的可同时提取皮质及海马原代神经元的培养方法。方法:取新生24 h内的SD大鼠,麻醉后断脊法处死,采用体积分数为75%乙醇消毒,用镊子分离出颅骨及脑膜,解剖出完整大脑,剥离脑血管膜,游离出大脑皮质及海马组织,采用木瓜蛋白酶及适量DNA酶顺序消化方案,吹打、离心、过滤,然后接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板和爬片内,以含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基为种植液,6 h后换用含有B27的Neurobasal无血清专用培养基,持续培养7 d后,显微镜下观察细胞形态及生长状态。分别采用β-Tubulin免疫荧光法、Neun抗体免疫组化法鉴定皮质神经元与海马神经元,以及采用MAP2免疫荧光法鉴定其纯度。结果与结论:①接种24 h后细胞体积变清晰,呈不规则圆形、周围环绕光晕,少数细胞已有细小突起,均已贴壁生长;持续培养3 d后,胞体逐步增大,部分呈聚团性生长,突触延长,细胞间出现交联;持续培养7 d后,胞体成熟饱满,细胞质显著增多,光晕增强,形成更为密集的神经元网络;②经Neun抗体免疫组化法、β-Tubulin免疫荧光法鉴定为神经元,神经元标志物MAP2免疫荧光法鉴定皮质神经元和海马神经元纯度分别为(94.00±0.34)%和(91.00±0.26)%,可用于后期实验;③结果表明,采用同一批24 h内新生SD大鼠分离大脑皮质和海马组织,经木瓜蛋白酶与DNA酶顺序消化后,可提取到优质的海马神经元及皮质神经元。该方案得到的神经元纯度高,操作简化,可作为研究各类神经系统疾病细胞模型的基础。

摘要： 背景:目前获取原代皮质神经元和星形胶质细胞的方法很多,传统方法通常是分别获取这两种细胞,但实验方法过于繁琐且浪费实验材料。找到一种简单、经济、可行并同时提取这两种细胞的培养方法尤为重要。目的:观察同时提取培养SD乳鼠大脑皮质神经元及星形胶质细胞的效果及注意事项。方法:选用出生24 h内的SD乳鼠,用体积分数为75%乙醇浸泡消毒,待乳鼠昏迷后断脊处死,沿乳鼠颈部用剪刀离断头颅并放入装有高糖DMEM的小烧杯中,沿矢状缝打开头颅并取出大脑放入盛有高糖DMEM的培养皿中。在冰上剥出脑膜及血管,夹取皮质表面2.0-3.0 mm的脑组织,通过木瓜酶和DNA酶进行消化20 min,用含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化。以细胞浓度为1.0×10^(9) L^(-1)种植于含有爬片(用多聚赖氨酸处理)的6孔板中,分别于1,3,5,7 d通过倒置荧光显微镜下观察神经元的形态变化,使用Calcien-AM进行活细胞染色观察细胞活性,β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色对神经元进行鉴定。将剩余大脑皮质进行星形胶质细胞的提取,经过胰酶消化、过滤、吹打,以适宜的浓度接种于培养瓶中,待细胞融合度达到90%时,进行恒温水平摇床振荡24 h以纯化星形胶质细胞。当细胞传代纯化后以1.0×10^(9) L^(-1)接种于6孔板中培养,GFAP免疫荧光染色对星形胶质细胞进行鉴定。结果与结论:①培养1 d后可见神经元贴壁生长,胞体增大,部分聚集生长,细胞间有少量的突触连接;培养3,5 d后胞体进一步增大,突触增粗伸长相互连接;培养7 d后神经元明显聚集,突触增长增粗,相互连接形成致密的细胞网。Calcien-AM活细胞染色可见神经元活性较好,经β-Tubulin、MAP2免疫荧光鉴定细胞纯度大于90%。②培养3 d后星形胶质细胞胞体增大,呈现梭状、不规则状,细胞间出现少量相互连接,细胞间存在较多小胶质细胞;培养5 d后胞体、突起进一步增大;培养7 d发现细胞间的小胶质细胞及其他杂质明显减少,背景较为干净。经GFAP免疫荧光鉴定细胞纯度大于95%。③此方法获得的皮质神经元和星形胶质细胞形态好、杂质少、纯度高,可满足神经科学研究对高纯度的皮质神经元及星形胶质细胞的需求。

摘要： 背景:培养神经元的质量是研究中枢神经系统疾病的关键所在,但培养方法一直没有统一的标准。目的:探究取材部位及阿糖胞苷处理对原代培养神经元活性、纯度及成熟度的影响。方法:选取新生24 h内的SD乳鼠,取大脑皮质表面2.0-3.0 mm处细胞,培养后24,48,72 h,用5μmol/L或10μmol/L阿糖胞苷处理48 h;另取全部大脑皮质细胞,培养后48 h用5μmol/L阿糖胞苷处理48 h。培养至第7天,倒置显微镜下观察细胞形态,采用CCK-8法检测阿糖胞苷对神经元活性的影响,免疫荧光和Western blot检测神经元的纯度及成熟度。结果与结论:①倒置显微镜:10μmol/L阿糖胞苷24,48,72 h组神经元密度分别低于同时间下的5μmol/L阿糖胞苷组,该6组神经元突起相互之间均可连接成紧密的网状结构,神经元胞体丰满并充满折光特性;全皮质组细胞密度低于正常对照组,并可明显观察到非神经元;②CCK-8检测:各阿糖胞苷组细胞活性均低于正常对照组(P<0.001),10μmol/L阿糖胞苷24,48,72 h组神经元活性低于同时间下的5μmol/L阿糖胞苷组(P<0.05),5μmol/L阿糖胞苷24 h组神经元活性低于5μmol/L阿糖胞苷48,72 h组(P<0.01);③免疫荧光染色:各阿糖胞苷组神经元纯度大于正常对照组、全部皮质组(P<0.001),各阿糖胞苷组神经元纯度无差异;④Western blot检测神经元特异性烯醇化酶蛋白表达:各阿糖胞苷组神经元成熟度高于正常对照组(P<0.05),其中以5μmol/L阿糖胞苷48 h组成熟度最高;⑤结果表明:取新生24 h内大鼠大脑皮质表面2.0-3.0 mm处皮质,培养后48 h加入5μmol/L阿糖胞苷处理得到的神经元活性、成熟度和纯度较好。

摘要： 目的 建立并比较新生SD大鼠心肌细胞的原代培养方法.方法 采用胰酶法和胰酶+Ⅱ型胶原酶法分别消化心肌组织,两次90 min差速贴壁纯化心肌细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别采用台盼蓝和免疫荧光染色评估心肌细胞的存活率和纯度.结果 与胰酶法相比,胰酶+Ⅱ型胶原酶法可以获得形态良好且结构完整的心肌细胞;胰酶+Ⅱ型胶原酶法分离心肌细胞的获得率[(1.21±0.03)×106 vs(0.65±0.02)×106,P<0.01]和心肌细胞存活率[(93.37±0.40)％vs(86.40±0.36)％,P<0.01]明显高于胰酶法;两种方法获得的心肌细胞纯度均达到95％以上,但是胰酶+Ⅱ型胶原酶法获得心肌细胞所耗时间明显多于胰酶法[(14.00±0.40)h vs(4.59±0.10)h,P<0.01].结论 胰酶+Ⅱ型胶原酶法比胰酶法分离心肌细胞耗时长,但胰酶+Ⅱ型胶原酶法分离的心肌细胞获得率高、存活率高、细胞结构完整,是一种简单易行且高效的培养方法.

摘要： 背景:基于3D打印支架材料的耳郭畸形再造是近年来的研究热点,而软骨细胞在支架上能否正常生长是其关键问题.目的:通过探讨兔耳郭软骨细胞的原代培养方法,为软骨细胞与组织工程学结合的应用奠定坚实基础.方法:采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法获取兔耳郭软骨细胞,体外培养并传代.通过不同传代细胞的形态学观察、生长曲线绘制、番红O-固绿染色、甲苯胺蓝染色、维多利亚蓝染色及糖胺多糖表达水平测定,对软骨细胞进行鉴定.结果 与结论:①倒置相差显微镜观察耳郭软骨细胞正常形态为梭形及多角形,传代培养6代以后成明显长梭形,且增殖速度明显减缓甚至停滞;②生长曲线绘制显示软骨细胞第2-5代均能稳定成直线增殖趋势;③番红O-固绿染色显示兔耳郭软骨细胞的细胞核结构和细胞质结构清晰,具有良好的形态学特征;④甲苯胺蓝染色提示软骨基质在培养初期分泌较少,随着细胞融合的增多而逐渐增加;⑤维多利亚蓝染色显示软骨细胞有胶原纤维生成,提示其具有正常功能;⑥糖胺多糖表达水平测定显示软骨细胞有特异性糖胺多糖的分泌;⑦实验成功建立了兔耳郭软骨细胞原代培养的分离和鉴定体系,获得了具有生物活性、可以进一步运用于组织工程学研究的耳郭软骨细胞.

摘要： 背景:脂肪间充质干细胞具有调控内分泌代谢、维持脂肪细胞周围微环境稳态、参与脂肪细胞发育等功能,在脂质代谢和肥胖症发生发展中起着重要作用.目前脂肪间充质干细胞的体外培养主要采用Ⅰ型胶原酶消化法,但其存在消化时间较长、效率低的缺点,故如何选择合适消化酶,以缩短消化时间、提高实验效率,值得关注和探索.目的:建立简单、高效的体外大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法,为临床开展干细胞治疗和基因治疗提供重要的细胞载体.方法:无菌条件下取出大鼠双侧腹股沟和附睾处的脂肪垫组织,用虹膜剪剪碎成糊状,加入2 mL 0.1％ Ⅱ型胶原酶消化45 min,洗涤离心后接种于含体积分数为10％胎牛血清的低糖型DMEM完全培养基中,置于CO2培养箱内进行原代培养.待细胞达80％-90％融合时,以1:3的比例进行传代培养.倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并对第4代目的细胞进行细胞表面标志物特异CD分子检测及成脂、成骨诱导分化实验.结果 与结论:①原代培养3 d后,少量短梭形细胞爬出;5 d后,细胞呈集落或团簇样生长,形态为长梭形;6-8 d时,细胞集落相互融合,密度达80％-90％,呈漩涡状排列;传至第3代时,细胞增殖迅速,接种48 h后即可再次传代,且细胞形态均一,呈现明显的鱼群样生长;②流式细胞仪检测结果显示CD90、CD73和CD29表达阳性,CD34、CD45和CD11b/c呈阴性表达;③第4代脂肪间充质干细胞成脂诱导7-10 d后,细胞形态逐渐由长梭形变为多边形或圆形,胞浆内积聚了大小不等的脂肪滴,经油红O染色后脂肪滴呈鲜艳深红色;而成骨诱导21 d后,细胞逐渐由长梭形变为多边形,呈聚集样生长,表面有大小不等的黑色小颗粒,局部有矿化样的结晶物;经茜素红染色后可见散在分布、大小不等的"蘑菇样"深红色球形结节;④由结果可见,该实验成功建立了一种简单、高效的大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法.

摘要： 旨在从奶牛乳腺组织中分离原代乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)并传代培养后探究其生物学特性。本研究从屠宰场采集健康泌乳奶牛乳腺并采用改进的酶消化法从乳腺中分离得到原代奶牛乳腺上皮细胞,通过形态学观察、免疫荧光以及染色体核型分析的方法对其进行鉴定。同时,研究第3、第6和第9代乳腺上皮细胞的生长曲线、群体倍增时间和冻存复苏活力,检测不同代次细胞分泌乳蛋白、乳脂、乳糖的功能及泌乳相关基因的表达。结果表明,所分离的奶牛乳腺上皮细胞纯度较好,细胞生长呈现S型,3个代次细胞的群体倍增时间依次为34.87、41.45和65.04 h,冻存复苏活力为88%~93%;在细胞分泌功能方面,诱导培养2 d后均能检测到酪蛋白、甘油三酯和乳糖,且各代次间无显著差异;此外,3个代次的细胞诱导后均能表达乳成分合成相关基因。本研究成功培养了原代奶牛乳腺上皮细胞,并证明直到第9代细胞仍然具有正常的生物学功能,为体外探究乳腺细胞增殖与分化机制提供了良好的试验材料和技术支撑。

摘要： 目的从大鼠泪腺组织分离泪腺上皮细胞并鉴定。方法采用胶原酶Ⅰ、透明质酸酶和DNA酶混合消化法分离细胞,并对泪腺上皮细胞进行纯化和鉴定。采用胶原预包被培养瓶,并在培养基中添加霍乱毒素(cholera toxin,CT)维持上皮细胞形态。采用细胞免疫荧光染色方法对培养的泪腺细胞主要标志物进行鉴定,包括上皮细胞标志物细胞角蛋白(cytokeratin,CK)和E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-Cad),间充质细胞标志蛋白波形蛋白(vimentin,Vim),肌上皮细胞标志蛋白α-SMA和S100蛋白。结果原代培养的泪腺上皮细胞在3天内贴附到瓶底上,并增殖形成汇合的单层细胞。泪腺上皮细胞表现出鹅卵石形态,并混有少量梭形细胞。分离培养的细胞高表达CK和E-Cad,弱表达α-SMA和S100蛋白,基本不表达Vim。结论本研究成功建立了大鼠泪腺上皮细胞的原代培养方法,为泪腺疾病尤其是干眼病和干燥综合征的研究提供了一种稳定经济的体外模型。

摘要： 目的建立一种简便、高效可同时得到小鼠脊髓源的原代星形胶质细胞与小胶质细胞的分离、纯化、培养方法。方法显微镜下剥离胎鼠脊髓,剪碎后经机械吹打、自然沉降制成细胞悬液,接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养得到混合胶质细胞;当细胞汇合度>90%时,采用恒温定轨摇床振荡结合传代除杂的方法获得星形胶质细胞与小胶质细胞;采用光学显微镜观察纯化前后的细胞形态,采用免疫荧光法检测细胞标志物GFAP(星形胶质细胞)、CD11b(小胶质细胞)并鉴定其纯度。结果本方法通过一次操作,同时获得了2种脊髓源的胶质细胞,得到的星形胶质细胞形态正常,活力好,可在1~2 d铺满培养瓶底,细胞阳性率>97%;得到的小胶质细胞呈多分枝状,细胞间相互交织成网状,细胞阳性率>97%;采用免疫荧光法鉴定P1星形胶质细胞和P0小胶质细胞均可见绿色荧光的阳性细胞、细胞核为蓝色荧光。结论采用可在较恒温定轨摇床振荡结合传代除杂的方法短时间(6~9 d)内同时获得2种高纯度的胶质细胞。

摘要： 目的建立一种稳定、高效的无血清胎鼠海马神经元原代培养方法,以此来获得纯度更高、活力更好的海马神经元。方法取孕(18±1)d SD大鼠胎鼠海马组织,经消化吹打制成细胞悬液,种植于Neurobasal或DMEM/F12培养基后分为:无血清培养组、胎牛血清培养组、胎牛血清+5-氟-2′脱氧尿苷培养组。3组细胞培养12 h后均全量换液为Neurobasal培养基,FUDR培养组神经元培养至d 3时加入FUDR抑制胶质细胞生长。观察3组海马神经元在不同培养时间点下的生长状态;检测神经元活力、细胞凋亡率以及鉴定海马神经元纯度。结果与胎牛血清培养组相比,无血清培养组培养出来的神经元活力更高,细胞凋亡率低,神经元纯度更高;然而加入FUDR使神经元活力降低,细胞凋亡率增加。结论无血清的培养方法培养出来的神经元活性好,纯度高,且不需要加入胶质细胞抑制剂,是一种可行性较强、较为优化的海马神经元原代培养方法。

摘要： 本试验旨在研究皮质醇对斜带石斑鱼原代培养肝细胞糖代谢的影响.以斜带石斑鱼原代培养肝细胞为模型,选取2个孵育时间(24和36h)和3个皮质醇浓度[0(对照)、100和1000nmol/L],测定培养上清液中葡萄糖含量(即肝细胞葡萄糖释放量),肝细胞糖原和丙酮酸含量以及肝细胞糖代谢关键酶的活性.结果表明:在孵育24和36h时,与对照组相比,100和1000nmol/L皮质醇组肝细胞葡萄糖释放量显著提高(P＜0.05),而肝细胞丙酮酸含量显著降低(P＜0.05);皮质醇孵育时间对肝细胞葡萄糖释放量、丙酮酸含量均无显著影响(P＞0.05).在孵育24h时,皮质醇浓度对肝细胞糖原含量无显著影响(P＞0.05),而在孵育36h时,肝细胞糖原含量则随着皮质醇浓度的升高而显著降低(P＜0.05);随着皮质醇孵育时间的延长,肝细胞糖原含量显著下降(P＜0.05).在孵育24和36h时,100和1000nmol/L皮质醇显著提高了肝细胞磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的活性,显著降低了肝细胞苹果酸脱氢酶(MDH)和异柠檬酸脱氢酶(ICD)的活性(P＜0.05),但对肝细胞糖原合成酶(GSase)活性则无显著影响(P＞0.05);在孵育24h时,皮质醇浓度对肝细胞丙酮酸激酶(PK)活性无显著影响(P＞0.05),但在孵育36h时,100和1000nmol/L皮质醇则显著提高了肝细胞PK活性(P＞0.05).随着孵育时间的延长,肝细胞G6Pase活性显著下降,PK活性显著升高,而MDH和ICD活性均无显著变化(P＞0.05).由此可见,皮质醇能够促进斜带石斑鱼原代培养肝细胞糖异生作用,抑制葡萄糖的分解代谢,而对糖原合成无调节作用.

摘要： 探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养、鉴定方法,建立血管内皮细胞体外衰老模型,为研究血管内皮细胞衰老提供细胞模型.于华中科技大学同济医学院附属同济医院产科,经患者知情同意,取正常足月产胎儿脐带一根(长约15 cm)冲净淤血,采用0.1％胶原酶Ⅱ消化.收集细胞并用含有内皮生长因子的完全培养基培养细胞.在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点,同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定.利用连续传代方法构建内皮细胞复制性衰老模型.利用血管紧张素Ⅱ(Ana Ⅱ 2.5umol/l)或过氧化氢(H2O250umol/1)构建内皮细胞应激性衰老模型.应用衰老经典指标半乳糖苷酶染色及western blot检测衰老相关蛋白P53、P21的表达量来检测细胞衰老情况.

摘要： 取18日龄的SPF鸡胚,分别采用组织块培养法、胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和嗜热菌蛋白酶消化法分离和体外培养小肠上皮细胞.结果表明:组织块培养法所获得的上皮细胞纯度较低;胰蛋白酶消化后多为单细胞,细胞贴壁和生长能力较弱;胶原酶Ⅰ单独消化50min或嗜热菌蛋白酶单独消化110min以及胶原酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶联合消化后均可得到大量隐窝细胞团块,经低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,可获得较纯的上皮细胞.分离的细胞接种培养12～24h贴壁,48～72h细胞团中的细胞向四周蔓延,形成一群群的细胞集落,6～7d细胞汇合成片,成"铺路石样",细胞多呈扁平多角状,椭圆状,单层生长,边界清晰,互不重叠.经形态学观察、扫描电镜鉴定、碱性磷酸酶染色和免疫组化鉴定为上皮细胞.

摘要： 目的:系统性探讨微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR,MC-LR)对原代培养的大鼠肝脏细胞的毒作用特征.rn 方法:采用胶原酶灌注法建立原代培养的大鼠肝脏细胞模型,并通过抗大鼠细胞角蛋白(CK18)的特异性抗体来进行免疫荧光染色鉴定细胞纯度.对分离培养得到的原代肝细胞分别给予不同浓度(10-12-10-5mol/L)的MC-LR,在给药后的不同时点采用MTT法观察细胞存活率的情况,流式细胞术分析细胞凋亡发生率、细胞周期、DNA合成速率以及细胞内ROS含量。rn 结果:分离培养所得细胞均为肝实质细胞，细胞纯度为100%。高剂量的MC-LR能引起细胞死亡或凋亡的发生，细胞内ROS水平显著增高;而低剂量的MC-LR则具有促进细胞增殖的效应，DNA合成速率以及S期细胞比例明显增加，细胞内ROS水平在染毒后出现增加趋势，但与对照组相比差异不具有统计学意义。双向毒性效应的分界浓度为10-7-10-8mol/L左右。rn 结论:MC-LR对的原代培养肝脏细胞的毒性效应表现为剂量上的双向性，即高剂量的MC-LR可能通过诱导细胞内ROS升高从而导致细胞凋亡的发生，而低剂量的MC-LR毒性作用则表现为促细胞增殖效应。

摘要： 目的:探讨联合应用胰酶消化+微小组织块法培养及胰酶滤纸片克隆消化法纯化建立人子宫内膜癌细胞系方法的可行性.rn 方法:取3例子宫内膜癌患者的子宫内膜腺癌组织,采用胰酶消化+微小组织块法进行原代培养,并通过胰酶滤纸片克隆消化法提纯腺上皮癌细胞继续培养;在倒置显微镜下观察细胞形态,行HE和免疫荧光染色对细胞进行鉴定,绘制生长曲线.rn 结果:3例患者均1次成功提纯癌细胞,其中1例传代至第5代,1例传代至第3代.1例子宫内膜低分化腺癌细胞体外培养成功,命名为EAG3,并子宫内膜稳定生长传代至20代,细胞生长曲线为"S"形.通过HE染色与原组织病理学比较及免疫荧光细胞法检测角蛋白CK表达阳性,均证实原代细胞为腺上皮恶性肿瘤来源.rn 结论:应用胰酶消化+微小组织块培养能缩短原代细胞贴壁时间,应用胰酶滤纸片克隆消化法可以更快捷完成子宫内膜腺癌细胞纯化建系的过程.

摘要： 目的:近年来，虽然口腔鳞癌的预防及治疗水平稳步提升，但是患者五年生存率没有显著改善，口腔鳞癌淋巴转移是影响远期预后的主要原因。由于淋巴转移机制错综复杂，且目前缺乏有效的口腔鳞癌淋巴转移模型，因此建立口腔癌淋巴转移动物模型是展开此项研究的关键一步。rn 方法:将三种鳞癌细胞系Tca83,Ca127和Hela细胞种植于BalB/c裸鼠舌部右侧缘，待裸鼠右侧淋巴结明显肿大后，无菌操作取出淋巴结，一半用于原代培养，另一半用于病理鉴定。将原代培养出的新细胞系与其母细胞系通过CCK8 ,Transwell Invasion Assay、划痕试验、Real Time PCR,Western Blot、免疫组化、动物试验，在细胞、分子和动物水平上进行增殖、侵袭、迁移、转移相关细胞因子表达量、淋巴结转移率等方面的比较。同时将所得到的口腔鳞癌淋巴转移相关差异基因包括MMP-2 , VEGF-C等，用20例口腔癌伴随淋巴转移的临床标本进行验证。rn 结果:Tca83和Hela细胞均可发生颈淋巴结转移，其中Hela组经原代培养并筛选出一株淋巴高转移细胞系Hela-1。Hela-1细胞与其母细胞相比，其增殖能力、侵袭能力、迁移能力、转移相关细胞因子表达量、颈淋巴结转移率等均有显著提高，颈淋巴结转移率由LO%提升至30%。在20例口腔鳞癌原发灶与转移灶的临床标本中，MMP-2和VEGF-C表达模式与Hela和Hela-1细胞一致。rn 结论:Hela和Hela-1细胞系可用于研究口腔区域鳞癌淋巴转移机制。

摘要： 目的：为了明确小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)自我更新能力及其分化能力,观察其增殖、凋亡,倍增能力及向成骨细胞和脂肪细胞分化能力等,我们需要寻求适宜有效的小鼠BM-MSCs体外培养方法.方法：我们利用全骨髓贴壁培养法分离培养2周龄的WT小鼠来源的BM-MSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征.鉴定实验,一组用成骨细胞诱导剂诱导小鼠BMSCs向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶(ALP)染色和总克隆染色观察钙化结节.另一组加入成脂细胞诱导剂培养细胞,通过油红O染色观察脂肪细胞.结果：小鼠BM-MSCs形态呈梭形,可传代10代左右,具有增殖及多项分化能力,成骨及成脂实验均为阳性.

摘要： 目的：为了明确小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)自我更新能力及其分化能力,观察其增殖、凋亡,倍增能力及向成骨细胞和脂肪细胞分化能力等,我们需要寻求适宜有效的小鼠BM-MSCs体外培养方法.方法：我们利用全骨髓贴壁培养法分离培养2周龄的WT小鼠来源的BM-MSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征.鉴定实验,一组用成骨细胞诱导剂诱导小鼠BMSCs向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶(ALP)染色和总克隆染色观察钙化结节.另一组加入成脂细胞诱导剂培养细胞,通过油红O染色观察脂肪细胞.结果：小鼠BM-MSCs形态呈梭形,可传代10代左右,具有增殖及多项分化能力,成骨及成脂实验均为阳性.

摘要： 目的：为了明确小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)自我更新能力及其分化能力,观察其增殖、凋亡,倍增能力及向成骨细胞和脂肪细胞分化能力等,我们需要寻求适宜有效的小鼠BM-MSCs体外培养方法.方法：我们利用全骨髓贴壁培养法分离培养2周龄的WT小鼠来源的BM-MSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征.鉴定实验,一组用成骨细胞诱导剂诱导小鼠BMSCs向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶(ALP)染色和总克隆染色观察钙化结节.另一组加入成脂细胞诱导剂培养细胞,通过油红O染色观察脂肪细胞.结果：小鼠BM-MSCs形态呈梭形,可传代10代左右,具有增殖及多项分化能力,成骨及成脂实验均为阳性.

摘要： 目的：为了明确小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)自我更新能力及其分化能力,观察其增殖、凋亡,倍增能力及向成骨细胞和脂肪细胞分化能力等,我们需要寻求适宜有效的小鼠BM-MSCs体外培养方法.方法：我们利用全骨髓贴壁培养法分离培养2周龄的WT小鼠来源的BM-MSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征.鉴定实验,一组用成骨细胞诱导剂诱导小鼠BMSCs向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶(ALP)染色和总克隆染色观察钙化结节.另一组加入成脂细胞诱导剂培养细胞,通过油红O染色观察脂肪细胞.结果：小鼠BM-MSCs形态呈梭形,可传代10代左右,具有增殖及多项分化能力,成骨及成脂实验均为阳性.

摘要： 本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法。该原代培养基包括氨甲环酸、G‑CSF、EGF和基础培养基；脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：氨甲环酸：500～15000mg/L；G‑CSF：10～50ng/L；EGF：5～30ng/mL；基础培养基：补足。本发明将氨甲环酸、G‑CSF、EGF添加入基础培养基，能缩短原代培养时间，效果好于常规培养基及添加单一因子的培养基；同时可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。

摘要： 本发明公开了一种用于原代培养肿瘤浸润性肥大细胞的培养基及培养方法，该培养基包括以下组分：0.05‑1v％PVA、0.5‑2v％ITSX、80‑120U/mL penicillin、0.05‑1mg/mL streptomycin、50‑60μM/L 2‑mercaptoethanol、80‑120ng/mL SCF、80‑120ng/mL IL‑6，余量为IMDM培养基。培养方法包括以下步骤：S1.清洗新鲜肿瘤组织，然后切成2‑4mm3的小块；S2.将S1所得组织块制为单细胞悬液，然后加入CD117+免疫磁珠孵育，洗涤细胞，离心并重悬，通过免疫磁珠分选系统分选出肥大细胞；S3.将S2所得肥大细胞重悬于该用于原代培养肿瘤浸润性肥大细胞的培养基中，然后转移至孔板，于37°C，5％CO2培养箱进行培养，每周进行2‑3次半量换液，即可。采用本发明方法扩增肥大细胞的效率显著提高，同时成本显著降低。

摘要： 本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法。该原代培养基包括氨甲环酸、G‑CSF、EGF和基础培养基；脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：氨甲环酸：500～15000mg/L；G‑CSF：10～50ng/L；EGF：5～30ng/mL；基础培养基：补足。本发明将氨甲环酸、G‑CSF、EGF添加入基础培养基，能缩短原代培养时间，效果好于常规培养基及添加单一因子的培养基；同时可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。

摘要： 本发明公开了一种猪卵巢GV期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法，所述方法包括采集无囊肿的健康的猪的卵巢，清洗卵巢；分离颗粒细胞；接着将颗粒细胞进行原代培养48h；原代培养的培养瓶换液；换液后继续培养36h，对培养后的细胞进行清洗、消化、终止；最后分装进行传代培养48h即可。本发明提供了一种无污染采集卵巢的方法，优化了颗粒细胞的获取及培养方法，还提供了原代颗粒细胞传代培养方法。使用本发明的方法获得的颗粒细胞几乎无污染，细胞均匀度高，所处的生长发育时期一致性高，细胞成活率高，制作氧化应激等模型成功率高，结果一致性高，实用性强，稳定性强，可行性高。此外，获得的细胞数量多，后续可供开展的实验多，减少去屠宰场的次数，效率高。

摘要： 一种牙髓干细胞原代培养促贴壁基质及原代牙髓干细胞的培养方法，本发明提供了一种可促进细胞贴壁生长的材料，用其包被培养皿的培养方式，为牙髓干细胞原代制备建立成熟的体外培养体系并且为后续实验研究提供优质及丰富的细胞来源，本发明在牙髓干细胞原代培养时，使用多酚蛋白作为促贴壁试剂预包被培养皿，增加了组织块细胞爬出率及原代细胞的数量，缩短了原代制备时间，提升了原代培养的成功率。

摘要： 本发明公开了一种用于原代培养肿瘤浸润性肥大细胞的培养基及培养方法，该培养基包括以下组分：0.05‑1v％PVA、0.5‑2v％ITSX、80‑120U/mL penicillin、0.05‑1mg/mL streptomycin、50‑60μM/L 2‑mercaptoethanol、80‑120ng/mL SCF、80‑120ng/mL IL‑6，余量为IMDM培养基。培养方法包括以下步骤：S1.清洗新鲜肿瘤组织，然后切成2‑4mm3的小块；S2.将S1所得组织块制为单细胞悬液，然后加入CD117+免疫磁珠孵育，洗涤细胞，离心并重悬，通过免疫磁珠分选系统分选出肥大细胞；S3.将S2所得肥大细胞重悬于该用于原代培养肿瘤浸润性肥大细胞的培养基中，然后转移至孔板，于37°C，5％CO2培养箱进行培养，每周进行2‑3次半量换液，即可。采用本发明方法扩增肥大细胞的效率显著提高，同时成本显著降低。

摘要： 本发明提出了一种用于癌细胞原代培养的添加剂及其培养基和用途，属于医疗技术领域。所述用于癌细胞原代培养的添加剂，其特征在于，包括霍乱毒素、R‑spondin、A‑83‑01和Y‑27632中的至少三种。用于癌细胞原代培养的培养基包括完全DMEM培养基和F12营养混合物；所述F12营养混合物包括霍乱毒素、R‑spondin、A‑83‑01和Y‑27632中的至少三种。本发明通过优化筛选培养方法和培养基配方，研制出了一种不依赖于滋养层细胞的培养体系，成功率高，从而大大降低了培养基的大规模制备难度，同时也更易于建立稳定的质量控制体系，从而实现商业化。

摘要： 本发明公开了一种原代间充质干细胞的提取、培养和传代培养方法，其中主要包括：在原代培养时，延长首次换液的时间到72h，采用完全换液方法，之后每2～3天完全换液一次，保证原代大鼠骨髓间充质干细胞的营养支持；培养至第7～10天镜下可见大量的集落形成，根据集落细胞的长势来决定首次传代的时间，不必等到细胞融合度达到80～90％再传代；在原代间充质干细胞传代培养的过程中，降低胰酶消化液的浓度，减少胰酶消化液用量，缩短胰酶消化接触时间。本发明在保证原代细胞分离培养纯度的条件下，简化了原代细胞分离培养方法，缩短了原代培养时间，通过调整胰酶消化浓度、用量、时间，最大程度地保留了细胞生长活力。

摘要： 本实用新型公开了一种用于细胞原代培养的培养瓶，涉及细胞培养瓶技术领域，培养瓶组件的顶部设置有瓶盖组件，从进液管加入培养液，挡板上有排液孔，可以使加入的培养液缓慢的通过挡板上的排液孔过渡到整个培养瓶，挡板减少了培养液加入时产生的冲击，从而保护了贴壁的组织块，瓶盖组件具有良好的密封效果，保证了细胞培养瓶内无菌环境，进而能够调节细胞培养瓶与外界进行气体交换空间的大小和速度，从而满足不同生产阶段细胞对气体的需求，第一透气孔和第二透气孔重合时，可以将细胞培养瓶内积累的气体快速排出，并进行换气，盖帽的顶部设有疏水透气膜，利于通气且保证气体交换过程无菌，显著提高细胞培养质量。

摘要： 本实用新型公开了一种组织块贴壁培养法用引流型原代培养皿，包括培养皿体、第一固定板和第二固定板，所述培养皿体的底部内壁中部固定连接有含蓄液池和引流槽的引流体，所述第一固定板的一侧开设有第一安装槽，所述第一安装槽的一侧内壁滑动连接有横板，本实用新型结构简单，通过转动手轮调节加液漏斗的高度，可以适配多种尺寸的培养皿体，适用范围广，防滑垫和支撑底座的设置保证了装置不会轻易移动，利用加液漏斗加液至培养皿的引流体后，顺引流槽流下，实现添加培养液的操作，避免了人工手抖将培养液直接滴在培养皿体的内部，对贴壁不稳的组织造成冲击，减轻了工人的工作量，增加了原代细胞的爬出率，使用方便。